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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 1: 56 - 65

DOI: https://doi.org/10.11978/2022032

海洋生物学

哈维弧菌对皱纹盘鲍不同组织内细菌群落结构的影响

  • 张婷 , 1 ,
  • 王瑞旋 , 2 ,
  • 孙敬锋 , 1 ,
  • 黄嘉健 3 ,
  • 林小植 2 ,
  • 周飞 2 ,
  • 马细兰 4
展开
  • 1.天津农学院水产学院, 天津 300384
  • 2.韩山师范学院生命科学与食品工程学院, 广东 潮州 521041
  • 3.广州大学生命科学学院, 广东 广州 510275
  • 4.惠州学院生命科学学院, 广东 惠州 516007
王瑞旋, email: ;
孙敬锋, email:

张婷(1997—), 女, 山东省聊城市人, 硕士研究生, 从事水生生物病害防治工作。email:

Copy editor: 姚衍桃

收稿日期: 2022-02-18

  修回日期: 2022-04-16

  网络出版日期: 2022-04-22

基金资助

国家自然科学基金项目(31902416)

广东省教育厅科研项目(2021ZDZX2066)

惠州学院科研创新群体培育项目(HZU201807)

收起

Effect of Vibrio harveyi on the quantity and bacterial communities in different tissues of Haliotis discus hannai

  • ZHANG Ting , 1 ,
  • WANG Ruixuan , 2 ,
  • SUN Jingfeng , 1 ,
  • HUANG Jiajian 3 ,
  • LIN Xiaozhi 2 ,
  • ZHOU Fei 2 ,
  • MA Xilan 4
Expand
  • 1. Fisheries College, Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384, China
  • 2. College of Life Sciences and Food Engineering, Hanshan Normal College, Chaozhou 521041, China
  • 3. School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510275, China
  • 4. School of Life Science, Huizhou University, Huizhou 516007, China
WANG Ruixuan, email: ;
SUN Jingfeng, email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2022-02-18

  Revised date: 2022-04-16

  Online published: 2022-04-22

Supported by

National Natural Science Foundation of China(31902416)

Research Project of Department of Education of Guangdong Province(2021ZDZX2066)

Huizhou College Research and Innovation Group Cultivation Project(HZU201807)

Fold

摘要

利用Illumina测序技术研究了皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)消化道、鳃和足部的菌群结构, 以及受哈维弧菌(Vibrio harveyi)胁迫后皱纹盘鲍消化道、鳃和足部肌肉菌群的动态变化。在皱纹盘鲍的消化道、鳃以及足部肌肉中检测到9个门的细菌, 其中变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门, 在3种组织中的占比分别为30.1%~64.4%、37.45%~70.6%和71.1%~85.9%; 拟杆菌门(Bacteroidetes, 5.53%~46.09%)、梭杆菌门(Fusobacteria, 4.43%~36.80%)及软壁菌门(Tenericutes, 0.60%~28.77%)为次优势菌门; 其余为放线菌门等5个菌门和一些未知类群。在属水平上, 皱纹盘鲍消化道内的优势菌属为支原体属(Mycoplasma, 15.85%~34.55%); 鳃组织中的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas, 54.81%); 足部肌肉中的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas, 44.83%~69.76%)和Curvibacter(21.24%), 此外还有Pelomonas等菌属。引入病原哈维弧菌后, 随着胁迫时间的延长, 皱纹盘鲍消化道内弧菌的数量由7.2×105cfu·mL-1升高至10.9×105cfu·mL-1; 血液内的弧菌数量由2×103cfu·mL-1升高至4.7×103cfu·mL-1; 在受哈维弧菌胁迫48h后足部肌肉中弧菌的数量下降, 其余时间点足部肌肉中弧菌的数量均增加。除了受哈维弧菌胁迫24h后消化道的Ace、Chao指数以及受胁迫96h后消化道的Ace指数高于对照组之外, 其余时间点鲍消化道、鳃及足部肌肉的Ace、Chao指数均低于对照组。除受哈维弧菌胁迫24h后的鲍消化道、足部肌肉试验组和胁迫96h后的鳃组织试验组中的Shannon指数高于对照组外, 其余时间点均低于对照组。引入哈维弧菌后, 消化道内拟杆菌门及梭杆菌门的丰度均增加; 鳃组织的变形菌门丰度下降, 梭杆菌门的丰度增加; 足部肌肉的变形菌门丰度增加, 拟杆菌门的丰度则下降。在属的水平上, 除了个别时间点外, 消化道内的假单胞菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、中度产丙酸菌属(Propionigenium)的丰度均增加, 支原体属丰度则下降; 鳃组织中的拟杆菌属、Kordia、中度产丙酸菌属的丰度均增加; 足部肌肉中假单胞菌属的丰度也增加。本研究从微生态角度探究常见的病原哈维弧菌对宿主体内菌群组成结构的影响, 为进一步研究宿主对病原哈维弧菌的响应机制及弧菌病的防治提供了新思路。

关键词： 哈维弧菌; 皱纹盘鲍; 细菌多样性

本文引用格式

张婷 , 王瑞旋 , 孙敬锋 , 黄嘉健 , 林小植 , 周飞 , 马细兰 . 哈维弧菌对皱纹盘鲍不同组织内细菌群落结构的影响[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(1) : 56 -65 . DOI: 10.11978/2022032

Abstract

The quantity and the bacterial communities in the digestive tract, gill, and foot of Haliotis discus hannai after infection with Vibrio harveyi were studied using Illumina sequencing technology. Results showed that nine phyla of bacteria were detected in the digestive tract, gills, and foot muscles of H.discus hannai, with Proteobacteria being the dominant phylum, accounting for 30.1%~64.4%, 37.45%~70.6%, and 71.1%~85.9% of the tissues. Bacteroidetes (5.53%~46.09%), Fusobacteria (4.43%~36.80%) and Tenericutes (0.60%~28.77%) were the sub-dominant phyla, while five other phyla including Actinobacteria and some unknown taxa were also detected. At the genus level, the dominant genera in the digestive tract of H.discus hannai were Mycoplasma (15.85%~34.55%) and in the gill was Pseudomonas (54.81%). The dominant genera in the foot muscles were Pseudomonas (44.83%~69.76%) and Curvibacter (21.24%). There were also genera such as Pelomonas. After the introduction of the pathogenic V. harveyi, the quantity of vibrios in the digestive tract increased from 7.2×105cfu·mL-1 to 10.9×105cfu·mL-1 as the stress time increased; the quantity of vibrio in the blood increased from 2×103cfu·mL-1 to 4.7×103cfu·mL-1; the quantity of vibrios in the foot muscle decreased after 48 h of V. harveyi stress and increased in the foot muscle at all other time. The Ace and Chao indices of the abalone digestive tract, gills, and foot muscles were lower than those of the control group at all time, except for the Ace and Chao indices of the abalone digestive tract after 24 h of V. harveyi stress and the Ace index of the digestive tract after 96 h of stress. The Shannon index was higher than the control in the digestive tract and foot at 24 h and in gill at 96h after V. harveyi infection and lower than the control at the remaining time. The introduction of V. harveyi increased the abundance of the Bacteroidetes as well as Fusobacteria in the digestive tract; the abundance of Proteobacteria in the gill decreased while that of Fusobacteria increased; the abundance of Proteobacteria in the foot muscles increased and that of Bacteroidetes decreased. At the genus level, the abundance of Pseudomonas, Bacteroides, and Propionibacterium increased and the abundance of Mycoplasma decreased in the digestive tract, except for a few time; the abundance of Bacteroides, Kordia, and Propionibacterium increased in gill; and the abundance of Pseudomonas increased in foot muscles. This study investigated the effect of the common pathogen V. harveyi on the quantity and the bacterial communities of the host flora from a microecological perspective and provided a new idea for further research on the response mechanism of the host to the pathogen V. harveyi and the prevention and control of vibriosis.

Keywords Vibrio harveyi; Haliotis discus hannai; bacterial diversity

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)属于软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目、鲍科、鲍属, 广泛分布于东亚, 是水产养殖中重要的贝类养殖品种。中国是世界上最重要的鲍生产国, 2013年中国鲍年产量达到110380t, 占全球水产养殖产量的88.8%(农业部渔业渔政管理局, 2014)。在过去10年中, 皱纹盘鲍养殖业发展迅速, 皱纹盘鲍已成为中国水产养殖的主导经济物种(柯才焕, 2013)。然而, 随着鲍养殖业的快速发展, 特别是高密度养殖技术的推广, 严重的细菌或病毒疾病的暴发成为困扰鲍养殖业可持续发展的主要因素(王若璇, 2017)。其中, 由哈维弧菌(Vibrio harveyi)引起的暴发性弧菌病是危害鲍生长发育最严重的疾病之一, 且哈维弧菌可感染多种鱼类、甲壳类、软体动物和珊瑚等(Luna et al, 2010; Cardinaud et al, 2014; Abu et al, 2020; Liu et al, 2021), 并导致水产动物大量死亡, 给水产养殖业带来巨大的经济损失(房沙沙 等, 2013)。哈维弧菌是一种革兰氏阴性菌, 普遍存在于海洋和河口水生生态系统中, 常在水产养殖中扮演条件致病菌的角色(Arunkumar et al, 2020), 它可以感染不同时期的水生动物, 使宿主活力降低、皮肤溃疡或死亡等(Wang et al, 2018)。目前已有对哈维弧菌的病原生物学和致病机制的研究报道(Deng et al, 2020; Zhang et al, 2021), 但很少有研究对受到哈维弧菌胁迫后的宿主体内细菌群落结构的变化开展评估。因此, 哈维弧菌对宿主体内细菌群落结构的影响尚不清楚。
本研究以皱纹盘鲍为研究对象, 以哈维弧菌对鲍进行人工浸泡攻毒, 并对受胁迫后的鲍体内细菌种群的组成进行了分析, 深入了解了哈维弧菌对鲍体内细菌群落结构的影响。本研究旨在为哈维弧菌与宿主的互作机理研究提供数据基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

侵染皱纹盘鲍所用的哈维弧菌分离自患脓疱病的鲍鱼(Wang et al, 2018)。50只皱纹盘鲍采自南海水产所深圳基地, 体重为5.5~12.41g, 体长为3.00~ 5.50cm。将皱纹盘鲍暂养在水缸中3~4d, 期间保证氧气充足, 之后选取30只状态良好的皱纹盘鲍进行实验。

1.2 实验分组

将选取的30只皱纹盘鲍分为试验组和对照组, 每组15只。试验组水缸内接种哈维弧菌, 终浓度为106~107cfu·mL-1; 同步设定空白对照组(即不接种哈维弧菌)。实验期间, 每天换水一次, 换水量为总体积的1/4~1/3(金珊 等, 2005)。试验周期为4d, 每天向水缸内接种适量的哈维弧菌, 使哈维弧菌的终浓度保持在106~107cfu·mL-1。每日不定时用溶氧仪测定水体的溶解氧含量和pH值2~3次。整个实验期间保持水温26℃、溶解氧浓度4.8~6.4mg·L-1、pH值7.5~7.9。

1.3 鲍体组织采集与弧菌计数

在受哈维弧菌胁迫后的24h、48h、96h这3个时间点, 分别从试验组和对照组中随机选取5只鲍, 用无菌生理盐水清洗干净, 抽取鲍的血液储存在-80℃冰箱中, 通过平板计数法对血液中弧菌的数目进行统计。同时, 分别取对照组和试验组鲍的消化道(D)、鳃(G)、足(F)各0.5g, 并置于灭菌后的匀浆器中, 加入1mL的生理盐水研磨成匀浆。以10-2、10-3的稀释度进行稀释, 分别涂布于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(thiosulfate citrate bile salts, TCBS)琼脂培养基上, 涂布后置于28℃恒温培养箱培养96h, 然后对TCBS培养基上的弧菌进行计数(李炳 等, 2020)。

1.4 菌群结构组成分析

利用细菌DNA提取试剂盒对皱纹盘鲍的消化道、鳃、足样品DNA进行抽提。使用细菌16 rDNA序列通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增, 扩增产物稀释10倍后作为模板, 用带GC-clamp的引物GM5F(5'-CGCC CGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAGCAG-3')和518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')进行巢氏PCR扩增。PCR反应体系为: 上、下游引物各1.5µL, 模板为1µL, 双蒸水21µL, Ex Taq酶25µL。PCR反应条件为: 94℃预变性5min, 94℃变性1min, 60℃退火1min, 72℃延伸2min, 25个循环; 72℃保持10min。选取受哈维弧菌胁迫后24h、48h、96h这3个时间点的鲍消化道、鳃、足组织样品以及对应时间点的空白对照样品, 以95%酒精保存后由上海美吉生物有限公司进行测序分析。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程, 通过连接“Y”字形接头、使用磁珠筛选去除接头自连片段、利用PCR扩增进行文库模板的富集以及加入氢氧化钠变性、产生单链DNA片段等方式, 将纯化后的扩增片段构建双端测序的文库, 并通过Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据处理

为了提高后续分析的质量与可靠性, 对于所得的原始数据进行高质量修剪, 以去除适配器污染物和低质量读数。对于质控处理后的高质量序列, 通过Usearch (vsesion 7.1; http://drive5.com/uparse/)进行可操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)的划分, 并通过R语言绘制种类组成图等。对照组和试验组的微生物多样性通过Ace、Chao、Shannon和Simpson多样性指数来表示, 并根据Coverage计算结果评估测序深度。各指数的计算公式参照唐嘉威等(2020)的方法。

2 结果与分析

2.1 哈维弧菌对皱纹盘鲍消化道、血液以及足部肌肉弧菌菌落总数的影响

皱纹盘鲍在对照组和试验组的水体中养殖96h期间, 消化道、血液以及足部肌肉中菌落总数的变化情况如图1所示。在试验组中, 消化道以及血液内的菌落总数变化趋势基本一致, 随着养殖时间的延长, 菌落总数逐渐增加(图1a、1b)。而足部肌肉菌落总数的变化情况与消化道以及血液明显不同, 足部肌肉的菌落数量呈现先急剧下降后缓慢上升的趋势(图1c)。试验组中, 皱纹盘鲍消化道内弧菌总数由养殖第24h的7.2×105cfu·mL-1升高到第48h的8.3×105cfu·mL-1, 再到96h的10.9×105cfu·mL-1。相对于对照组来说, 弧菌数量出现了明显的升高。在血液内也观察到了同样的现象, 受到哈维弧菌胁迫24h后弧菌总数为2×103cfu·mL-1, 48h时达到3×103cfu·mL-1, 在96h时达到最大值, 为4.7×103cfu·mL-1。而对照组的弧菌总数在24h为1.3×103cfu·mL-1, 48h为0.3×103cfu·mL-1, 在96h时达到3.3×103cfu·mL-1。这表明哈维弧菌增加了皱纹盘鲍血液内弧菌的数量。在试验组中的皱纹盘鲍足部肌肉弧菌总数呈现先下降后上升的趋势。对照组在第24h时没有检测到弧菌的存在, 在24~48h期间弧菌的数量呈现上升趋势, 48~96h期间弧菌数量保持恒定不变。但整个实验过程除了48h这个时间点, 试验组皱纹盘鲍足部肌肉分离出来的弧菌数目远高于对照组。综上所述, 在受到哈维弧菌胁迫后, 皱纹盘鲍体内的弧菌数量增加。
图1 受到哈维弧菌胁迫后皱纹盘鲍消化道(a)、血液(b)、足部肌肉(c)中弧菌数量的动态变化

Fig. 1 Dynamics of vibrio populations in the digestive tract (a), blood (b), and foot muscles (c) of the H. discus hannai after being treated by V. harveyi

2.2 引入哈维弧菌后皱纹盘鲍体内微生物种群结构的特征

本研究共获得对照组与试验组在养殖24h、48h 和96h后鲍消化道、鳃以及足部肌肉3个部位的微生物有效序列207932条。在高通量测序的过程中, 常会出现点突变以及高分子均聚物等测序错误, 所以对于得到的有效序列按照本文1.5节介绍的步骤, 筛选出高质量序列176759条(104845294bp), 按97%序列相似度进行OTU划分, 其详细信息见表1。
表1 对照组和试验组的微生物序列信息统计

Tab. 1 Microbial sequence information statistics for control and experimental groups

样本编号 有效序列数/条 优化序列数/条 可操作分类单位/个
D24- 8955 8306 7955
D24+ 9492 7336 7131
D48- 11704 10172 9873
D48+ 10900 9984 9621
D96- 10709 9890 9624
D96+ 9428 8599 8177
G24- 12658 10810 9628
G24+ 9801 8729 8353
G48- 13857 12173 11761
G48+ 12697 10108 9822
G96- 12527 9239 8785
G96+ 10654 8243 7986
F24- 11040 9683 9249
F24+ 8039 7348 6921
F48- 11463 8342 8063
F48+ 13942 13188 12983
F96- 16474 15156 13992
F96+ 13592 9453 9245

注: D表示消化道; G表示鳃; F表示足; -表示对照组; +表示试验组

随机抽取经过高通量测序得到的有效序列, 以抽到的序列数以及与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线。由图2可知, 随着测序量的增加, 各个时间点鲍消化道、鳃、足部肌肉的对照组与试验组的稀释性曲线趋向平坦, 这表明更多的数据量只会产生少量新的OTU。实验结果反映了皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉3个组织的微生物多样性。
图2 微生物稀释曲线

Fig. 2 Rarefaction of microbes

2.3 哈维弧菌对皱纹盘鲍体内微生物多样性的影响

利用Alpha多样性指数OTU、Coverage(覆盖率)、Ace(Ace指数)、Chao(Chao指数)、Shannon(香农指数)以及Simpson(辛普森指数)进行样品微生物物种丰富度和多样性的评估。对照组和试验组的Alpha多样性指数分析结果如表2所示, 对照组和试验组的测序覆盖率Coverage在99%以上, 说明对照组和试验组未被检测到的序列占比很低, 可忽略不计。除了受哈维弧菌胁迫24h后鲍消化道的Ace、Chao指数以及受胁迫96h后消化道的Ace指数高于对照组之外, 其余时间点鲍消化道、鳃及足部肌肉的Ace、Chao指数均低于对照组。这表明, 在受到哈维弧菌胁迫后, 鲍体内的菌群丰度下降。与对照组相比, 试验组的Shannon指数除在受哈维弧菌胁迫24h后的鲍消化道、足部肌肉及受胁迫96h后的鳃组织中高于对照组外, 其余时间点均低于对照组。鳃组织以及足部肌肉试验组的Simpson指数分别在96h、24h低于对照组, 其余时间点均高于对照组; 而试验组的消化道菌群Simpson指数在3个时间点均高于对照组。以上结果表明, 在受到哈维弧菌胁迫的过程中, 鲍体内部分菌群的出现频率增加了, 导致菌群总体多样性下降。
表2 皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉中细菌群落结构多样性指数

Tab. 2 Structural diversity indices of bacterial communities in the digestive tract, gills and foot muscles of the H. discus hannai

样本编号 OTU 覆盖率/% Ace指数 Chao指数 Shannon指数 Simpson指数
D24- 193 99.19 217 222 3.01 0.1077
D24+ 221 99.36 243 242 3.21 0.1326
D48- 265 99.22 313 326 3.68 0.0577
D48+ 204 99.24 260 246 2.71 0.1491
D96- 221 98.88 240 247 3.29 0.0878
D96+ 177 99.52 306 238 2.77 0.1333
G24- 505 99.39 606 621 4.56 0.0267
G24+ 297 99.52 319 330 3.93 0.0571
G48- 376 99.47 408 408 3.66 0.0823
G48+ 320 99.63 385 371 3.06 0.136
G96- 366 99.50 449 425 3.22 0.1544
G96+ 271 98.83 289 294 3.27 0.1294
F24- 317 98.68 342 350 3.4 0.1048
F24+ 272 99.11 312 326 3.97 0.0414
F48- 296 99.38 384 371 2.62 0.24
F48+ 183 99.48 246 240 1.33 0.5933
F96- 471 99.47 529 524 3.61 0.1473
F96+ 206 99.53 276 275 1.78 0.3866

注: D表示消化道; G表示鳃; F表示足; -表示对照组; +表示试验组

2.4 皱纹盘鲍消化道、鳃、足部微生物的门水平构成及其受哈维弧菌的影响

皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉中的微生物在门水平上, 最大丰度排名前10的物种的相对丰度所占比例如图3所示。图中结果表明, 对照组与试验组中鲍消化道、鳃与足部肌肉的微生物主要是由9个门组成, 分别为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、奇异球菌门(Deinococcus-Thermus)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)等。但是, 每个门在消化道、鳃与足部肌肉中所占的比例各不相同。对照组中, 皱纹盘鲍消化道内主要以变形菌门(30.10%~64.41%)以及软壁菌门(15.85%~28.77%)为主。受哈维弧菌胁迫24h、48h后, 消化道内的拟杆菌门以及梭杆菌门大量增加。受胁迫96h后, 拟杆菌门的丰度增加, 而梭杆菌门的丰度略微下降。在鳃组织对照组中, 微生物主要以拟杆菌门和变形菌门为主, 两者占比达到76%以上。受哈维弧菌胁迫后, 鳃组织中变形菌门丰度下降, 拟杆菌门除了在24h时出现丰度下降外, 48h以及96h丰度均增加; 梭杆菌门在3个时间点的丰度均增加。但是, 在足部却出现了相反的现象。对照组中, 皱纹盘鲍足部肌肉微生物主要以变形菌门和拟杆菌门为主, 两者占比达到90%以上。当受哈维弧菌胁迫后, 变形菌门的丰度增加, 而拟杆菌门的丰度略有下降。
图3 基于门水平的微生物群落结构组成及相对丰度

Fig. 3 Structural composition and relative abundance of microbial communities based on phylum level

2.5 皱纹盘鲍消化道、鳃、足部微生物的属水平构成及其受哈维弧菌的影响

对照组和试验组中的皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉基于属水平的微生物群落结构组成及相对丰度分析结果如图4所示。图中结果表明, 引入哈维弧菌对鲍消化道、鳃以及足部肌肉属水平微生物组成的影响较大。在对照组中, 皱纹盘鲍消化道内的优势菌属主要为Curvibacter、假单胞菌属(Pseudomonas)、支原体属(Mycoplasma)。受哈维弧菌胁迫24h后, 假单胞菌属的丰度增加, 并成为鲍消化道的优势菌属, 支原体属的丰度则下降。受胁迫48h后, 拟杆菌属(Bacteroides)丰度增加, 支原体属的丰度急剧下降。受胁迫96h后, 鲍消化道主要以拟杆菌属、假单胞菌属以及中度产丙酸菌属(Propionigenium)为主, 三者占比达66%以上; 而支原体属占比减为3.05%。以上实验结果表明, 随着哈维弧菌胁迫时间的延长, 鲍消化道内假单胞菌属、拟杆菌属及中度产丙酸菌属的丰度得到了增加, 而支原体属的丰度则不断降低。在皱纹盘鲍的鳃中观察到了同样的菌属变化。受哈维弧菌胁迫24h后, 鳃中假单胞菌属、Kordia以及中度产丙酸菌属的丰度增加; 但受哈维弧菌胁迫96h后, 假单胞菌属的丰度却出现了急剧下降, 而Kordia、拟杆菌属及中度产丙酸菌属的丰度增加。随着哈维弧菌胁迫时间的延长, 鲍足部肌肉中假单胞菌属的丰度迅速增加, 占比达到了87.52%~90.46%, 成为足部肌肉的优势菌属。除此之外, 丙酸菌属(Propionibacterium)的丰度在3个时间点均略微增加。
图4 基于属水平的微生物群落结构组成及相对丰度

Fig. 4 Structural composition and relative abundance of microbial communities based on genus level

3 讨论

弧菌是近海河口环境中常见的兼性厌氧细菌, 当水质恶化时会大量增殖并导致水生生物患病(Arunkumar et al, 2020; Vaiyapuri et al, 2021)。本研究通过人工浸泡感染的方法, 模拟了自然条件下哈维弧菌侵染皱纹盘鲍的过程。结果表明, 受到哈维弧菌胁迫后, 鲍消化道、鳃及足部肌肉中弧菌的数量增加。其中, 鲍消化道中弧菌数目最高, 且显著高于血液和足部, 不同组织呈现弧菌数目的富集差异性。鲍鱼是舐食性贝类, 通过摄食藻类和有机碎屑作为食物来源(Takami et al, 2018)。在此过程中可能伴随弧菌的侵入, 从而导致消化道内弧菌的富集。由于贝类的开放式循环系统, 水体中的哈维弧菌很可能直接与鲍鱼的血窦接触, 并通过扩散作用进入血液, 从而在血液中积累。足部是皱纹盘鲍的运动器官, 弧菌会随体液循环到达足部, 造成足部肌肉中弧菌数量的增加。另一方面, 在皱纹盘鲍受哈维弧菌胁迫期间, 本研究未对鲍鱼投喂饵料, 因为改变饵料成分等逆境条件会造成鲍体免疫机制损伤从而增加病原体易感性(Nam et al, 2020)。由此推测, 由于鲍体本身处于饥饿状态, 鲍体免疫力相对于正常状态有所下降, 所以鲍体受哈维弧菌胁迫后, 其消化道、血液及足部肌肉弧菌数量增加。
本研究还通过高通量测序技术对皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部的菌群结构进行了研究。实验结果表明, 在对照组和试验组皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉的微生物中, 丰度排前5位的门是变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、软壁菌门和放线菌门。以上菌门在白鲍(H. sorenseni) (Parker-Graham et al, 2020)、南非鲍(H. midae) (Nel et al, 2017)、红鲍(H. rufescens) (Villasante et al, 2020)、皱纹盘鲍(郭战胜 等, 2022)、深海沉积物(孙慧敏 等, 2010)以及珊瑚礁沉积物(韩敏敏 等, 2020)样本的优势菌群中均有检出。如郭战胜等(2022)利用16S rRNA高通量测序技术对4种鲍的消化道菌群多样性进行了研究, 其结果表明皱纹盘鲍、黑足鲍(H. iris)、黑唇鲍(H. rubra)以及杂交鲍(H. laevigata×H. rubra)中的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和软壁菌门(Tenericutes), 三者占比达到61.93%~95.78%; Parker-graham等(2020)在土霉素治疗对濒危白鲍消化道微生物群落的影响研究中发现, 白鲍消化道中微生物的核心菌群为变形菌门、梭杆菌门和拟杆菌门; 李沛翰等(2019)利用16S扩增子技术研究了海鲜样本的菌群结构组成, 结果表明鲍体内的优势菌群为变形菌门、浮霉菌门、软壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门。已报道的这些优势类群与本实验得到的结果相似, 但本研究中检测到的浮霉菌门所占比例较低(<4%), 而放线菌门所占比例较高, 这与之前的研究结果有所不同。此外, 有研究表明水质、饵料组成等环境因素、宿主肠道条件以及不同的发育阶段, 均会对微生物群落功能和结构产生影响(Duan et al, 2017; Suo et al, 2017; He et al, 2017)。海鲜样本菌群结构组成的研究结果表明, 鲍体内主要的菌属包括假单胞菌属、支原体属以及嗜冷杆菌属(Psychrobacter) (李沛翰 等, 2019), 这些优势菌属与本实验得到的结果也类似。但是本实验中检测到的嗜冷杆菌属所占的比例很低(<1%), 而Curvibacter所占比例较高。由于水环境系统非常复杂, 本文推测这是由于环境因素、宿主条件等多种因素共同作用的结果。
病原菌入侵会对水生动物肠道内的微生物群落组成产生影响(Wang et al, 2019), 其中哈维弧菌作为常见的海洋性致病菌受到了广泛的关注(林克冰 等, 2014; 蒋魁 等, 2016)。然而, 关于鲍的研究多限于鲍种类、食物变化、生长环境、发育阶段等对消化道菌群结构组成的影响(Zhao et al, 2012; Gobet et al, 2018; Villasante et al, 2020; Danckert et al, 2021)。而关于病原菌对皱纹盘鲍体内微生物群落组成的影响, 目前尚不明确, 相关报道也较少。因此, 本研究采用高通量测序技术对受哈维弧菌胁迫后皱纹盘鲍消化道、鳃以及足部肌肉菌群的动态变化进行了深入的分析。结果表明, 受到哈维弧菌胁迫后, 皱纹盘鲍体内的菌群多样性降低。除了个别时间点外, 皱纹盘鲍消化道及足部肌肉中假单胞菌属的丰度增加; 消化道及鳃中拟杆菌属、中度产丙酸菌属的丰度增加。假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌, 能够产生多种次级代谢产物, 对哈维弧菌、副溶血性弧菌以及创伤弧菌等多种致病菌具有良好的抑制作用(Ninawe et al, 2009; Zhang et al, 2016); 拟杆菌属属于拟杆菌门, 拟杆菌门是海洋中最丰富的微生物门之一, 平均约占海洋表面浮游细菌细胞的10%(Sunagawa et al, 2015), 且拟杆菌属可以通过提供脂肪酸和维生素帮助宿主吸收营养(Fernández-Gómez et al, 2013); 中度产丙酸菌属属于梭杆菌门, 它能将琥珀酸转化为丙酸, 这种转化有助于建立钠梯度, 并为二羧酸在宿主体内的运输提供能量(Dimroth, 1990)。在鲍体受到哈维弧菌胁迫过程中, 假单胞菌属、拟杆菌属、中度产丙酸菌属的丰度升高, 表明它们很可能在抗病原菌保护中发挥了重要作用。
本次研究还发现, 在受到哈维弧菌的胁迫后, 皱纹盘鲍消化道中支原体属丰度下降。支原体属被认为是条件性致病菌(Zhou et al, 2012), 当养殖水质恶化或与其他病原体共同感染时, 易引起疾病暴发。然而, 支原体属在水生生物的消化道内也有利于蛋白质、多糖和寡糖的降解。已有报道证实支原体属在鲍消化道中普遍存在, 且可能在鲍消化海藻多糖和蛋白质的过程中发挥作用(Knops et al, 2000)。Villasante等(2020)的研究表明, 健康的红鲍消化腺中支原体属相对丰度较高, 但是感染肌肉萎缩症后支原体属占比明显下降, 这与本文实验结果一致。
综上所述, 在受到病原哈维弧菌的胁迫后, 皱纹盘鲍体内弧菌的数量增加, 但菌群丰富度及多样性下降。除了个别时间点之外, 鲍消化道内的假单胞菌属、拟杆菌属、中度产丙酸菌属丰度增加, 而支原体属丰度下降; 鳃组织中的拟杆菌属、Kordia、中度产丙酸菌属丰度增加; 足部肌肉中假单胞菌属丰度增加。本文研究结果将为哈维弧菌与宿主之间的互作机理研究提供参考依据。

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