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热带海洋学报 >

2022 , Vol. 41 >Issue 5: 180 - 188

DOI: https://doi.org/10.11978/2021095

海洋生物学

马氏珠母贝异速生长个体对免疫刺激的差异响应

  • 许瀚之 , 1, 2 ,
  • 张华 1 ,
  • 熊盼盼 1, 2 ,
  • 何毛贤 , 1
展开
  • 1.中国科学院南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省应用海洋生物学重点实验室, 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
何毛贤。email:

许瀚之(1995—), 男, 山东省高密市人, 硕士研究生, 从事马氏珠母贝分子遗传育种研究。email:

Copy editor: 殷波

收稿日期: 2021-07-27

  修回日期: 2021-12-31

  网络出版日期: 2022-01-12

基金资助

国家贝类产业技术体系项目(CARS-49)

国家自然科学基金青年科学基金(42006106)

广东省自然科学基金(2020A1515011434)

广东省科技计划(2020B1212060058)

收起

Differential responses of allometric individuals to immune stimuli in Pinctada fucata martensii

  • XU Hanzhi , 1, 2 ,
  • ZHANG Hua 1 ,
  • XIONG Panpan 1, 2 ,
  • HE Maoxian , 1
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
HE Maoxian. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2021-07-27

  Revised date: 2021-12-31

  Online published: 2022-01-12

Supported by

National Shellfish Industry Technology System Project(CARS-49)

National Natural Science Foundation of China(42006106)

Natural Science Foundation of Guangdong Province(2020A1515011434)

Science and Technology Program of Guangdong Province(2020B1212060058)

Fold

摘要

文章对马氏珠母贝的异速生长个体的免疫性能进行了研究, 比较了极大和极小个体在免疫刺激后免疫相关基因(CuZn-SOD1、CuZn-SDO2、LAMP1、JRL和Rab7)的表达量以及3种免疫酶(SOD、CAT、AKP)活性的变化情况, 分析异速生长个体对免疫刺激的差异响应。结果显示, 所检测的与免疫相关的基因和免疫酶对免疫刺激均有应答。极小个体的LAMP1、CuZn-SOD1和CuZn-SOD2基因的相对表达量以及CAT和AKP活性的变化幅度均高于极大个体, 而JRL和Rab7基因的相对表达量以及SOD活性的变化幅度低于极大个体, 其中极小个体JRL基因的基础表达量远高于极大个体, 可能导致其变化幅度较小。研究结果表明, 极小个体对外界胁迫的反应更加强烈, 具有较强的免疫响应能力。

关键词： 马氏珠母贝; 异速生长; 免疫刺激; 基因表达; 酶活

本文引用格式

许瀚之 , 张华 , 熊盼盼 , 何毛贤 . 马氏珠母贝异速生长个体对免疫刺激的差异响应[J]. 热带海洋学报, 2022 , 41(5) : 180 -188 . DOI: 10.11978/2021095

Abstract

In this study, we investigated the immune performance of allometric individuals of the pearl oyster, Pinctada fucata martensii, compared the expression of immune-related genes (CuZn-SOD1, CuZn-SDO2, LAMP1, JRL, and Rab7) and changes in the activities of three immune enzymes (SOD, AKP and CAT) in large and small individuals after immune stimulation, and analyzed the differential response of allometric individuals to immune stimulation. The results showed that the immune-related genes and immune enzymes all responded to the immune stimuli. The relative expression levels of LAMP1, CuZn-SOD1 and CuZn-SOD2 genes and the changes of CAT and AKP activities were higher in small individuals than those in large individuals, while the relative expression levels of JRL and Rab7 genes and the changes of SOD activity were lower than those in large individuals. The basal expression of the JRL gene was much higher in the small individuals than that in the large ones, which may result in a smaller variation. These results indicated that the small individuals were more responsive to external stresses and had stronger immune response ability.

Key words： Pinctada fucata martensii; allometric individuals; immune stimulation; gene expression; enzyme activity

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)又称合浦珠母贝, 是中国人工海水珍珠养殖的主要母贝。近年来, 由于养殖生态环境不断恶化, 以及高密度集约化养殖模式的推行, 马氏珠母贝对病原菌侵入和环境胁迫的抵抗力大大下降, 大规模死亡的现象时有发生, 特别是近两年, 湛江流沙湾海区发生了马氏珠母贝规模性死亡事件。目前尚没有十分有效的解决办法, 海水珍珠养殖业的健康和可持续发展正遭受严重威胁。
在养殖生产中, 我们发现在同一马氏珠母贝养殖群体中, 小型个体的死亡较大型个体少。在前期工作中, Shi等(2014)通过对马氏珠母贝壳长性状极端值个体的转录组学分析, 发现与免疫相关的差异基因主要在小个体中上调且表达量显著高于大个体, 这表明不同规格个体的免疫能力或机制存在差异。因此, 我们推测大型个体分配较多的能量用于生长发育, 导致其抗逆抗病力下降; 小型个体则将大部分能量分配于抗逆抗性, 导致其生长发育滞后, 但上述推测还缺乏相关的试验证据。
国内针对马氏珠母贝的不同性状或者不同家系的免疫能力开展了一定研究(陈丹群, 2009; 孙宗红 等, 2015; 王哲 等, 2019; 魏海军 等, 2020), 但对异速生长个体的免疫响应能力的比较还未见有报道。本研究针对异速个体展开了免疫刺激试验, 检测铜锌超氧化物歧化酶基因(CuZn-Superoxide dismutase1, CuZn-SOD1和CuZn-Superoxide dismutase2, CuZn-SOD2)、Jacalin类凝集素基因(jacalin-related lectins, JRL)、溶酶体相关膜蛋白1基因(lysosomal associated membrane protein 1, LAMP1)和Rab7基因共5种免疫相关基因的表达, 以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)共3种免疫相关酶的活性, 比较异速生长个体响应免疫刺激的差异, 为阐释马氏珠母贝生长与抗病力之间的关系提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用马氏珠母贝为马氏珠母贝深圳群体(1龄贝), 养殖于深圳大鹏澳海区。首先选取200只壳型规整、活力良好的马氏珠母贝个体, 用数显游标卡尺测量每只贝的壳长, 排位前20%的个体作为极大个体组(LG)(壳长52.16±3.25mm, 体重25.86±2.03g), 后20%的个体作为极小个体组(SG)(壳长33.31± 3.05mm, 体重11.85±1.34g)。

1.2 免疫刺激试验

免疫刺激试验分为3组: LPS组、Poly(I:C)组和PBS组, 其中LPS组和Poly(I:C)组为实验组, PBS组为对照组。按照个体的重量, 向肌肉组织中注射1μg·μL-1的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)]和磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS), LG组每个个体注射100μL, SG组每个个体注射40mL。注射完成后, 将试验贝养殖在室内, 分别在6h、12h、24h、48h和72h从每组中随机取9只贝进行取样, 每3只贝的消化腺组织混合作为1个生物学重复, 组织样品置于液氮中保存。

1.3 总RNA提取和质量检测

使用美基生物公司的总RNA提取试剂盒HiPure Universal RNA Kit进行总RNA提取, 使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA的完整性, 采用紫外分光光度法测定RNA样品的浓度和纯度。

1.4 实时荧光定量PCR

使用Toyobo公司的逆转录试剂盒ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix With gDNA Remover进行cDNA第一链合成; 使用Toyobo公司的SYBR® Green Realtime PCR Master Mix和Light Cycler 480 (Roche, Switzerland)进行实时荧光定量分析, 18S作为内参基因。反应体系为: SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 5μL, 双蒸馏水3.4μL, cDNA 模板1μL, 上下游引物各0.3μL (引物浓度10μmol·L-1), 共10μL; 反应程序为: 95℃预变性10min, 95℃ 10s, 56℃ 15s, 72℃ 15s, 45个循环; 18S作为内参基因。所选取的与免疫相关的基因来源于本实验室的异速生长个体转录本, 各基因的引物信息见表1。
表1 实时荧光定量引物

Tab. 1 Real-time quantitative primers

引物名称 引物序列
CuZn-SOD1-F ACAAATAATTCGGCATCCTA
CuZn-SOD1-R TAGAGCCTGGTTTGGTGTAT
CuZn-SOD2-F ATAGGTTCAAACGGAGGAGG
CuZn-SOD2-R TGGTCGCAAATGGTTGTATT
JRL-F ATAGGTTCAAACGGAGGAGG
JRL-R TGGTCGCAAATGGTTGTATT
LAMP-1F TGCCTGTCACAATAATAACC
LAMP1-R AGACTCAAAGTAAGACCACCT
Rab7-F GAGTTTAGGCGTGGCTTTCT
Rab7-R ATCCCTTGGACTTGCTTGTAT
LAMP2-F ACGAAAAAAAGGTTTGAGAGACG
LAMP2-R AGATACTTGATGGCCTGTTG
18S-F CGTTTCAACAAGACGCCAGTAG
18S-R ACGAAAAAAAGGTTTGAGAGACG

1.5 免疫酶活测定

准确称取消化腺组织0.1g于4℃的生理盐水中漂洗, 除去组织液, 滤纸拭干, 放入5mL的匀浆管中。按重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入9倍体积的0.86%氯化钠溶液于匀浆管中。冰水浴条件下, 用眼科手术剪尽快剪碎组织块。使用内切式组织匀浆机, 10000r·min-1, 每次10s, 间隙15s, 连续5次, 在冰水中研磨制成10%组织匀浆。取少量组织匀浆作涂片, 显微镜下观察细胞是否破碎, 若没有则可延长匀浆时间。
使用南京建成生化试剂公司生产的试剂盒测定SOD、CAT和AKP 3项免疫酶活指标, 具体测定方法参照试剂盒说明书进行。SOD活性定义为: 每毫克蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD活力单位(单位: U); CAT活性定义为: 每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2的量为一个活力单位(单位: U); ACP活性定义为: 每克蛋白在37℃与基质作用30min产生1mg酚为一个活力单位(单位: U)。

1.6 数据统计分析

采用相对定量法(2-ΔΔCT法)分析qRT-PCR数据; 采用单因素方差的方法进行数据显著性分析; Tukey法进行组间差异显著性分析, 置信区间为95%; 数据以均值±标准差(SD)表示, p<0.05时具有统计学意义。

2 试验结果

2.1 免疫刺激后免疫相关基因在极大、极小个体中的表达模式

2.1.1 CuZn-SOD1基因

LPS刺激后, SG和LG的CuZn-SOD1基因的mRNA相对表达量总体呈现先升高后降低的表达模式, 其中, 在SG中CuZn-SOD1基因的mRNA相对表达量在24h达到最大值, 在LG中, 6h达到峰值。在SG中, CuZn-SOD1基因的mRNA相对表达量在6h显著下降(p<0.05), 约为对照组的0.4倍; 12h恢复到对照组水平; 24h显著增加(p<0.05), 约为对照组2.42倍; 48h迅速下降并低于对照组水平; 72h再次上升, 但与对照组无显著性差异。在LG中, CuZn-SOD1基因的相对表达量在6h显著性上升(p<0.05), 约为对照组的2倍, 12h开始下降, 与对照组无显著性差异, 24h恢复到对照组水平并趋于稳定。
Poly(I:C)刺激后, SG的CuZn-SOD1基因的mRNA相对表达量呈现先下降后上升再下降的波动变化趋势, CuZn-SOD1基因mRNA相对表达量在6h显著下降(p<0.05), 约为对照组的0.6倍; 12h开始上升; 24h显著高于对照组(p<0.05), 约为对照组的3.65倍; 48h开始下降; 72h恢复到对照组水平(图1a); 在LG中, CuZn-SOD1基因的相对表达量在72h内无显著性变化(图1b)。
图1 免疫刺激后极小个体组(a、c、e、g、i)和极大个体组(b、d、f、h、j)中免疫相关基因CuZn-SOD1 (a、b)、Rab7 (c、d)、LAMP1 (e、f)、JRL (g、h)和CuZn-SOD2 (i、j)的mRNA相对表达量

*表示p<0.05

Fig. 1 Relative mRNA expression of immune-related genes after immune stimulation in the SG and LG. * indicates p < 0.05

2.1.2 Rab7基因

LPS刺激后, SG和LG的Rab7基因响应相对滞后, 分别在48h和24h才是显著上升。在SG中, Rab7基因mRNA的相对表达量在24h内无显著性差异, 在48h突然显著上升(p<0.05), 表达量约为对照组的2倍, 72h迅速下降至对照组水平; 在LG中, LPS刺激后, Rab7基因mRNA的相对表达量在24h显著上升(p<0.05), 表达量约为对照组的4.9倍, 48h开始下降, 与对照组无显著差异, 72h下降至对照组水平。
Poly(I:C)刺激后, SG的Rab7基因mRNA的相对表达量在72h内均无显著性变化(图1c), 在LG中, Poly(I:C)刺激后, Rab7基因的相对表达量在24h显著上升(p<0.05), 表达量约为对照组的4.8倍, 48h开始下降, 72h下降至低于对照组水平(图1d)。

2.1.3 LAMP1基因

LPS刺激后, SG的LAMP1基因的相对表达量在12h内无显著性差异, 24h开始显著上升并持续到48h (p<0.05), 表达量分别约为对照组的2倍和1.9倍, 随后迅速下降, 到72h已经基本无表达; 在LG中, LAMP1基因的相对表达量在72h均无显著性变化。
Poly(I:C)刺激后, SG的LAMP1基因mRNA的相对表达量在72h内均无显著性变化(图1e), 而在LG中, LAMP1基因的相对表达量在12h内无显著性变化, 24h开始显著下降, 约为对照组的0.6倍, 而在48h突然显著上升(p<0.05), 相对表达量约为对照组的1.7倍, 72h再次显著下降(p<0.05), 表达量约为对照组的0.46倍(图1f)。

2.1.4 JRL基因

LPS刺激后, SG和LG的JRL基因mRNA的相对表达量呈现先下降后升高的特点, 在SG中, JRL基因mRNA的相对表达量在12h开始上升, 而在LG中, 则在24h开始上升。在SG中, LPS刺激后, JRL基因的mRNA相对表达量在12h爆发式增加(p<0.05), 约为对照组的14.9倍, 24h开始下降但仍显著高于对照组(p<0.05), 约为对照组的3.5倍, 48h下降至对照组水平并趋于稳定; 在LG中, LPS刺激后, JRL基因mRNA的相对表达量在6h显著下降(p<0.05), 约为对照组的0.23倍, 12h恢复到对照组水平, 24h开始显著上升并持续到72h (p<0.05), 24h、48h和72h的表达量约分别为对照的3.9倍、18.2倍和2.5倍。
Poly(I:C)刺激后, SG和LG的JRL表达模式与LPS刺激后的类似。在SG中, JRL基因的mRNA相对表达量12h显著增加(p<0.05), 约为对照组的5.7倍, 24h开始下降但仍显著高于对照组(p<0.05), 约为对照组的3.9倍, 48h恢复至对照组水平并趋于稳定(图1g); 在LG中, JRL基因mRNA的相对表达量在24h开始显著上升并维持到48h (p<0.05), 24h和48h表达量分别约为对照组的3.7倍和6倍, 72h迅速显著降低, 约为对照组的0.2倍(图1h)。

2.1.5 CuZn-SOD2基因

LPS刺激后, SG和LG的CuZn-SOD2基因mRNA的相对表达量均呈现先升高后降低再升高再降低的波动变化趋势。在SG中, CuZn-SOD2基因mRNA的相对表达量在6h开始显著上升(p<0.05), 表达量约为对照组的5.5倍, 12h有所下降, 24h到48h再次显著上升(p<0.05), 24h和48h表达量约为对照的4.17倍和3.27倍, 72h下降至低于对照组水平; 在LG中, CuZn-SOD2基因mRNA的相对表达量在6h显著上升(p<0.05), 约为对照组的3.68倍, 12h迅速下降至低于对照组, 24h再次上升, 48h显著高于对照组(p<0.05), 表达量约为对照组3.1倍, 72h恢复至对照组水平。
Poly(I:C)刺激后, SG的CuZn-SOD2基因mRNA的相对表达量呈现先持续升高后开始下降的趋势, 而在LG中, CuZn-SOD2基因mRNA的相对表达趋势和LPS组相似。在SG中, CuZn-SOD2基因的相对表达量在6h开始显著上升并持续到24h (p<0.05), 6h、12h和24h表达量分别为对照组的5.2倍、4.8倍和5.4倍, 48h迅速恢复至对照组水平并趋于稳定(图1i); 在LG中, CuZn-SOD2基因的相对表达量的表达量在6h显著性上升(p<0.05), 约为对照组的4.27倍, 12h迅速下降到对照组水平, 直到48h再次显著性上升(p<0.05), 约为对照组的3.1倍, 72h恢复至对照组水平(图1j)。

2.2 免疫刺激后极大、极小个体免疫酶活力的变化

SOD: LPS刺激后, SG的SOD活力在48h才开始上升, 而在LG中, SOD活力则在24h开始上升。在SG中, SOD活力在12h内无显著变化, 24h活力显著上升(p<0.05), 上升了约12.8%, 48h恢复到对照组水平并趋于稳定; 在LG中, SOD活力在12h内无显著性变化, 24h活力显著上升并持续到48h (p<0.05), 分别上升了约9.4%和19.4%, 72h恢复至对照组水平。Poly(I:C)刺激后, SG的SOD活力在72h内无显著变化(图2a); 在LG中, SOD活力在12h内无显著变化, 24h活力显著上升(p<0.05), 上升了约17.7%, 随后恢复至对照组水平并趋于稳定(图2b)。
图2 免疫刺激后极小个体组(a、c、e)和极大个体组(b、d、f)中免疫酶SOD (a、b)、AKP (c、d)和CAT (e、f)活力的相对变化情况

*表示p<0.05

Fig. 2 Changes in the immune enzymes activity after immune stimulate in SG and LG. * indicates p < 0.05

AKP: LPS刺激后, SG和LG的AKP活力均呈现先降低后升高的趋势, 表现出一定的滞后性。在SG中, AKP活力在12h显著下降(p<0.05), 下降了约50.1%, 24h恢复到对照组水平, 直到72h显著上升(p<0.05), 上升了约108%。在LG中, AKP活力在12h显著下降(p< 0.05), 下降了约33.1%, 随后在24h开始逐级上升, 72h显著高于对照组(p<0.05), 上升了约73.4%。Poly(I:C)刺激后, SG的AKP活力变化趋势与LPS组相似, 而在LG中, 则呈现先升高后降低的特点。在SG中, AKP酶活在6h和12h显著下降(p<0.05), 分别下降了约29.6%和18.1%, 随后开始逐级上升, 72h活力显著高于对照组(p<0.05), 上升了约180% (图2c); 在LG中, AKP活力在6h显著上升(p<0.05), 上升了约30.2%, 随后12h迅速显著下降(p<0.05), 下降了约16.7%, 24h恢复至对照组水平并趋于稳定(图2d)。
CAT: LPS刺激后, SG的CAT活力先爆发式增加, 随后呈现出下降、上升、下降的波动变化特点, 而在LG中, 则是先显著升高, 随后迅速持续性下降。在SG中, CAT活力在6h至12h显著上升(p<0.05), 上升了约24%和251%, 24h迅速显著下降(p<0.05), 下降了约12.7%, 48h再次显著上升(p<0.05), 上升了约14.8%, 72h再次迅速显著下降(p<0.05), 下降了约8.9%; 在LG中, CAT活力在6h至12h显著上升(p<0.05), 分别上升了124%和105%, 随后开始下降, 24h恢复至对照组水平, 48h和72h显著低于对照组(p<0.05), 下降了约5.7%和3.8%。Poly(I:C)刺激后, 在LG中, CAT活力在6h开始上升并一直维持到24h, 随后开始下降, SG的响应则相对滞后。在SG中, CAT活力在6h显著下降(p<0.05), 下降了约8.9%, 而在12h显著上升(p<0.05), 上升了约427%, 随后在24h开始下降, 72h显著低于对照组(p<0.05), 下降了约8.1% (图2e); 在LG中, CAT活力在6h至24h显著上升(p<0.05), 分别上升了约144%、37.8%和43.1%, 随后开始下降, 48h恢复到对照组水平, 72h显著低于对照组(p<0.05), 下降了约3% (图2f)。

3 讨论

近年来马氏珠母贝的大规模死亡问题已经引起了广泛重视, 目前普遍认为其死亡的原因是种质退化、环境污染、病原滋生及人工养殖缺乏管理等因素导致其抗逆能力下降所造成的。在养殖生产中, 经常发现一些大型个体的马氏珠母贝的死亡率高于小型个体。针对养殖过程中所出现的问题, 有必要对异速生长个体的抗逆、抗病能力进行比较研究, 为抗病选育和生长选育提供理论指导。Shi等(2014)通过对马氏珠母贝壳长性状极端值个体的转录组学分析, 发现差异基因主要富集在免疫相关的通路, 表明免疫系统与马氏珠母贝的生长速度之间存在着较大的联系, 因此本试验选取免疫器官作为研究对象。
LAMP1主要分布于溶酶体膜和内吞体膜, 是溶酶体膜蛋白的主要组成部分, 可用于检测自噬溶酶体的形成(Winchester, 2001; Solhaug et al, 2020)。CuZn-SOD是机体最重要的抗氧化因子之一, 具有清除有害的氧自由基、维持细胞膜结构的完整和稳定、抵御病原菌的侵害和增强抗病性的作用(Kogawa et al, 1999; Bastian et al, 2003; Bao et al, 2009; Yu et al, 2011)。JRL是凝集素超家族的成员之一, 是贝类抵御外界胁迫的重要免疫因子之一。Rab7作为吞噬作用的关键调控因子, 在抵御病原菌入侵宿主的过程中发挥重要作用, 是调控吞噬体成熟的关键因子。
试验中首先通过qRT-PCR检测了5种免疫基因(LAMP1、CuZn-SOD1、CuZn-SOD2、Rab7和JRL)在LPS和Poly(I:C)刺激后的mRNA相对表达量表达时序变化情况, 比较了极大、小个体之间的5种免疫基因表达模式的差异。免疫刺激后, LAMP1、CuZn-SOD1、CuZn-SOD2、Rab1和JRL基因在不同时段均有显著上调或下调表达, 说明所检测的基因对免疫刺激均有应答。其中, 极小个体的LAMP1、Cu-SOD1和Cu-SOD2基因相对表达量的变化幅度均高于极大个体, JRL和Rab7基因相对表达量的变化幅度低于极大个体, 其中极小个体JRL基因的基础表达量远高于极大个体, 可能导致其变化幅度较小。对比极小个体, 极大个体的Rab7基因对刺激的响应较为敏感。研究表明, Rab7基因不仅与免疫防御有关, 在调节胆固醇水平和甲状腺激素分泌的过程中也发挥重要作用(Bruckert et al, 2000; Croizet-Berger et al, 2002), 我们推测Rab7基因在马氏珠母贝各阶段的发育过程中所行使的功能可能不同, 在调控生长发育方面也发挥一定作用。目前, 有关Rab7基因在贝中的报道较少, 具体的功能机制还有待进一步研究。
通过测定AKP、SOD和CAT 3种主要抗逆酶活在免疫刺激后的变化情况, 进一步分析了极大、极小个体的抗逆能力的差异。AKP是贝类溶酶体酶的重要组成部分, 是机体主要的水解酶类之一, 在清除体外异物方面发挥了不可替代的作用(牟海津 等, 1999)。LPS刺激后, 极大、极小个体的AKP酶活的变化均呈现先降低后升高的趋势, 表现出一定的滞后性, 这可能与LPS会导致AKP的活力受到抑制导致免疫反应延后有关。Poly(I:C)刺激后, 极小个体AKP对胁迫的响应相对滞后。但是, LPS和Poly(I:C)刺激后, 极小个体AKP酶活的最大变化幅度均高于极大个体, 说明极小个体的体液免疫系统对异物的清除能力要强于极大个体。SOD和CAT是贝类的两种重要的抗氧化酶, 具有协同分解过氧化氢, 防止氧代谢产物对机体的损伤的作用, 是测定机体抗逆性的重要指标(刘婷婷 等, 2019; 张志东 等, 2019)。LPS刺激后, 极小个体CAT的活力首先爆发式增加,随后呈现出下降-上升-下降的波动变化特点。而在极大个体中, CAT活力则是先显著升高, 随后迅速持续性下降, 在较长的一段时间内难以恢复到正常水平。同时, 极小个体CAT活力在刺激后的变化幅度要高于极大个体。Poly(I:C)刺激后, 极小个体CAT对于胁迫的响应相对滞后, 但其活力的变化则呈现爆发式增长, 最大变化幅度大约是极大个体的3倍。然而, 在同等条件下, 极大个体SOD的变化幅度高于极小个体, 说明极大个体SOD的活力较强。
总体来说, 从免疫基因相对表达量和免疫酶活力的变化幅度两项指标分析, 极大、极小个体的相关免疫基因和免疫酶均能响应LPS和Poly(I:C)刺激, 而极小个体受到刺激后的变化幅度要远远高于极大个体, 对外界胁迫的反应更加强烈, 说明极小个体相对于极大个体具有更强的抗逆抗病能力。
动物在受到外界病原体刺激时, 会激活机体的免疫系统, 克服外界胁迫对机体造成的负面影响, 维持机体的内稳态。免疫系统激活时, 通过释放细胞因子作用于内分泌系统, 进而影响机体代谢和养分的重分配(Klasing et al, 2007)。在脊椎动物中, 当受到外界刺激时, 会激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)和交感神经系统, 促进其分泌糖皮质激素(glucocorticoids, GC)和儿茶酚胺(catecholamine, CA), 从而调节代谢活动的变化(Koolhaas et al, 1999; Dorshkind et al, 2001; Dunn et al, 2004)。GC和CA分泌的增加, 会引起机体分解代谢增加和合成代谢减少, 促进蛋白质和脂肪的降解、肝糖原分解以及应激蛋白合成, 从而改变动物的代谢和对营养物质的利用及需要, 将用于生长和骨骼肌蛋白质沉积的能量和营养分配于激活的免疫系统以抵御外界胁迫(Bonga, 1997)。贝类属于无脊椎动物, 结构相对简单, 主要通过促肾上腺皮质释放激素-促肾上腺皮质激素-生物胺轴(Ottaviani et al, 1997)神经内分泌轴而发挥作用, 但其对胁迫的反应过程与脊椎动物类似。在生产实践中, 人们观察到动物的生产性能在肮脏和洁净环境的饲养条件下存在较大差异。Dudley-Cash (1994)研究发现, 在清洁的环境中鸡的生长过程较为持续稳定, 而当处于肮脏的环境中时, 则会在多个时期出现生长下降的现象, 最终导致两种环境下肉鸡的生长出现显著性的差异。这是由于肮脏环境中存在大量的病原生物或大分子抗原, 这些病原因子会激活机体的免疫系统, 从而降低了组织生长需要或维持需要的比例, 将更多营养能量用于免疫防御中。C-重复基序结合因子(C-repeat binding factor, CBF)是植物中一种重要的抗逆因子, 在低温等非生物胁迫条件下, 通过结合在植物钙网织/脱水应答元件(calreticulin / dehydration responsive element, CRT/DRE)上激活冷诱导基因(cold-regulated gene, COR)的表达, 提高植物抗逆能力(Doherty et al, 2009; Kim et al, 2013)。CBF的表达水平的提高虽然可以增强植物的抗逆能力, 但会导致植物出现生长迟缓, 开花延迟以及产量降低的现象(Gilmour, 2000; Achard et al, 2008)。因此, 机体对免疫系统营养和能量的投入是以其负面生理影响为代价。综上所述, 从能量分配的角度, 我们推测马氏珠母贝小型个体对胁迫所产生的应激反应消耗了较多的能量, 从而影响了生长发育。下一步工作需从能量代谢方面去研究异速生长个体对免疫刺激或环境因子胁迫的响应差异。

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