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热带海洋学报 >

2022 , Vol. 41 >Issue 3: 119 - 134

DOI: https://doi.org/10.11978/2021144

海洋生物学

两种蓝细菌中7对毒素-抗毒素系统的分析和鉴定

  • 林世团 , 1, 2 ,
  • 王晓雪 1, 2 ,
  • 陈冉 , 1
展开
  • 1.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
陈冉。email:

林世团(1995—), 男, 广东省揭阳市人, 硕士, 从事毒素-抗毒素系统的功能研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2021-10-26

  修回日期: 2021-12-01

  网络出版日期: 2021-12-10

基金资助

国家自然科学基金(31625001)

国家自然科学基金(91951203)

收起

Analysis and identification of seven toxin-antitoxin systems in two cyanobacteria

  • LIN Shituan , 1, 2 ,
  • WANG Xiaoxue 1, 2 ,
  • CHEN Ran , 1
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
CHEN Ran. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2021-10-26

  Revised date: 2021-12-01

  Online published: 2021-12-10

Supported by

National Natural Science Foundation of China(31625001)

National Natural Science Foundation of China(91951203)

Fold

摘要

蓝细菌(cyanobacteria)是一类能进行放氧光合作用的原核生物。蓝细菌生长速度较快, 几乎存在于所有的陆地和水生环境中。毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统在原核生物中分布十分广泛, 在细菌的生命活动中扮演了重要的角色, 如维持水平基因转移元件的稳定性以及应对环境胁迫压力等。已有的基因组分析表明, 蓝细菌基因组中含有大量潜在的毒素-抗毒素系统, 但是目前对蓝细菌毒素-抗毒素系统的实验鉴定仍较少。本文分别以淡水和海水代表菌株集胞藻PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)和聚球藻WH7803(Synechococcus sp. WH7803)为研究对象, 对二者基因组上的毒素-抗毒素系统进行预测, 并选取预测结果中的7对潜在的毒素-抗毒素系统进行实验验证。结果表明, 集胞藻PCC6803的两对毒素-抗毒素系统BAD01932-1933 和 BAA18559-New ORF7中的毒素具有明显的细胞毒性。本文的研究结果有助于后续对蓝细菌毒素-抗毒素系统及其生态和生物学功能的研究。

关键词： 毒素-抗毒素系统; 蓝细菌; 集胞藻 PCC6803; 聚球藻 WH7803

本文引用格式

林世团 , 王晓雪 , 陈冉 . 两种蓝细菌中7对毒素-抗毒素系统的分析和鉴定[J]. 热带海洋学报, 2022 , 41(3) : 119 -134 . DOI: 10.11978/2021144

Abstract

Cyanobacteria are the only oxygenic photosynthetic prokaryotes on Earth, possessing a relatively fast growth rate and prospering in a range of diverse habitats. Toxin-antitoxin (TA) systems are prevalent in prokaryotes, and play important roles in cell physiological activities including maintenance of mobile genetic elements and mediation of stress responses. Previous bioinformatic studies revealed that putative TA systems are widely distributed in the cyanobacteria genomes. However, studies of TA systems in cyanobacteria are limited. In this study, we predicted TA systems in the genomes of Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. WH7803, the model strains of freshwater and marine environments cyanobacteria, respectively. The toxicity test of five TA systems in PCC6803 and two TA systems in WH7803 were further implemented. We found that the ectopic expression of toxin New ORF7 and BAD01932 lead to growth inhibition in Escherichia coli host. Our study provides vital information for future study of the ecological and biological roles of TA systems in cyanobacteria.

Key words： toxin-antitoxin system; cyanobacteria; Synechocystis sp. PCC6803; Synechococcus sp. WH7803

蓝细菌(Cyanobacteria), 也被称为蓝藻或蓝绿藻, 属于革兰氏阴性菌(Sinha et al, 2008)。蓝细菌能利用叶绿素、胡萝卜素等光合色素进行光合作用, 是地球上一类能进行放氧光合作用的原核生物(Aguilera et al, 2021)。蓝细菌种类丰富, 分布广泛且形态多样, 包含6个目2000多个种(Stanier et al, 1977)。浮游蓝细菌是海洋食物网的主要生产者, 是全球碳循环和氮循环中不可或缺的角色(Bullerjahn et al, 2014; Tang et al, 2019)。此外, 蓝细菌具有生长速度快、遗传操作简单和生理功能多样等特性, 是研究生物基因型(Do Carmo Bittencourt-Oliveira et al, 2012; Gągała et al, 2014; Belykh et al, 2015; Song et al, 2015)、表型(Berrendero et al, 2011; Dojani et al, 2014)和生态型(D'Agostino et al, 2014; Chandler et al, 2016; Marston et al, 2016; Sohm et al, 2016)之间关系的重要模式生物。
集胞藻PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)和聚球藻WH7803(Synechococcus sp. WH7803)分别是研究淡水和海水蓝细菌的模式菌株。单细胞淡水集胞藻PCC6803是首个完成基因组序列测定的蓝细菌(Kaneko et al, 1995, 1996)。基因组大小为3573471bp (base pair), 每个细胞具有12个基因组拷贝(Labarre et al, 1989), 编码3317个基因。集胞藻PCC6803还具有7个环形质粒, 大小在2.3~119kb之间(Chauvat et al, 1986; Prindle, 2015)。海水蓝细菌与淡水蓝细菌亲缘关系较远, 主要成员为原绿球藻(Prochlorococcus)和聚球藻两个属。原绿球藻主要分布营养贫乏的温暖海域, 而聚球藻的生态分布更为广泛, 从赤道的温暖海域到次极地低温水域, 从富营养的河口到寡营养的海洋水域。聚球藻是一种超微型单细胞原核藻类, 大小仅为1~2µm(Partensky et al, 1999), 因而直到1979年才得以在海洋中被发现。目前研究的海洋聚球藻的大多数为单倍体, 仅含有单个染色体。然而海洋聚球藻WH7803的染色体具有多个拷贝, 一般含有4个染色体拷贝, 基因组大小为2366980bp。
毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统是原核系统中由相邻的2个或3个基因组成的基因元件。其中毒素基因编码毒素蛋白, 起到抑菌或杀菌功能, 而抗毒素基因编码蛋白或RNA, 通过直接或间接作用拮抗毒素的毒性(Dorman et al, 2001)。毒素-抗毒素系统具有多种功能, 包括能够调节细胞代谢水平对抗外界的生长压力、参与细胞程序性死亡、参与“持留菌”形成、参与生物被膜形成以及抵御噬菌体侵染等生物过程(Wang et al, 2011)。目前依据抗毒素与毒素作用方式的不同, 将毒素-抗毒素系统分为7种类型 (Ⅰ型至Ⅶ型)(Wang et al, 2021)。Ⅱ型毒素-抗毒素系统中毒素和抗毒素皆为蛋白质, 通过毒素和抗毒素间的蛋白-蛋白的互作抑制毒素的毒性作用。
毒素-抗毒素系统的系统发育分析表明, 蓝细菌基因组分布着大量的毒素-抗毒素系统(Akarsu et al, 2019)。然而目前只有极少数蓝细菌的毒素-抗毒素系统被研究。基于蓝细菌生态位置的重要性和毒素-抗毒素功能的多样性, 我们以淡水蓝细菌集胞藻PCC6803 和海水蓝细菌聚球藻WH7803作为研究对象, 对其基因组进行了毒素-抗毒素系统预测。并且选取集胞藻PCC6803的5对和聚球藻WH7803的2对毒素-抗毒素系统进行毒性验证并对其蛋白进行异源表达纯化。实验结果表明, 集胞藻PCC6803的两对毒素-抗毒素系统BAD01932-1933和BAA18559-New ORF7的毒素具有明显的细胞毒性, 且抗毒素能中和毒素毒性, 与预测结果相符。本文的研究结果将有助于后续对蓝细菌毒素-抗毒素系统及其生态和生物学功能的研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基

实验所用的克隆模板集胞藻PCC6803和聚球藻WH7803基因组DNA分别由中国科学院水生生物研究所张承才教授和香港科技大学曾庆璐教授馈赠。基因克隆和蛋白表达所用的菌株大肠杆菌(Escherichia coli) K12 BW25113, ER2738和BL21(DE3) 均为本实验室保存, 培养条件为37℃条件下Luria-Bertani(LB)培养基培养。菌株培养使用的抗生素为羧苄青霉素和硫酸卡那霉素, 工作浓度分别为100μg·mL-1和50μg·mL-1。

1.1.2 主要试剂

DNA 限制性核酸内切酶购于NEB公司(伊普斯威奇, 美国); 基因片段和载体同源重组使用的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit)购自诺唯赞公司(南京, 中国); DNA 凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购买自 OMEGA 公司(诺克罗斯, 美国); DNA提取试剂盒购于天根公司(北京, 中国)。PCR 引物由天一辉远公司(广州, 中国)合成。蛋白纯化过程中所使用的Ni-NTA亲和柱料购自 Qiagen 公司(杜塞尔多夫, 德国)。

1.2 集胞藻PCC6803和聚球藻WH7803基因组TA系统预测分析

集胞藻PCC6803和聚球藻WH7803菌株中TA的预测主要结合以下两种策略: (1)下载TADB数据库(Altschul, 1997)(https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB2/index.php)中已知的TA蛋白序列, 通过本地 BLASTP 检索这两种菌株中和已知 TA 相似的蛋白序列(参数: -evalue 1e-5); (2)两种菌株的全部蛋白序列用InterProScan(version 5.35-74.0)对蛋白结构域(Pfam domain)进行注释, 根据已知 TA 的结构域初步筛选潜在TA。上述两种TA预测的结果再进一步根据基因上下游“关联犯罪”原则(guilt-by-association)(Leplae et al, 2011)进行筛选, 对于明确具有毒素或者抗毒素结构域的但是上下游又没有符合条件的基因, 利用NCBI数据库在线工具ORF finder对其上下游进行预测分析潜在的新的开放阅读框(open reading frames, ORFs), 再结合结构域注释确定菌株中未注释的新TA。所有备选基因通过Xtalpred网站(https://xtalpred.godziklab.org/XtalPred-cgi/xtal.pl)进行已解析结构的同类型蛋白的检索和比对分析, 根据检索结果确定备选基因类型。

1.3 分子生物学操作

分别选取预测结果中集胞藻PCC6803的5对和聚球藻WH7803的2对毒素-抗毒素系统进行验证。将这7对毒素-抗毒素系统的毒素(BAA17887, New ORF7, BAD01872, BAD01932, BAD01997, SynWH7803_1121, SynWH7803_1701)和抗毒素(BAA17887, BAA18559, BAD01871, BAD01933, BAD01998, SynWH7803_1122, SynWH7803_1700)以及相对应毒素-抗毒素合体的编码区采用附表1中的引物进行扩增, 使用one-step方法连接至 pBAD质粒。再将连接产物通过化学转化的方法, 转入感受态大肠杆菌 BW25113 中, 并使用含羧苄青霉素的 LB 平板进行重组菌株筛选。使用pBAD-f (5'-ATGCCATAGCATTTTTATCCA-3')和pBAD-r (5'-TCT GATTTAATCTGTATCAGG-3')进行PCR验证, 选取大小正确的克隆测序确认。用于蛋白表达的重组菌株BL21(DE3)/pET28b(+)的构建过程与上述相同。采用附表1中的引物pUC19- pro-BAD1932- 1933-f(5'-GAAAAAGAAGAATTGATGATGT-3')和pUC19-pro-BAD1932-1933-r(5'-CTAAAAGAGTC TTTCCACCGAT-3')扩增毒素-抗毒素系统BAD 1932-1933及其启动子区, 使用one-step方法连接至pUC19质粒上。再将连接产物通过化学转化的方法, 转入感受态大肠杆菌ER2738中, 并使用含羧苄青霉素的LB平板进行重组菌株筛选, 随后使用M13-f和M13-r通用引物PCR验证并测序。最后将测序结果正确的重组质粒通过化学转化的方法, 转入感受态大肠杆菌BW25113中,使用M13-f 和M13-r进行PCR验证。
附表1 本文所用引物

Tab. S1 Primers used in this study

引物名称 序列(5'—3') 描述
pBAD-01933-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGACCCAGATCACCAAGTCCA 过表达
pBAD-01933-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCAATTTTTAACACCATCAATCTCTATT 过表达
pBAD-01932-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGGTGTTAAAAATTGAACTTCTTGATA 过表达
pBAD-01932-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTCTAAAAGAGTCTTTCCACCGATTTC 过表达
Pet28apsp-01933-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATG GTGTTAAAAATTGAACTTCT 蛋白表达
Pet28apsp-01933-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG CTAAAAGAGTCTTTCCACCG 蛋白表达
Pet28apsp-01932-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATG ACCCAGATCACCAAGTCCAA 蛋白表达
Pet28apsp-01932-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TCAATTTTTAACACCATCAA 蛋白表达
pBAD-New ORF7-F ACAGGAGGAATTAACCATGGAT ATGTTACCTGAAATTAATATTT 过表达
pBAD-New ORF7-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTT CTATTTTTTCTCGATAATTTCA 过表达
pBAD-BAA18559-F ACAGGAGGAATTAACCATGGAT ATGAATTATCCAATTGTTATTT 过表达
pBAD-BAA18559-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTT CTATGCGGCACTCAACATCTTA 过表达
Pet28apsp-New ORF7-NdeI-F TCTGTTCCAGGGGCCCCATATG TTACCTGAAATTAATATTTGCC 蛋白表达
Pet28apsp-New ORF7-NdeI-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG CTATGCGGCACTCAACATCTTA 蛋白表达
Pet28apsp-BAA18559-F TTAAGAAGGAGATATACATATG TTACCTGAAATTAATATTTGCC 蛋白表达
Pet28apsp-BAA18559-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG TGCGGCACTCAACATCTTAATT 蛋白表达
pBAD-01997-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGACATCTGTTTTTCACGTTCTAATC 过表达
pBAD-01997-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTTAGTTTTTCCACTGACTTCTTAGCTG 过表达
pBAD-01998-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGAGATATAAAAATAATTGTCGAATCAAT 过表达
pBAD-01998-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTTATCTTAAAACCTGTAGATGAAGTTCTTC 过表达
pBAD-01871-F TAACAGGAGGAATTAACATGCGAAGACGCAGACCTACC 过表达
pBAD-01871-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTCTAGACATGCTCAAACTTAACGTATTTG 过表达
pBAD-01872 -F TAACAGGAGGAATTAACATGTCTAGCACCCTGGCAATCA 过表达
pBAD-01872 -R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTTAAATCCGCCAGACCAAAGC 过表达
pBAD-BAA17887-1-58-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGAAGGTTAAAGTAATCCTCAAAATCT 过表达
pBAD-BAA17887-1-58-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCAAGATTGCTTGAGAATACTGGC 过表达
pBAD-BAA17887-59-136-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGTCTCAAGCAATCAGGTATTACTTTA 过表达
pBAD-BAA17887-59-136-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTTAAGCCGCAACTGTTACGTAGG 过表达
pBAD-SynWH7803_1122- F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGGTGGCGGCTGATCATC 过表达
pBAD-SynWH7803_1122- R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCACAGCGGAACGGCCTG 过表达
pBAD-SynWH7803_1121- F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGACCCATCTCAAGCCATCC 过表达
pBAD-SynWH7803_1121- R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTCACCACAGCTGCAGTTTCAGG 过表达
pBAD-SynWH7803_1701 -F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGATCCCTGTTCTCTCTGGGTT 过表达
pBAD-SynWH7803_1701- R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCAACCTGTTGCAGTTGATCGG 过表达
pBAD-SynWH7803_1700- F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGGGATTTCAGGCTGTGCC 过表达
pBAD-SynWH7803_1700- R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCAGGAATGCGGCGGTTG 过表达
pBAD-01933-F GGGCTAACAGGAGGAATTAACATGACCCAGATCACCAAGTCCA 过表达
pBAD-01933-R GTTTTTGTTCTACGTAAGCTTTCAATTTTTAACACCATCAATCTCTATT 过表达
pUC19-pro-BAD1932-1933-f GAAAAAGAAGAATTGATGATGT 质粒稳定性
pUC19-pro-BAD1932-1933-r CTAAAAGAGTCTTTCCACCGAT 质粒稳定性
M13-f CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 质粒稳定性
M13-r AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 质粒稳定性

1.4 重组菌株毒性的检测

将过夜培养的重组菌株菌液用接种环分别划线于含羧苄青霉素和0.3% L-阿拉伯糖的LB平板, 并同时划线于不含0.3% L-阿拉伯糖, 仅含羧苄青霉素的LB平板作为对照, 于37℃培养箱中培养过夜, 拍照记录结果。

1.5 重组菌株生长曲线及菌落形成单位的测定

pBAD质粒连接的重组菌株接种于LB液体培养基培养过夜, 以初始浓度OD600≈0.1转接到装有25mL含有羧苄青霉素的 LB 液体培养基的锥形瓶, 并加入 0.3% L-阿拉伯糖进行诱导表达。分别取诱导 0、2、4、6和8h的菌液作梯度稀释, 并取各梯度10μL稀释液点至LB平板, 在37℃培养箱中培养过夜, 拍照记录并计算菌落形成单位(colony-forming units, CFU)。同时分别取诱导后0、2、4、6和8h的菌液测定 OD600, 并使用GraphPad Prism 8软件进行生长曲线的绘制。

1.6 质粒稳定性测定

将携带pUC19-BAD01932-33重组质粒和pUC19空质粒的BW25113菌株于含羧苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养, 以初始浓度OD600≈0.1 转接到3mL含羧苄青霉素的LB液体培养基。37℃培养12h后, 取菌液进行梯度稀释, 并分别取10μL 各梯度的稀释液点在含羧苄青霉素和不含羧苄青霉素的LB平板上, 该时间点记为0h。以0h的菌液作为母液, 以1‰的体积比转接至3mL LB液体培养基中, 每隔12h取菌液进行梯度稀释, 并分别取10μL各梯度的稀释液点在含羧苄青霉素和不含羧苄青霉素的LB平板上。在37℃培养箱中培养过夜, 拍照记录并计算CFU。并使用GraphPad Prism 8软件进行质粒稳定性曲线的绘制。

1.7 蛋白序列的比对分析

从NCBI网站下载所需蛋白序列, 采用Clustal X2软件进行序列比对, 再将比对生成的文件上传至EsPript3.0网站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ ESPript.cgi) 进行比对结果的展示。

1.8 目的蛋白的原核表达与纯化

将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21 (DE3)中。将转化板置于37℃恒温箱中过夜培养, 第二天挑单菌落到20mL LB培养基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒温摇床中震荡培养过夜。次日取出过夜培养的20mL LB培养基, 以1:100的接种量接到 500mL培养基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒温震荡培养至OD600达到0.6~0.8, 加入终浓度为0.3mmol·L-1的异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG), 放入37℃的恒温震荡培养箱中培养, 培养5h, 诱导目的蛋白表达。
蛋白纯化步骤由菌液离心及菌体重悬、超声破碎、高速离心、Ni-NTA填料平衡、上清与填料结合、蛋白镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)等步骤组成。具体纯化步骤如下:
1) 菌体重悬: 诱导5h后的菌液离心去上清, 沉淀用30mL Ni-NTA缓冲液A缓冲液重悬菌体到50mL离心管中, 涡旋震荡充分混匀后加入终浓度为1mmol·L-1的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)和5mmol·L-1的β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol, β-Me);
2) 超声破碎: 超声强度为75%, 破碎10s, 间隔5s, 冰上破碎120s。取4μL菌液加入到400mL Bradford中, 如果Bradford变蓝, 则说明菌体已破碎好;
3) 高速离心: 将超声破碎过后的菌液4℃, 23500×g, 离心1h, 分离上清与沉淀;
4) Ni-NTA 填料平衡: 取1mL柱料, 3434 ×g离心60s后去除上清。管底柱料先用2倍柱体积的Ni-NTA缓冲液B平衡Ni-NTA填料。接着再用2倍柱体积的Ni-NTA缓冲液A平衡填料;
5) 上清与填料结合: 蛋白高速离心结束后, 将上清倒入50mL离心管, 用吸管吸取2mL上清重悬平衡好的填料, 再一起转移到50mL离心管; 4℃, 低速旋转结合1h。先使用低浓度咪唑的缓冲液对结合到Ni-NTA填料上的杂蛋白进行洗脱, 然后采用不同浓度的高浓度咪唑缓冲液进行梯度洗脱。收集的样品使用Tricine-SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达和洗脱情况。

2 结果

2.1 两种蓝细菌存在大量TA系统

通过数据库检索和本地比对, 预测结果显示, 集胞藻PCC6803含有51对潜在的TA, 聚球藻 WH7803只有潜在的10对TA(见附表2、3)。并且根据集胞藻 PCC6803 的预测结果, 在不成对的毒素基因或者抗毒素基因上下游分析寻找配对的抗毒素和毒素基因, 得到了9个未注释的开放阅读框, 命名为New ORF1-9。基于预测结果, 我们进行了不同类型 TA 的数量统计分析。分析结果表明, 集胞藻PCC6803 质粒分布有23对, 基因组分布有 28 对 TA(图1a)。VapBC(23 对)、HicAB(9对)和HigAB(4对)系统是集胞藻PCC6803基因预测的TA系统分布最多的三种类型(图1b)。相比于集胞藻 PCC6803, 聚球藻WH7803基因组上的毒素-抗毒素系统分布较少, 仅有10对(见附表3)。
图1 集胞藻PCC6803预测的不同TA类型分析

Fig. 1 Analysis of different TA types predicted in Synechocystis sp. PCC6803

附表2 集胞藻. PCC6803 毒素-抗毒素系统预测信息

Tab. S2 Prediction information of toxin-antitoxin systems in Synechocystis sp. PCC6803

起始位点 终止位点 蛋白长度(氨基酸) 正负链 基因功能描述 蛋白家族编号 蛋白家族描述 xtalpred 软件分析结果 毒素/抗毒素
BAA10220 2516150 2516527 125 - 未知蛋白 Cag_0280 PF01850 PIN 结构域 VpaC 毒素
New ORF1 2516528 2516749 73 - New ORF / / VapB 抗毒素
BAA10330 2631207 2631608 133 - 毒力相关蛋白毒力相关蛋白C PF01850 PIN 结构域 VpaC 毒素
BAA10331 2631611 2631868 85 - PEMI-样蛋白 / / VapB 抗毒素
BAA10426 2738712 2738915 67 - 未知蛋白 AM1_C0132 / / HicB 抗毒素
New ORF2 2738918 2739133 71 - New ORF / / HicA 毒素
BAA10766 3121193 3121687 164 - 未知蛋白 sll0658 PF11848 未知功能结构域 (DUF3368) VpaC 毒素
BAA10767 3121684 3121953 89 - 未知蛋白 ssl1255 PF03683 未表征蛋白家族 (UPF0175) VapB 抗毒素
BAA10878 3262064 3262459 131 - 未知蛋白 sll0525 PF01850 PIN 结构域 VpaC 毒素
BAA10879 3262471 3262749 92 - 未知蛋白 ssl1004 / / VapB 抗毒素
BAA16615 48067 48408 113 - 未知蛋白 sll1400 PF18480 未知功能结构域 (DUF5615) VpaC 毒素
BAA16616 48405 48635 76 - 未知蛋白 ssl2733 PF04255 未知功能蛋白 (DUF433) VapB 抗毒素
BAA16671 110392 110724 110 + PrlF PF15937 毒素蛋白YhaV的抗毒素PrlF _ PrlF_抗毒素 抗毒素
BAA16672 110808 111224 138 + 未知蛋白 slr0725 PF11663 具有核酸内切酶活性的毒素 YhaV 毒素
BAA16930 382392 382646 84 + 未知蛋白 ssr1765 PF15919 HicB样抗毒素 HicB 抗毒素
BAA16931 382643 382873 76 + 未知蛋白 ssr1766 PF07927 HicA HicA 毒素
BAA17012 473953 474204 83 - 毒力相关蛋白 C PF01850 PIN结构域 VpaC 毒素
BAA17013 474205 474432 75 - 毒力相关蛋白 B / / VapB 抗毒素
New ORF3 474504 474785 93 - New ORF / / HigB_毒素 毒素
BAA17014 474789 475007 72 - 未知蛋白 MAE_61720 / / HigA_抗毒素 抗毒素
BAA17015 475110 475445 111 - 未知蛋白 sll1505 PF01934 未知功能蛋白 DUF86 HEPN 毒素
BAA17016 475435 475743 102 - 未知蛋白 sll1504 PF01909 核苷酸转移酶结构域 MNT 抗毒素
BAA17065 545029 545253 74 + 未知蛋白 SYNGTS_0489 PF04255 未知功能蛋白 (DUF433) VapB 抗毒素
BAA17066 545250 545588 112 + 未知蛋白 SYNGTS_0490 PF18480 未知功能结构域 (DUF5615) VapC 毒素
BAA17191 679690 680178 162 + 未知蛋白 Ppha_2119 PF01850 PIN结构域 VapC 毒素
BAA17192 680096 680368 90 + 未知蛋白 Ppha_2120 / / VapB 抗毒素
BAA17278 775687 776061 124 - 未知蛋白 sll1912 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAA17279 776058 776342 94 - 未知蛋白 ssl3615 / / VapB 抗毒素
BAA17391 893261 893590 109 + 未知蛋白 slr1209 PF04255 未知功能蛋白 (DUF433) VapB 抗毒素
BAA17392 893583 893972 129 + 未知蛋白 slr1210 PF18480 未知功能结构域 (DUF5615) VapC 毒素
BAA17455 968487 968960 157 - 未知蛋白 sll1715 PF01850 PIN结构域结构域 VapC 毒素
BAA17456 968893 969294 133 - 未知蛋白 sll1714 / / VapB 抗毒素
BAA17528 1048406 1048753 115 - 未知蛋白 sll1130 PF02452 PemK-样毒素 MazF 毒素
BAA17529 1048750 1049016 88 - 未知蛋白 ssl2245 / / MazE 抗毒素
BAA17539 1056714 1056944 76 + HicB / / HicB 抗毒素
New ORF4 1056487 1056717 76 + New ORF / / HicA 毒素
BAA17886 1444115 1445392 425 + 未知蛋白 slr1998 PF01494 FAD 结合结构域 未知 未知
BAA17887 1445425 1445835 136 + 未知蛋白 Gura_0600 PF07927 HicA N-HicA,C-HicB 抗毒素
BAA18037 1617376 1617813 145 - 未知蛋白 sll1411 PF01934 未知功能蛋白 DUF86 HEPN 毒素
BAA18038 1617806 1618096 96 - 未知蛋白 ssl2749 PF01909 核苷酸转移酶结构域结构域 MNT 抗毒素
BAA18040 1620037 1620222 61 + 未知蛋白 ssr3570 / / YoeB 毒素
BAA18041 1620276 1620539 87 + prevent-host-death family protein PF02604 Phd_YefM抗毒素 YefM 抗毒素
起始位点 终止位点 蛋白长度(氨基酸) 正负链 基因功能描述 蛋白家族编号 蛋白家族描述 xtalpred 软件分析结果 毒素/抗毒素
BAA18080 1660069 1660287 72 + 未知蛋白 ssr2201 / / VapB 抗毒素
BAA18081 1660277 1660711 144 + 未知蛋白 slr1327 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAA18337 1933468 1933854 128 - 未知蛋白 SYNGTS_1762 PF01850 PIN结构域 VapC 毒素
BAA18338 1933854 1934060 68 - 未知蛋白 SYNGTS_1763 PF10047 未知功能蛋白 (DUF2281) VapB 抗毒素
New ORF5 2084922 2085206 94 + New ORF / / BrnT 毒素
New ORF6 2085136 2085417 93 + New ORF PF07927 HicA BrnA 抗毒素
BAA18559 2193591 2193812 73 - 未知蛋白 MAE_17890 PF15919 HicB样抗毒素 HicB 抗毒素
New ORF7 2193813 2194157 114 - New ORF PF07927 HicA, HicA 毒素
New ORF8 3341880 3342128 82 - New ORF / / HicB 抗毒素
BAA18682 3342125 3342442 105 - 未知蛋白 MAE_13550 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAA18687 3347941 3348201 86 + 未知蛋白 SYNGTS_2983 / / VapB 抗毒素
BAA18688 3348191 3348553 120 + 未知蛋白 SYNGTS_2984 PF06296 RelE / RelB系统毒素 RelE 毒素
BAA18757 3428962 3429171 69 + 未知蛋白 MAE_40070 PF15919 HicB样抗毒素 HicB 抗毒素
New ORF9 3429171 3429398 75 + New ORF / / HicA 毒素
BAB61866 2074694 2074957 87 + prevent-host-death family protein (plasmid) PF02604 Phd_YefM类抗毒素 YefM 抗毒素 抗毒素
BAB61867 2085826 2086110 94 + prevent-host-death family protein PF02604 Phd_YefM类抗毒素 YefM 抗毒素 抗毒素
BAD01773 1136 1540 134 - 未知蛋白 sll5003 (plasmid) PF18480 未知功能结构域 (DUF5615) VapC 毒素
BAD01774 1515 1826 103 - 未知蛋白 sll5004 (plasmid) PF04255 未知功能蛋白 (DUF433) VapB 抗毒素
BAD01790 24181 24462 93 + 未知蛋白 ssr5020 (plasmid) PF05015 RelE 样毒素 HigB-like_毒素 毒素
BAD01791 24473 24787 104 + 未知蛋白 slr5021 PF01381 螺旋-转角-螺旋 HigA_抗毒素 抗毒素
BAD01835 67163 67378 71 - 未知蛋白 ssl5065 / / ParD_抗毒素 抗毒素
BAD01836 67362 67976 204 - ParA 家族 PF01656 CobQ/CobB/MinD/ParA 核苷酸结合结构域 ParA_毒素 毒素
BAD01864 92805 93236 143 - 质粒稳定蛋白 PF01850 PIN结构域 VapC 毒素
BAD01865 93233 93520 95 - 未知蛋白 ssl5095 PF02604 Phd_YefM类抗毒素 VapB 抗毒素
BAD01871 96124 96561 145 + 未知蛋白 Ajs_1570 / / 未知 未知
BAD01872 96554 97156 200 + 未知蛋白 BURPS1106A_2452 PF08843 核苷酸转移酶 AbiEii毒素 AbiEii 毒素 毒素
BAD01886 107105 107527 140 + 未知蛋白 slr5116 (plasmid) PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAD01887 107531 107746 71 + 未知蛋白 ssr5117 PF05534 HicB 家族 VapB 抗毒素
BAD01905 1399 1827 142 - 质粒稳定蛋白 PF01850 PIN结构域 VapC 毒素
BAD01906 1799 2032 77 - 未知蛋白 MYO_450 / / VapB 抗毒素
BAD01908 3041 3364 107 - 未知蛋白 sll7006 PF05534 HicB 家族 HicB 抗毒素
BAD01909 3367 3591 74 - 未知蛋白 ssl7007 / / VapC 毒素
BAD01932 28850 29353 167 - 未知蛋白 sll7030 PF13508 乙酰基转移酶(GNAT)结构域 GNAT 毒素 毒素
BAD01933 29337 29639 100 - 未知蛋白 sll7031 PF08681 未知功能蛋白 (DUF1778) GNAT 抗毒素 抗毒素
BAD01940 35891 36178 95 - 未知蛋白 ssl7038 / / HigA 抗毒素 抗毒素
BAD01941 36189 36479 96 - 未知蛋白 ssl7039 PF05973 噬菌体衍生蛋白 Gp49 样(DUF891) HigB 毒素 毒素
BAD01942 36597 36848 83 + 未知蛋白 ssr7040 PF04014 MazE抗毒素 MazE 抗毒素
BAD01943 36839 37201 120 + 未知蛋白 slr7041 PF02452 PemK-样, MazF-样毒素 MazF 毒素
BAD01947 40013 40234 73 - 未知蛋白 ssl7045 / / 未知 未知
起始位点 终止位点 蛋白长度(氨基酸) 正负链 基因功能描述 蛋白家族编号 蛋白家族描述 xtalpred 软件分析结果 毒素/抗毒素
BAD01948 40245 40514 89 - 未知蛋白 sll8027 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAD01997 93673 94188 171 + 未知蛋白 slr7095 PF13671 AAA结构域 未知 毒素
BAD01998 94198 94611 137 + 未知蛋白 slr7096 / / 未知 未知
BAD02012 3836 4393 185 - 未知蛋白 sll8004 PF13671 AAA结构域 Zeta_毒素 毒素
BAD02013 4365 4655 96 - 未知蛋白 ssl2749 PF01909 核苷酸转移酶结构域 MNT 抗毒素
BAD02015 6043 6393 116 - 未知蛋白 sll8007 PF18478 PIN 样结构域 VapC 毒素
BAD02016 6377 6601 74 - 未知蛋白 ssl8008 PF04255 未知功能蛋白 (DUF433) VapB 抗毒素
BAD02019 8821 9195 124 - 未知蛋白 sll8011 PF18480 未知功能结构域 (DUF5615) VapC 毒素
BAD02020 9205 9621 138 - 未知蛋白 sll8012 / / VapB 抗毒素
BAD02021 9713 9940 75 + 未知蛋白 ssr8013 PF10047 未知功能蛋白 (DUF2281) VapB 抗毒素
BAD02022 9948 10373 141 + 未知蛋白 slr8014 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAD02023 10395 10994 199 + ParA 家族 PF01656 CobQ/CobB/MinD/ParA 核苷酸结合结构域 ParA 毒素
BAD02024 10998 11867 289 + 质粒分配蛋白 PF02195 ParB-样核酸酶结构域 ParB 抗毒素
BAD02035 23434 23859 141 - 未知蛋白 sll8027 PF13470 PIN结构域 VapC 毒素
BAD02036 23856 24077 73 - 未知蛋白 ssl8028 / / VapB 抗毒素
BAD02106 47396 47815 139 + PilT PF01850 PIN结构域 VapC 毒素
BAD02107 47827 51129 1100 + I型限制修饰系统M亚基 PF07669 Eco57I限制性修饰甲基化酶 VapB 抗毒素
BAD02149 87011 87274 87 - 未知蛋白 ssl6092 / / VapC 抗毒素
BAD02150 87258 87854 198 - ParA 家族 PF01656 CobQ/CobB/MinD/ParA 核苷酸结合结构域 VapB 抗毒素
BAD02157 93820 94140 106 + 未知蛋白 slr6100 PF09907 HigB_毒素, RelE-样毒素 HigB_毒素 毒素
BAD02158 94281 94700 139 + 未知蛋白 slr6101 / / HigA_抗毒素 抗毒素
附表3 聚球藻 WH7803 毒素-抗毒素系统预测信息

Tab. S3 Prediction information of toxin-antitoxin systems in Synechococcus sp. WH7803

基因编号(ensembl数据库) 起始位点 终止位点 蛋白长度(氨基酸) 正负链 基因功能描述 蛋白家族编号 蛋白家族描述 xtalpred 软件分析结果 毒素/抗毒素
SynWH7803_0100 102513 102677 54 + NTP_transf_2 结构域蛋白 / 未知 未知 毒素
SynWH7803_0101 102623 102820 65 + RelA 和 Spot 样 ppGpp 合成酶和
水解酶		 / NT_Pol-β-样
超家族		 MNT 抗毒素
SynWH7803_0976 902407 902246 53 + 未表征的膜蛋白 / PIN 未知 抗毒素
SynWH7803_0977 902875 902492 127 + 保守的假定蛋白保守的假定蛋白 PF11964 SpoIIAA-样 SpoIIAA-样蛋白 未知
SynWH7803_1086 996599 995259 446 - 保守的假定蛋白保守的假定蛋白 PF14403 Circularly permuted ATP-grasp type 2 谷胱甘肽精氨酸合酶 未知
SynWH7803_1087 997032 996586 148 - 保守的假定蛋白保守的假定蛋白 / / 未知 抗毒素
SynWH7803_1088 997508 997032 158 - 分泌的五肽重复蛋白 PF00805 五肽重复序列
(8 份)		 未知 未知
SynWH7803_1121 1027292 1026795 165 - 预测的 rRNA
甲基化酶		 PF00588 SpoU rRNA 甲基化酶家族 RNA甲基化酶 毒素
SynWH7803_1122 1027843 1027289 184 - 双功能腺苷钴胺生物合成蛋白 PF02283 甲酰胺激酶 腺苷钴酰胺激酶/腺苷钴酰胺磷酸鸟苷转移酶 未知
SynWH7803_1603 1475142 1474984 52 + 假定蛋白 / / ATP依赖性RNA解旋酶 未知
SynWH7803_1604 1475671 1475198 157 + 未表征的保守
分泌蛋白		 / Gp49 未知 毒素
SynWH7803_1605 1476140 1475679 153 + SufE 样蛋白, 可能参与 Fe-S 中心组装 PF02657 Fe-S代谢相关域 Cpta_toxin 毒素
基因编号(ensembl数据库) 起始位点 终止位点 蛋白长度(氨基酸) 正负链 基因功能描述 蛋白家族编号 蛋白家族描述 xtalpred 软件分析结果 毒素/抗毒素
SynWH7803_1606 1477492 1476176 438 + 高丝氨酸脱氢酶 PF03447 高丝氨酸脱氢酶, NAD 结合结构域 高丝氨酸脱氢酶 未知
SynWH7803_1700 1554939 1554607 110 - 假定蛋白 PF13469 磺基转移酶家族 磺基转移酶家族 未知
SynWH7803_1701 1555576 1554899 225 - 假定蛋白 PF13469 磺基转移酶家族 磺基转移酶家族 毒素
SynWH7803_1762 1616798 1615596 400 + 整合膜蛋白(PIN 域超家族) / PIN_5 VapC 毒素
SynWH7803_1763 1617500 1616829 223 + ATP 依赖性 Clp 蛋白酶的蛋白酶亚基 PF00574 Clp 蛋白酶 Clp 蛋白酶 未知
SynWH7803_1944 1778918 1779145 75 + 假定蛋白SynWH7803_1944 PF02604 Phd YefM抗毒素 Phd YefM_超家族抗毒素 抗毒素
SynWH7803_1945 1779145 1779555 136 + 假定蛋白 SynWH7803_1945 PF01850 PIN 结构域 VapC 毒素
SynWH7803_2509 2341171 2340317 284 - 甲酰基四氢叶酸去甲酰基酶 PF00551 甲酰基转移酶 甲酰基转移酶 未知
SynWH7803_2510 2341482 2341222 86 - 预测的转录调节因子 PF02195 ParB 样核酸酶
结构域		 ParBc 抗毒素
依据编码基因的大小和方向, 两个基因位置是否存在重叠以及与典型TA结构域和与同类型成员的序列相似度分析结果, 我们分别选取了集胞藻 PCC6803预测结果中的5对TA和聚球藻WH7803预测结果中的2对 TA进行进一步的分析和毒性实验验证(表1)。选取的集胞藻PCC6803的5对 TA 分别是: 位于质粒pSYSM中的BAD01871-72、BAD01932-93、BAD01997-98和位于基因组中的 BAA17887、BAA18559-New ORF7。BAA17887基因编码的蛋白预测为HicAB融合蛋白, 进一步分析发现其N端1~58个氨基酸残基为HicA毒素蛋白, C端 59~136个氨基酸为HicB抗毒素蛋白。另外, BAA18559-New ORF7中的毒素基因New ORF7在之前的报道中并没有得到注释, 为本文新注释的开放阅读框。选取的聚球藻SynWH7803_ 1121-22和SynWH7803_1700-01两对TA系统均位于基因组上。其余预测得到的TA系统信息见附表2、3。
表1 本文选取的7对毒素-抗毒素系统预测信息。

Tab. 1 Prediction information of seven TA systems selected in this paper

菌株名称 基因编号 起始位置 终止位置 蛋白长度/aa TA信息 TA 类型预测
集胞藻PCC6803 BAD01871 96124 96561 145 x
BAD01872 96554 97156 200 T AbiEii家族毒素
BAD01932 28850 29353 167 x GNAT家族毒素
BAD01933 29337 29639 100 A GNAT家族抗毒素
BAD01997 93673 94188 171 T NTP水解酶家族毒素
BAD01998 94198 94611 137 x
BAA17887 1445425 1445835 136 A HicA和HicB融合蛋白
New ORF 7 2193818 2194157 114 T HicAB家族毒素
BAA18559 2193591 2193812 73 A HicAB家族抗毒素
聚球藻WH7803 SynWH7803_1121 1026795 1027292 165 T 甲基转移酶
SynWH7803_1122 1027289 1027843 184 x
SynWH7803_1700 1554607 1554939 110 x 硫转移酶家族
SynWH7803_1701 1554899 1555576 225 T 硫转移酶家族

2.2 BAD01932-33和BAA18559-New ORF7系统的毒素具有抑菌活性

实验结果表明, 过表达集胞藻PCC6803毒素-抗毒素系统BAD01932-33和BAA18559-New ORF7的毒素BAD01932和New ORF7时会对大肠杆菌BW25113造成明显的生长抑制。而诱导表达合体 BAD01932-1933和BAA18559-New ORF7可以解除毒素BAD01932和New ORF7的生长抑制毒性(图2a、b)。因此, BAD01932-1933和BAA18559-New ORF7与预测结果相符, 组成毒素-抗毒素系统。而选取的其余5对毒素-抗毒素系统在含有50μg·mL-1卡那霉素和0.3%L-阿拉伯糖LB平板均未表现出明显的毒性(图2c—g)。
图2 在大肠杆菌BW25113 中鉴定所选7对毒素-抗毒素系统的毒性

a、b分别为BAD01932-33和BAA18559-New ORF7毒素-抗毒素系统的生长曲线(OD600)和添加诱导剂4h后各重组菌株的菌落形成单位; c—g分别为BAD01871-72、BAD01997-98、BAA17887、SynWH7803_1121-22 和 SynWH7803_1700-01的毒性验证结果

Fig. 2 Identification of seven candidate TA systems in E. coli BW25113.

a-b: The growth curve and colony-forming unit of BAD01932-33 (a) and BAA18559-New ORF7 (b) TA systems. c-g: Toxicity test of BAD01871-72 (c), BAD01997-98 (d), BAA1788 (e), SynWH7803_1121-22 (f), and SynWH7803_1700-01 (g)

进行毒性鉴定的7对毒素-抗毒素系统中, BAD01932-1933和BAA18559-New ORF7能够在大肠杆菌BW25113中表现出毒性, 说明大肠杆菌中存在这两个系统与原宿主中毒素蛋白相同或相近的底物。另外5对系统没有表现出异源宿主的毒性, 可能的原因是大肠杆菌中不存在这几个系统的底物, 也有可能是这几个系统在大肠杆菌中不能表达, 所以仍需要在蓝细菌宿主中进一步确认。

2.3 BAD01932-33具有维持质粒稳定性的生理功能

毒素-抗毒素系统具有维持质粒稳定性的生理功能在 1986 年被揭示(Gerdes et al, 1986)。BAD01932-33 分布于集胞藻PCC6803的质粒上, 推测可能与质粒稳定性的维持有关。为了验证该设想, 我们将 BAD01932-33构建至pUC19质粒上, 在E.coli进行质粒稳定性测定。结果表明, 传代48h后pUC19质粒丢失95%, 而带有BAD01932-333的pUC19质粒在传代72h后仍有 80% 细菌宿主携带pUC19质粒(图3)。这说明BAD01932-33能够明显增加pUC19在E. coli中的稳定性。
图3 毒素-抗毒素系统BAD01932-33质粒(pUC19)稳定性曲线

Fig. 3 Plasmid (pUC19) stability of BAD01932-33 TA system

2.4 BAD01932和New ORF7与同家族蛋白具有相似催化机制

鉴于选取的7对TA中BAD01932-33和BAA18559-New ORF7毒素蛋白具有细胞毒性, 我们对其蛋白进行结构域和功能分析。BAD01932的分析结果为GNAT家族毒素蛋白。该蛋白家族目前研究得较为透彻的成员包括: 沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的TacAT系统(Cheverton et al, 2016), 福氏志贺菌(Shigella flexneri)的GmvAT系统(McVicker et al, 2017), 肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC) O157: H7的AtaRT系统(Jurėnas et al, 2017), 肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumonia)的KacAT系统(Qian et al, 2019)和大肠杆菌的ItaRT系统(Wilcox et al, 2018)。我们将 BAD01932与AtaRT、TacAT、KacAT、ItaRT和GmvAT系统中毒素蛋白的序列比对, 结果表明 BAD01932与其他同类型的毒素成员具有一定的序列相似度, 较为保守, 其中与AtaT的相似度最高(33%)。该家族中发挥重要的底物识别和催化功能的氨基酸残基为Tyr82、Arg92、Gly105和Tyr141, 保守性高, 说明可能具有类似的催化机制(图4a)。
图4 BAD01932 所属 GNAT家族毒素蛋白(a) 和 New ORF7 所属 HicAB 家族毒素蛋白(b)同源性及活性位点保守性分析红色箭头指示的为蛋白发挥活性比较重要的保守残基

Fig. 4 Protein sequences alignment and active sites analysis of BAD01932 (a) and New ORF7 (b). Red arrows indicate the conserved residues that are important for enzymatic activity

New ORF7预测为HicAB家族的毒素蛋白, 该蛋白家族研究得较为透彻的成员包括鼠疫杆菌(Yersinia Pestis)(Goulard et al, 2010)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(Butt et al, 2014)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Kim et al, 2018)和大肠杆菌的 HicAB 系统(Jørgensen et al, 2009)。这四个物种的抗毒素蛋白HicB单体以及HicAB复合物的蛋白结构都已被解析, 但仅有类鼻疽伯克霍尔德菌的毒素蛋白HicA的蛋白结构得到解析, 因此毒素蛋白HicA的催化机制并不明确。鼠疫杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、肺炎链球菌和大肠杆菌的HicAB系统HicA 蛋白都属于同一个蛋白家族(PF07927)全长约为60个氨基酸残基。本文新注释的New ORF7所编码的HicA蛋白与类鼻疽伯克霍尔德菌的HicA蛋白相似度最高(20%), 较为特殊的是New ORF7所编码的HicA蛋白的N端多出约50个氨基酸。尽管如此Gly78和His80这两个在同家族成员的催化过程起重要作用的残基仍然较为保守, 这也说明它们可能具有相似的催化机制(图4b)。

2.5 BAD01932-33和BAA18559-New ORF7系统蛋白的表达与纯化

为了进一步验证BAD01932-33和BAA18559- New ORF7这两对TA系统中毒素和抗毒素蛋白的相互作用情况, 我们采用pET28b(+)载体进行两对系统的毒素、抗毒素单独以及合体的异源表达和纯化。由于这两个系统的毒素蛋白对宿主菌株有较强的毒性作用, 我们进行了大量尝试, 均未成功构建野生型的表达载体。因此实验中只尝试了抗毒素单独以及与毒素共表达的情况。实验结果表明, BAD01932-33的抗毒素蛋白BAD01933单独表达以及毒素-抗毒素共表达菌株在加入IPTG诱导之后都有目的蛋白分子量对应大小的过表达条带产生(图5a泳道2和图4b泳道2), 高浓度咪唑洗脱样品中,只有单独表达抗毒素蛋白的载体有极少量可溶性蛋白能够被洗脱(图5a泳道6和7)。而绝大部分的抗毒素蛋白以及毒素和抗毒素共表达蛋白几乎全部在包涵体中(图5a泳道4和图5b泳道4)。对诱导剂浓度、诱导时长和诱导温度的改变以及进行毒素和抗毒素的密码子优化都未能提高可溶性蛋白量。
图5 采用大肠杆菌BL21(DE3)表达和纯化GNAT家族抗毒素蛋白BAD01933 (a)、毒素BAD01932与抗毒素合体(b)、HicAB家族抗毒素蛋白BAA18559(c)和毒素New ORF7与抗毒素合体(d)

M: 蛋白marker; 1: 未诱导全菌液; 2: 诱导后全菌液; 3: 细菌超声破碎后离心所得到上清液; 4: 包涵体; 5: 上清液流穿Ni柱未结合的部分; 6-7: 蛋白洗脱管 1 和2 号

Fig. 5 Expression and purification of BAD01932-BAD01933 (a, b) and BAA18559- New ORF7 antitoxin and TA complex (c, d).

M: Protein marker; 1: whole cell lysate of uninduced cells; 2: whole cell lysate of induced cells; 3: the supernatant of ultrasonication after centrifugation; 4: the inclusion body after ultrasonication and centrifugation; 5: the unbound part from Ni-NTA column; 6-7: the eluted fractions from the Ni-NTA column

BAA18559-New ORF7 TA系统中抗毒素蛋白 BAA18559单独表达菌株在加入诱导剂IPTG后有过表达条带(图5c泳道2), 但是仍以包涵体的形式存在(图5c泳道4), 以高浓度咪唑进行洗脱时仍没有得到抗毒素蛋白BAA18559(图5c泳道6和7)。而毒素蛋白New ORF7和抗毒素蛋白BAA18559 共表达的菌株在加入诱导剂 IPTG 后都没有出现明显的过表达条带(图5d泳道2)。这种情况的出现的原因可能是BAD01932-33和BAA18559-New ORF7 这两对TA系统的蛋白在大肠杆菌中表达时不能正确折叠, 或者是这些蛋白的溶解度本身偏低。

3 讨论

本文采用生物信息学方法预测了淡水蓝细菌集胞藻PCC6803和海水蓝细菌聚球藻WH7803的毒素-抗毒素系统。预测结果表明, 集胞藻PCC6803具有51对潜在的TA, 而聚球藻WH7803具有10对TA。出现这种差别的原因可能与两种细菌所生存的环境的复杂性有关, 集胞藻PCC6803所生活的淡水中的微生物种类和数量较多, 水体随季节变化存在较大温差, 营养成分和种类受人类活动影响大, 而聚球藻WH7803所生活的海洋环境的温度和营养波动较小。而TA系统的存在有利于菌体抵抗逆境和复杂生存环境, 因此更有利于集胞藻PCC6803适应复杂多变的生态环境。由于本文仅分别预测分析了一种淡水蓝细菌和海水蓝细菌, 因此TA系统在淡水和海水蓝细菌基因组上的分布差异性还需要后续的研究分析。
VapBC (Vap: virulence associated protein, 毒力相关蛋白)类型的TA系统在集胞藻PCC6803所预测的51对TA系统分布最高, 为23对。在原核生物中, VapC家族成员大多数具有PIN结构域, 并在许多原核生物的基因组中大量存在, 如结核杆菌目前已发现超过48对(Pandey et al, 2005; Ramage et al, 2009)。VapC家族成员众多, 但很多成员的底物目前并不清楚。已有的研究表明, 沙门氏菌、志贺氏菌和钩端螺旋体(Leptospira interrogans)中的VapC蛋白能切割起始tRNAfMet, 并且均从特定的位点切割反密码子环。所以VapC能够抑制细胞蛋白翻译功能的起始(Winther et al, 2011; Lopes et al, 2014)。然而VapC家族成员并非所有成员都通过切割tRNA抑制蛋白的翻译, 例如结核杆菌的VapC20能通过切割23S rRNA中保守的Sarcin-Ricin环(SRL)抑制蛋白的翻译(Winther et al, 2013)。
本文选取的毒素蛋白BAD01932和New ORF7在大肠杆菌BW25113异源表达时具有细胞毒性。其中BAD01932-33位于集胞藻PCC6803的质粒上, 属于一类新型Ⅱ型TA系统。本文研究发现, BAD01932-33能够明显增加pUC19在E. coli 中的稳定性。其毒素蛋白具有GNAT折叠, 抗毒素蛋白具有Ribbon-Helix-Helix (RHH)折叠。GCN5-related N-acetyl-transferase (GNAT)来源于酵母菌GCN5 (general control non-depressible 5), 是一种组氨酸乙酰转移酶。在乙酰化反应中, 这类酶将乙酰-CoA作为乙酰基供体。GNAT超家族能够对包括蛋白质、小分子代谢物和抗生素在内的一系列底物进行乙酰化修饰, 例如赋予细菌对氨基糖苷类药物产生抗性的氨基糖苷N-乙酰基转移酶就是第一个被鉴定的GNAT超家族成员。肠出血性大肠杆菌O157: H7的AtaT(Jurėnas et al, 2017)和沙门氏菌的TacT(Cheverton et al, 2016)这两种GNAT毒素的分子机理研究较为透彻, AtaT通过将乙酰-CoA的乙酰基转移到Met-tRNAfMet从而抑制翻译的进行。其他GNAT家族的毒素成员作用机制类似, 不同的是作用的tRNA种类存在区别。
BAA18559-New ORF7属于HicAB类, 也是一种Ⅱ型TA系统。最早发现于流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae) 的菌毛基因簇(hif)当中,因此被命名为HicAB (Haemophilus influenza contiguous)。hicAB基因排列有一个显著的特点: 毒素基因hicA位于抗毒素基因hicB的前面, 这与大多数TA系统的基因排列顺序相反。hicAB基因在细菌中分布广泛, 常常多对存在, 具有多样性。抗毒素蛋白HicB通常含有RNase H样折叠(典型特征包含β1β2β3α1β4α2模块), 而HicA蛋白通常包含结合双链RNA的结构域。第一对由实验证实的HicAB成员位于大肠杆菌K-12基因组中(Jørgensen et al, 2009)。其HicA蛋白是核糖体不依赖型的RNA切割酶, 能够对胞内的mRNA和tmRNA酶切, 进而阻断翻译过程的进行, 具有抑菌功能。而HicB并没有表现出细胞毒性, 反而可以完全抑制HicA的毒性。对HicAB家族的后续研究发现, 其主要的生理功能包括维持菌株毒力(Goulard et al, 2010), 介导“持留菌”的形成(Butt et al, 2014)和协助菌体适应细胞外应激(Jørgensen et al, 2009)。
Ⅱ型TA的毒素蛋白和抗毒素蛋白之间存在紧密的相互作用。抗毒素蛋白要与毒素蛋白的结合底物竞争, 所以毒素-抗毒素之间的相互作用一般强于毒素-底物之间的相互作用。毒素蛋白一般具有以下特点: 比抗毒素蛋白稳定、水溶性不高和对宿主菌有毒性作用。而抗毒素分子的特点为: 较不稳定、极易降解、水溶性较毒素好以及能够抑制毒素分子对宿主菌的毒性作用。因此在体外进行功能研究的时候要充分考虑毒素和抗毒素两种分子的特性。本文采用大肠杆菌表达系统异源表达的BAD01932-33和BAA18559-New ORF7两个系统的蛋白时发现, BAD01932-33系统单独表达抗毒素时仅有少量可溶性蛋白, 表达合体时两种蛋白均在包涵体中, 说明蛋白的水溶性较低是该系统异源表达纯化的制约因素。而BAA18559- NewORF7单独表达抗毒素时蛋白全部在包涵体中, 表达合体时也只有抗毒素有诱导带出现, 毒素蛋白甚至没有诱导带产生, 可能是因为HicA蛋白的毒性太强, 导致加入诱导剂之后出现基因突变而不能正常表达。
本文分别以集胞藻PCC6803和聚球藻WH7803为研究对象, 通过生物信息学的方法预测了二者基因组和质粒上的毒素-抗毒素系统, 并通过实验验证了其中7对潜在的系统。本文的研究结果为后续蓝细菌毒素-抗毒素系统功能和应用研究的开展提供了理论依据。

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