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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 5: 49 - 57

DOI: https://doi.org/10.11978/2023174

Marine Biology

Comparative study on the cell morphological transformation and transcriptome of Phaeocystis globosa Scherffel

  • WANG Xiyan ,
  • XUE Yue ,
  • MENG Bufan ,
  • FU Feng ,
  • SHEN Pingping
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  • Ocean School, Yantai University, Yantai 264005, China
SHEN Pingping. email:

Received date: 2023-11-24

  Revised date: 2023-12-27

  Online published: 2024-01-08

Supported by

National Natural Science Foundation of China(41976114)

National Natural Science Foundation of China(42376159)

Open Project of the National Key Laboratory for Environmental Protection of Coastal Ecological Environment(202311)

Fold

Abstract

Phaeocystis globosa is an important and cosmopolitan harmful alga in coastal area. This study conducted a comparative analysis on the cell morphological characteristics and transcriptome of P. globosa isolated from the Beibu Gulf of Guangxi Province. The results indicate that P. globosa contains two types of cells: motile flagellated cells and non-motile cells without flagella. The cell size is 2-5 μm and the non-motile cells are capable of forming colonies, with diameters ranging from few micrometers to several hundred micrometers. Transcriptome analysis reveals that colonial cells exhibit more genes with upregulated expression than solitary cells and most of the differentially expressed genes are associated with transport, decomposition metabolism, amino acids, lipids, carbohydrates, and other metabolic pathways. Particularly, the gene encoding UDP-glucose-4-epimerase, which is involved in polysaccharide biosynthesis, shows significantly upregulated expression, indicating extensive synthesis of glycosaminoglycans during the formation of colony. These results provide basic information for further understanding the morphological transformation mechanism of P. globosa in different geographical strains.

Key words： Phaeocystis globosa; solitary cells; colony; transcriptome

Cite this article

WANG Xiyan , XUE Yue , MENG Bufan , FU Feng , SHEN Pingping . Comparative study on the cell morphological transformation and transcriptome of Phaeocystis globosa Scherffel[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(5) : 49 -57 . DOI: 10.11978/2023174

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)隶属于定鞭藻门、定鞭藻纲, 具有广温广盐性特点, 广泛分布在世界各大海洋(Rousseau et al, 2007)。由于能够生产二甲基硫和二甲基丙磺酸, 在全球碳、硫元素循环及气候变化中起重要作用(Baumann et al, 1994)。球形棕囊藻最突出的特征是具有复杂异型生活史, 具有单细胞和胶质囊体两种形态, 能在短时间内爆发性增殖形成赤潮(沈萍萍 等, 2018), 或产生溶血性毒素(刘洁生 等, 2007), 引起鱼类大量死亡, 对海洋生态系统及渔业影响巨大(Shen et al, 2004)。1997年10月底, 我国东南沿海首次发生了球形棕囊藻特大规模的赤潮, 此后, 广东、福建、海南等海域陆续暴发此种赤潮(徐轶肖 等, 2020; 沈萍萍 等, 2021), 2004年渤海海域也首次出现了球形棕囊藻赤潮(曲凌云 等, 2008)。近年来广西北部湾及珠江口等地频繁发生的棕囊藻赤潮, 巨大的囊体不仅给渔业养殖和生态系统的结构功能造成极大危害(刘悦 等, 2022), 更重要的是大量囊体对核电站冷源取水系统造成堵塞, 严重影响核电运行安全(曹西华 等, 2017), 受到社会高度关注。
球形棕囊藻生活史复杂, 游离单细胞和胶质囊体具有不同的生态策略, 如具鞭毛单细胞具有快速运动和适应营养限制条件等能力, 而囊体内细胞具有快速生长并抵抗浮游动物捕食和病毒入侵等优势(沈萍萍 等, 2000)。当环境中出现不利于单细胞的影响因子时, 囊体可能会加速形成以适应环境(晏荣军 等, 2006)。囊体形成是球形棕囊藻显著的塑性表型特征之一, 囊体的形成和扩大是降低浮游动物对其单细胞捕食风险的防御策略(Wang et al, 2015)。当不动单细胞开始分裂成集群时, 细胞会分泌黏质多糖, 既可以形成囊体基质又可以作为磷脂储存器, 吸收高强度的紫外线B (ultraviolet radiation b, UVB)辐射(杨和福, 2004), 因此棕囊藻可以分布在从赤道到两极的海洋中。
有关球形棕囊藻形态特征研究已有较多进展, 如Guiselin等(2009)、胡章喜等(2019)通过电镜观察到具鞭毛单细胞形状、大小以及鞭毛长度, 细胞表面圆形或椭圆形鳞片等。近年来, 许多学者在分子水平上对球形棕囊藻进行了研究, 但大部分侧重种属鉴定、遗传多样性分析等研究(曲凌云 等, 2008; 覃仙玲 等, 2016; 胡晓坤 等, 2019; Song et al, 2020; Zhu et al, 2023), 对于生活史形态转变的研究相对较少。转录组技术能够研究基因功能及结构, 深入特定生物学过程的分子机理, 为探讨球形棕囊藻生活史转变机制提供了技术支撑。因此, 本文对球形棕囊藻北部湾株不同细胞形态进行观察, 并通过转录组学的方法探究了不同形态细胞基因表达差异, 为深入探讨球形棕囊藻生活史转变与赤潮暴发机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 藻种选取

所用球形棕囊藻分离自2017年2月广西北部湾赤潮发生期间, 经显微镜分析及28S rRNA基因D1~D2区测序鉴定为球形棕囊藻, rRNA基因序列已经上传至NCBI数据库(序列号OQ674720)。将藻株接入f/2无菌培养基中, 置于20℃、光照6000Lx、光暗比12h:12h的条件下进行培养, 并加入青霉素、链霉素和卡那霉素除去细菌影响(厦门大学, 2012; Zhang et al, 2020)。将对数生长期藻液先经孔径10μm的滤膜滤掉囊体, 后接种至新鲜培养液中使初始密度达到1.2×104cell·mL-1, 在光照培养箱中进行培养, 设置3个生物学重复, 每天进行2~3次摇匀处理, 避免藻细胞沉淀。

1.2 藻细胞密度测定

利用浮游生物计数板, 在光学显微镜下计数单细胞和囊体个数, 每个样品计数3个平行样取平均值, 并在第2d、4d、6d随机选择20~30个囊体进行直径测量和囊体细胞计数, 然后按比例换算藻细胞总密度值, 采用Origin软件对藻细胞密度、囊体密度、囊体直径与内部细胞的关系进行统计分析。

1.3 光学显微镜观察

取不同生长时期藻细胞在显微镜下进行观察, 同时使用显微数码相机和EZ-MET软件配合对单细胞及囊体拍照, 并测量其大小。

1.4 扫描电镜观察

取培养液约10mL, 先用孔径5.0μm的PC滤膜初步过滤, 然后取过滤后培养液4.5mL加入0.5mL戊二醛(终浓度为2.5%), 避光环境下固定4h。固定后样品充分混匀, 将藻体过滤到孔径2μm滤膜上, 用新鲜培养基冲洗3次; 后用梯度乙醇溶液进行脱水处理, 浓度梯度为10%、20%、30%、50%、70%、90%、100% (其中100%浓度脱水3次), 每种浓度脱水时间约15min; 将脱水后样品放入无水乙醇培养皿中干燥12h; 用SDT-20CE喷镀器进行喷金处理, 最后利用扫描电子显微镜JSM-7610F (JEOL)进行细胞形态观察及测量。

1.5 转录组样品分析

取稳定生长期藻液300mL, 先用孔径5.0μm滤膜过滤收集囊体细胞, 然后再用孔径2.0μm滤膜收集滤液中单细胞, 将单细胞与囊体样品立刻放入液氮速冻, 后保存于-80℃冰箱, 最后送至上海美吉生物公司进行转录组测序分析。

2 结果

2.1 球形棕囊藻的生长状况

2.1.1 藻细胞密度变化

在适宜温度条件下(20℃), 球形棕囊藻具有单细胞和囊体2种形态。在前6d, 单细胞和囊体密度均呈持续增长趋势, 然后囊体数量开始减少; 但单细胞数量仍在增加, 第8d达到最大密度后开始降低, 可能由于部分囊体破裂, 单细胞被释放到培养液中, 增加了单细胞的数量(图1a, 1b)。对数生长期囊体生长状况如图1c所示, 2d左右开始出现由3~4个细胞组成的小囊体, 直径约7μm, 第4d囊体直径明显增大, 大部分达到20μm以上甚至达到50μm。对囊体直径与内部细胞的数量进行相关性分析, 两者呈显著正相关线性关系(r2=0.843), 即随囊体直径增大内部细胞数量增多(图1d)。
图1 球形棕囊藻的生长状况

a. 单细胞生长曲线; b. 囊体生长曲线; c. 囊体直径与生长天数的关系; d. 囊体细胞数量与其直径的相关性

Fig. 1 Growth status of Phaeocystis globosa.

(a) Growth curve of solitary cells; (b) growth curve of colonies; (c) relationship between colonial diameter and culture time; (d) correlation between the number of colonial cells and diameter

2.1.2 光学显微镜观察结果

球形棕囊藻主要以单细胞和囊体形态存在, 单细胞呈球形或椭球形(图2a, 2b), 直径约2~5μm, 游动单细胞具有1~2条鞭毛, 或弯曲或伸直, 鞭毛长度比细胞直径稍长。对数生长期分裂的藻细胞较多(图2c)。
图2 北部湾株球形棕囊藻的单细胞形态

a. 具有1条鞭毛的单细胞; b. 具有2条鞭毛的单细胞; c. 正在分裂的藻细胞

Fig. 2 Solitary cell morphology of Phaeocystis globosa Beibu Gulf strain.

(a) Solitary cell with single flagellum; (b) solitary cell with two flagella; (c) dividing cell

囊体直径大小从几微米到几百微米不等, 其囊体内部细胞分布较均匀(图3a, 3b)。囊体呈中空近球体结构, 内含数百到数千个单细胞。也有极性囊体存在 (图3c), 或细胞从囊体边缘逸出(图3d), 但逸出的细胞尚未发现有鞭毛。亦有细胞聚集体存在, 细胞具鞭毛且摆动明显并逐渐扩散(图3e), 其细胞两条鞭毛等长(图3f), 长度稍短为3μm左右, 约为细胞直径的1~1.5倍。
图3 北部湾株球形棕囊藻囊体细胞形态

a. 较大的囊体; b. 新生成的小囊体; c. 极性囊体; d. 内部细胞逸出的囊体; e. 细胞聚集体, 无囊体边界; f. 聚集体中具鞭毛细胞

Fig. 3 Colonial cells morphology of Phaeocystis globosa Beibu Gulf strain.

(a) Larger colony; (b) newly formed small colony; (c) polarized colony; (d) colony with internal cells escape; (e) cell aggregate without colonial boundaries; (f) cells with flagella in the aggregate

2.1.3 电镜观察

扫描电镜下具鞭毛细胞近球形, 直径约3μm, 具有两根等长鞭毛以及一根短定鞭, 长鞭毛长5~6μm, 约为细胞体长2倍(图4)。具鞭毛细胞表面无鳞片, 但细胞表面有凸起且不光滑(图4a, 4b)。图4c和4d为不具鞭毛单细胞, 一种具向内凹陷的洞(图4c), 凹陷位置可能是由于鞭毛的脱落或尚未长出鞭毛造成, 推测可能是由游动单细胞向囊体细胞转变的中间状态; 另一种是具有短鞭毛突起的细胞(图4d), 在两根突起中间尚未发现定鞭毛的存在, 该状态的单细胞数量较多。
图4 北部湾株球形棕囊藻单细胞电镜扫描形态

a和b. 具有2根长鞭毛及1根定鞭毛的单细胞; c. 具有凹陷的无鞭毛单细胞; d. 具有2条短鞭毛突起的单细胞

Fig. 4 Solitary cell morphology of Phaeocystis globosa Beibu Gulf strain under scanning electron microscopy.

(a) and (b) Solitary cell with flagella and haptonema; (c) solitary cell with concave shape and no flagella; (d) solitary cell with two short flagella protrusions

2.2 转录组分析结果

2.2.1 数据质控

共完成6个单细胞(W20D)和囊体(W20N)样品的转录组分析, 获得47.89Gb 干净数据(clean data), 各样品clean data均达到6.71Gb以上, Q30碱基百分比在93.87%以上, 平均GC含量为66.76%。使用Trinity对所有样本clean data进行从头组装, 并对组装结果进行优化评估, 共组装得到非冗余基因序列(unigene) 65409个, 平均长度为775.47bp, N50平均长度为1098bp。
其中共有29329个(45.21%)基因注释到NR库, 15570个(24%)基因注释到Swissprot库, 13894个(21.42%)基因注释到KEGG库, 19313个(29.77%)基因注释到eggNOG库, 24055个(37.08%)基因注释到GO库, 25585个(39.44%)基因注释到Pfam库。基于KEGG二级分类信息, 所有被注释的unigenes的功能途径总共分为20类, 其中碳水化合物代谢, 折叠、分类和降解, 翻译, 氨基酸代谢以及转运和分解代谢是最丰富的功能途径。在GO功能注释分类中, 细胞、膜、代谢过程以及催化活性和结合能力是最丰富的功能分布途径, 并且与磷脂生物合成、囊泡运输、核糖核苷酸代谢等相关的基因显著富集。

2.2.2 差异表达基因的富集及功能分析

在20℃条件下, 与单细胞转录组相比, 囊体细胞共有4866个基因发生差异表达(Padjust≤0.05并且|log2FC|≥1), 其中2974个基因表达上调, 1892个基因表达下调(图5)。相较于单细胞而言, 囊体细胞更多的基因表达发生上调, 说明某些生命活动与功能在囊体细胞中得到增强与促进。
图5 球形棕囊藻不同形态细胞差异基因表达量的变化

a. 囊体和单细胞的差异表达基因数量统计图, 筛选条件为Padjust≤0.05并且|log2FC|≥1; b. 囊体和单细胞的差异表达基因的火山图, 显示不同样本间基因表达差异程度。log2FC中的FC即差异倍数(fold change), 表示两样品(组)间表达量的比值, 对其取以2为底的对数之后即为log2FC, 另外用P值的负对数(-Log10(P-value))来表示P值的显著性; 红色表示上调基因, 蓝色表示下调基因

Fig. 5 Changes in differential gene expression levels in different cells of Phaeocystis globosa.

(a) Statistical diagram of the number of differentially expressed genes between colonial cells and solitary cells, with screening conditions of Padjust ≤ 0.05 and | log2FC | ≥ 1; (b) volcano map of differentially expressed genes between colonial and solitary cells, showing the degree of gene expression differences between different samples. The FC in log2FC is fold change, which represents the ratio of expression between two samples (groups), and is log2FC after taking the logarithm with 2 as the base, additionally the negative logarithm of the P-value (-Log10(P-value)) was used to indicate the significance of the P-value; Red indicates upregulation of genes, while blue indicates downregulation of genes

球形棕囊藻囊体细胞和单细胞的差异表达基因大部分与KEGG通路中的运输和分解代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢以及折叠分类和降解等途径相关(图6a)。通过KEGG富集分析后得到显著富集途径如图6b所示, 差异表达基因参与了内质网中蛋白质加工、甘油磷脂代谢、吞噬体、各种类型的N-聚糖生物合成和光合生物碳固定等多种途径, 且大部分基因都表现为上调表达, 结合图6a的差异基因功能注释, 可以看出囊体细胞中参与代谢的差异表达基因最多, 并且细胞过程中的物质运输以及遗传信息的处理都发生了显著变化。
图6 球形棕囊藻囊体细胞和单细胞的差异基因KEGG功能注释和富集通路分析

a. 囊体和单细胞的差异基因功能注释图; b. 囊体和单细胞的差异表达基因KEGG富集通路图(前20)

Fig. 6 Functional annotation and enrichment pathway analysis of the differential gene KEGG between the colonial and solitary cells of Phaeocystis globosa.

(a) Function annotation diagram of differentially expressed genes between the colonial and solitary cells; (b) KEGG enrichment pathway diagram of differentially expressed genes in the colonial and solitary cells (top 20)

尤其值得注意的是, 在氨基糖和核苷酸糖代谢途径中发现编码UDP-葡萄糖醛酸-4-表异构酶(UDP-glucose-4-epimerase)基因, 及与N-聚糖生物合成途径相关的多利基-二磷酸寡糖-糖基转移酶(dolichyl-diphosphooligosaccharicle-glycosyltransferase, STT)基因在囊体细胞中显著上调表达。前者可以介导UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖之间的相互转换, UDP-葡萄糖是UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)的前体物质, 是聚糖合成的关键前体; 后者STT的上调表达说明多萜醇寡糖前体的合成增加, 有利于新形成寡糖以提供能量和碳源, 促进藻类的光合作用速率和代谢活性。

3 讨论

细胞的大小、形状、鞭毛、鳞片以及分泌物等特征是棕囊藻分类的重要依据(沈萍萍 等, 2021)。由于细胞个体微小, 在光镜下很难观察其形态特征, 扫描电镜能够明确其细胞鳞片形状和大小(胡晓燕 等, 2006; 胡章喜 等, 2019)及星形分泌物等特征(Wang et al, 2015), 研究表明鳞片主要存在于具鞭毛的游动单细胞中, 囊体细胞并无此结构。然而在本研究中, 此株球形棕囊藻两类细胞表面均未观察到鳞片结构, 与北部湾其他株系有较大不同(胡章喜 等, 2019)。已有研究证实北部湾海域存在不同基因型的球形棕囊藻, 它们在标记色素谱、囊体大小和遗传信息等方面都存在差异(Zhang et al, 2021; Niu et al, 2022), 说明同一海域球形棕囊藻存在明显的种内差异或遗传多样性。同样, 青岛近海 2021 年冬季发生的球形棕囊藻赤潮高通量测序分析也发现同时存在2种扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASVs)(王一奇 等, 2023); 中国沿海球形棕囊藻遗传多样性研究也显示存在同一物种具有多个ASV的现象, 表明球形棕囊藻具有较高的遗传多样性或潜在隐藏种(薛玥, 2023)。因此同一海域球形棕囊藻株, 也可能表现出不同的表型特征。
另外, 其他研究发现球形棕囊藻单细胞鞭毛脱落到成囊阶段, 动力蛋白、鞭毛内运输蛋白以及微管相关蛋白等与运动相关蛋白的编码基因都显著下调(张昆, 2020)。本试验过程中大部分单细胞不动且不具鞭毛, 相应转录组分析也未发现与鞭毛运动相关基因的显著变化, 表明球形棕囊藻由不动单细胞向囊体细胞的转变过程中其鞭毛或者运动特征及相关基因表达方面未发生较大的变化, 但其他代谢活动如参与氨基糖和核苷酸糖代谢途径的UDP-葡萄糖醛酸-4-表异构酶编码基因以及参与N-聚糖分泌的α-甘露糖苷酶编码基因都发生显著上调表达。
球形棕囊藻囊体厚度介于1~8μm之间(van Rijssel et al, 1997; Hamm et al, 1999), 其基质主要由含有至少8种单糖的多糖物质和蛋白质复合物构成(杨和福, 2004; Gaebler-Schwarz et al, 2010)。原核生物和真核生物中多糖生产途径较保守, 即单糖通过糖基转移酶(Glycosyltransferase)作用转化为核苷酸糖并组装成多糖(Gügi et al, 2015), 棕囊藻单细胞转变形成囊体需要合成大量的多糖以形成囊体基质, 其主要成分是蛋白聚糖和糖胺聚糖(Zhang et al, 2020; Zhu et al, 2023)。糖胺聚糖主要由糖醛酸和糖胺交替出现的双糖单元组成(Vallet et al, 2022), 所有已知的糖胺聚糖主链均由活化的二磷酸尿苷葡糖 Uridine diphosphate glucose (UDP-糖)前体构建, 因此UDP-糖酶基因的表达增强表明糖胺聚糖的合成增加。UDP-葡萄糖醛酸-4-表异构酶可以作用于UDP-半乳糖(UDP-GalA)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)之间的转化, UDP-GlcA是一种糖基转移酶的糖基供体, 用于多种细胞成分的生物合成, 如糖胺聚糖、某些N-和O-连接的聚糖、糖鞘脂等, 是整个进化过程中聚糖合成的关键前体, 是合成胶质多糖所必需的物质(Bar-Peled et al, 2004)。因此, 编码UDP-葡萄糖醛酸-4-表异构酶基因的上调表达有利于糖胺聚糖等前体物质的合成。同样, 研究表明糖链可与新合成的肽链在多利基-二磷酸寡糖-糖基转移酶(Dolichyl-diphosphooligosaccharicle-glycosyltransferase, STT)的作用下结合, 形成蛋白聚糖(Bai et al, 2019), 蛋白聚糖中含有一些N-或O-连接的低聚糖链, 这些低聚糖链不仅分布在细胞外基质中, 也分布在细胞表面, 黏液在分泌以前主要以蛋白聚糖的形式存在(Zhu et al, 2023)。因此本研究中发现编码STT的基因积极表达也反映了蛋白聚糖合成的增加。其他研究也发现葡萄糖焦磷酸化酶(glucose pyrophosphorylase, GalU)在球形棕囊藻囊体形成过程中显著上调表达(Zhang et al, 2020), 催化了尿苷二磷酸-葡萄糖的形成, 为葡萄糖胺的合成提供了前体底物, 并且在整个糖胺聚糖合成过程中多种糖基转移酶如ALG6以及STT显著上调也证实了这一点。
然而, 亦有研究显示球形棕囊藻单细胞的扩增和囊体的形成都需要大量多糖, 参与多糖合成的基因都处于过表达状态(Liang et al, 2021, 2023), 这些研究结果差异反映了球形棕囊藻囊体形成机制的复杂性, 不仅依赖于聚糖合成途径的上调, 同时还受多种因素的调控。如囊体细胞具有较强的光合活性和固碳能力, 可以固定更多的碳来产生能量, 用来分泌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)而不是合成脂肪酸(Fatty acids, FAs)作为储备能源(Liang et al, 2021), 并且囊体形成阶段几丁质的合成和细胞运动都减少, 细胞的能量和物质消耗被重新分配, 可以将更多的能量和资源用于囊体的合成和快速增殖(Zhu et al, 2023)。另外, 参与糖胺聚糖降解途径中多种酶基因包括多种糖苷酶, 如葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶等显著下调(Zhang et al, 2020), 表明糖胺聚糖的降解减少都是有利于囊体形成和增殖的表现。囊体形成是球形棕囊藻最重要的表型特征之一。虽然温度、湍流、营养物质和摄食压力等在单细胞形成囊体过程中起着重要推动作用, 但这些因素环境只与缩短囊体形成时间、增加囊体数量或者增加囊体的体积有关(李杰 等, 2022)。球形棕囊藻不同生活史阶段的发展除了与外在环境因素有关, 内在的基因调控发挥至关重要的作用(Zhang et al, 2020), 这一转变阶段虽然时间较短但发生过程非常复杂, 与观测的时间与阶段均有较大关系, 因此目前相关的研究结果各有侧重, 尚未定论, 还需要进一步的深入研究。

4 结论

球形棕囊藻生活史复杂, 由于其体积微小, 生活史不同阶段转变时间短, 在培养过程中通常很难观察到一个完整连续的生命周期。本文通过光学显微镜和扫描电镜研究了球形棕囊藻北部湾株的2种细胞形态: 具鞭毛的游动单细胞和囊体细胞及二者之间的相互转变, 尤其是囊体破裂内部单细胞生出鞭毛并且迅速游动的过程。结合转录组分析发现, 囊体细胞与单细胞相比有更多的差异基因上调表达, 尤其是多糖合成途径中UDP-葡萄糖醛酸-4-表异构酶(UDP-glucose-4-epimerase)编码基因和多利基-二磷酸寡糖-糖基转移酶(STT)编码基因显著上调表达, 有利于促进聚糖的合成及囊体的形成, 表明多糖合成在棕囊藻生活史转变过程中具有重要作用, 但还需要进一步的深入研究。

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