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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 2: 141 - 152

DOI: https://doi.org/10.11978/2022075

海洋资源开发

牡蛎酶解产物对产后缺乳症泌乳功能改善作用探究

  • 韦雪 , 1 ,
  • 秦小明 , 1, 2 ,
  • 谌素华 1 ,
  • 张锴佳 1 ,
  • 林海生 1, 2 ,
  • 郑惠娜 1, 2 ,
  • 高加龙 1, 2
展开
  • 1.广东海洋大学食品科技学院, 国家贝类加工技术研发分中心(湛江), 广东省水产品加工与安全重点实验室, 广东省海洋生物制品工程实验室, 广东省亚热带果蔬加工科技创新中心, 广东 湛江 524088
  • 2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学), 辽宁 大连 116034
秦小明。email:

韦雪(1996—), 女, 广西壮族自治区钦州市人, 硕士研究生, 从事食品加工与安全。email:

Copy editor: 殷波

收稿日期: 2022-04-11

  修回日期: 2022-06-17

  网络出版日期: 2022-06-30

基金资助

财政部和农业农村部国家现代农业产业技术项目(CARS-49)

收起

Study on the effect of Oyster hydrolysates on improving Lactation function in Postpartum hypogalactism

  • WEI Xue , 1 ,
  • QIN Xiaoming , 1, 2 ,
  • CHEN Suhua 1 ,
  • ZHANG Kaijia 1 ,
  • LIN Haisheng 1, 2 ,
  • ZHENG Huina 1, 2 ,
  • GAO Jialong 1, 2
Expand
  • 1. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang), Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products, Guangdong Provincial Science and Technology Innovation Center for Subtropical Fruit and Vegetable Processing, Zhanjiang 524088, China
  • 2. Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
QIN Xiaoming. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2022-04-11

  Revised date: 2022-06-17

  Online published: 2022-06-30

Supported by

China Agricultural Research System of MOF and MARA(CARS-49)

Fold

摘要

文章以香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)为原料制备牡蛎酶解产物(oyster hydrolysis, OH), 分析其基本营养成分和氨基酸组成, 并探究其对甲磺酸溴隐亭致产后缺乳症大鼠的泌乳功能改善作用。结果表明: OH粗蛋白含量较高, 其次是总糖, 而脂肪含量较低, 肽含量为33.4%; OH中必需氨基酸占总氨基酸的39.8%, 且含有较高比例的支链氨基酸。动物试验结果表明: 相较于模型组, OH高剂量组大鼠泌乳量显著增加(p < 0.05)且优于阳性对照组; OH各剂量组均极显著提高了缺乳大鼠乳腺组织器官指数(p < 0.01), 其效果接近于阳性对照组, 但未能恢复到正常水平; 苏木精-伊红染色观察结果显示, OH各剂量组乳腺组织腺泡较多, 腺泡呈现圆形且充盈, 内有较多的分泌物, 腺泡有明显扩大增生, 相较于模型组, 有明显的恢复; 与模型组比较, OH各剂量组血清和乳腺组织催乳素(prolactin, PRL)、催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)含量显著提高(p < 0.05), 说明OH能够促进缺乳大鼠催乳素分泌, 而血清多巴胺(dopamine, DA) 的含量极显著降低(p < 0.01), 表明OH能够降低由溴隐亭导致的多巴胺含量过高。 此外, OH能显著提高乳腺组织中乳糖(lactose, LC)、甘油三酯(triglyceride, TG)含量(p < 0.05), 提高了乳汁营养成分; OH各剂量组血液中平均血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)、红细胞(red blood cell, RBC)的数量也显著增加(p < 0.05), 对产后气血不足有一定的改善作用。因此, OH能够改善缺乳症状, 提高产后泌乳量, 具有促进泌乳的潜力。

关键词： 牡蛎酶解产物; 产后缺乳; 甲磺酸溴隐亭; 泌乳量

本文引用格式

韦雪 , 秦小明 , 谌素华 , 张锴佳 , 林海生 , 郑惠娜 , 高加龙 . 牡蛎酶解产物对产后缺乳症泌乳功能改善作用探究[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(2) : 141 -152 . DOI: 10.11978/2022075

Abstract

In this paper, oyster hydrolysis products were prepared from Crassostrea hongkongensis as raw materials, and the basic nutrition and amino acid composition of oyster hydrolysis products were analyzed, and the improvement effect of oyster hydrolysis products on the lactation function of rats with postpartum lactation caused by Bromocriptine mesylate was explored. The results showed that protein content of oyster hydrolysis products was higher, which is followed by sugar, fat content was lower, and peptide content was 33.4%. The essential amino acids in oyster hydrolysis products accounted for 39.8% of the total amino acids and contained a high proportion of branched amino acids. The results of animal experiment showed that compared with model group, the lactation volume of rats in oyster hydrolysis products of high-dose group was significantly increased (p < 0.05), which was better than that in the positive control group. The index of mammary tissue and organ in each oyster hydrolysis products dose group was significantly increased (p < 0.01), which was close to the positive control group, but did not return to normal level. HE staining showed that there were more acinus in mammary gland tissues in all oyster hydrolysis products dose groups, which were round and full with more secretions, and the acinus had obvious enlargement and hyperplasia. Compared with the model group, the acinus had obvious recovery. Compared with model group, the contents of prolactin (PRL) and prolactin receptor (PRLR) in serum and mammary tissue of oyster hydrolysis products groups were largely increased (p < 0.05), indicating that oyster hydrolysis products could promote the secretion of prolactin in lactation-deficient rats, while the content of serum dopamine (DA) was greatly decreased (p < 0.01). These results showed that oyster hydrolysis products can reduce the high level of dopamine induced by bromocystine. In addition, oyster hydrolysis products strongly increased the contents of lactose (LC) and triglyceride (TG) in breast tissue (p < 0.05), and improved the nutritional composition of milk. The average hemoglobin (MCHC) and red blood cell (RBC) contents in all oyster hydrolysis products dose groups were also greatly increased (p < 0.05), which had a certain improvement effect on postpartum deficiency of qi and blood. Conclusion: Oyster hydrolysis products can improve the symptoms of lactation deficiency and increase milk yield after delivery, which has the potential to promote lactation.

Key words： oyster hydrolysates; postpartum lactation deficiency; bromocriptine mesylate; amount of lactation

产后缺乳是哺乳期妇女常见的疾病, 主要症状是无乳可下, 乳房堵塞, 乳量不能够满足婴幼儿喂养需求。《中国儿童发展纲要(2011—2020年)》要求纯母乳喂养率需提高至50%, 但目前我国的纯母乳喂养率仅为29.2% (吴缃琦 等, 2017; 林超, 2020), 而导致母乳喂养率低的主要原因是产后缺乳(Gupta et al, 2017)。近年来, 受到生活压力以及饮食结构变化等因素的影响, 产后缺乳人群逐年增长(中国发展研究基金会, 2019)。目前治疗产后缺乳的方法主要是药物治疗, 而药物治疗具有一定的毒副作用, 因此寻找一种对产后缺乳患者安全有效的促进泌乳天然活性物质, 满足婴儿喂养需求具有重要意义。
造成产后缺乳的病因复杂, 中医将产后缺乳归结为两种类型, 一种是“气血虚弱”型, 另一种是“肝郁气滞”型(林国兴 等, 2021), 并提出“虚则补之, 实则泻之”的治疗方法。现代研究表明, 乳腺泌乳过程受机体神经内分泌系统调控。催乳素(prolactin, PRL)与催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)的结合具有促进乳腺的发育, 维持泌乳的作用, PRL分泌水平过低, 乳腺发育不良是造成产后缺乳的重要因素。下丘脑分泌催乳素抑制因子(prolactin inhibiting factor, PIF)、多巴胺(dopamine, DA)与垂体多巴胺受体结合均能够抑制垂体前叶腺嗜酸细胞分泌PRL, 影响乳腺发育, 从而导致产后缺乳(Mccann et al, 1984; 林曼, 2018)。产后缺乳常用造模药物是甲磺酸溴隐亭, 甲磺酸溴隐亭是一种多巴胺能激动剂, 其功能与下丘脑分泌的PIF相似, 能直接作用于垂体的PRL分泌细胞, 增加DA含量, 抑制PRL分泌和加速PRL降解, 临床上用于治疗由于PRL分泌过高引起的溢乳综合征(底爱英 等, 2013), 其作用效果与产后缺乳症状相同(Otto et al, 2015)。
我国海洋生物资源丰富, 海洋生物资源的高值化利用是海洋产业发展的重要经济增长点(吴园涛 等, 2012)。香港牡蛎俗称“白肉”“大蚝”, 主要分布在广东、广西以及海南等地, 是两广主要养殖品种, 2020年牡蛎养殖产量约542.5万t (农业农村部渔业渔政管理局 等, 2021)。研究报道牡蛎具有抗氧化(Zhang et al, 2019)、改善学习记忆(朱国萍 等, 2021)、保护肠黏膜(叶子晴 等, 2022)、免疫调节(Xu et al, 2016)、改善肠道微生物(Xiang et al, 2021)、改善皮肤光损伤(Peng et al, 2020)、抗黑色素(Jae et al, 2019)、降血压(Wang et al, 2008)等生物活性。据《傅青主女科》记载, 牡蛎对女性具有活血化瘀、消肿散结的功效, 牡蛎可作为治疗乳腺增生的中药组分之一。此外, 已有研究支持牡蛎能够改善哺乳动物泌乳能力, 如胡培丽等(2014)研究报道鱼牡蛎生乳灵胶囊能够促进哺乳期大鼠乳汁分泌; 谌素华等(2021)研究表明牡蛎酶解产物能提高哺乳期大鼠泌乳量, 可见牡蛎酶解产物对改善和保护女性泌乳功能具有潜在作用。牡蛎作为食疗保健的重要原料来源, 已有研究大都集中于牡蛎对正常哺乳期动物相关泌乳激素的影响, 针对产后缺乳模型动物的泌乳影响尚未见报道。因此, 本试验以牡蛎酶解产物为研究对象, 采用甲磺酸溴隐亭构建产后缺乳大鼠模型, 评价牡蛎酶解产物对产后缺乳症的作用功效, 为牡蛎酶解产物应用于催乳产品开发提供理论基础, 为哺乳期妇女带来更多帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料

试验用新鲜香港牡蛎购于湛江海鲜批发市场。

1.1.2 试验动物

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级健康远交群(sprague dawley, SD)大鼠54只, 购于珠海百试通生物科技有限公司, 动物生产许可号SCXK(粤)2020-0051: 其中雄性大鼠18只, 雌性大鼠36只, 雄鼠体质量220 ~ 260g, 雌鼠体质量200 ~ 220g。

1.1.3 试剂

动物蛋白酶(酶活8.7×104U·g-1, 广西南宁庞博生物有限公司); 甲磺酸溴隐亭(上海源叶生物科技有限公司); 补血生乳颗粒(九芝堂股份有限公司); 大鼠催乳素(prolactin, PRL)酶联免疫试剂盒(广州鼎国生物科技有限公司); 大鼠催乳素受体(PRLR)酶联免疫试剂盒(广州鼎国生物科技有限公司); 大鼠多巴胺(dopamine, DA)酶联免疫试剂盒(广州鼎国生物科技有限公司); 大鼠乳糖(lactose, LC)、甘油三酯(triglyceride, TG)酶联免疫试剂盒(广州鼎国生物科技有限公司); 4%多聚甲醛固定液(广州鼎国生物科技有限公司); 纯度大于99.5%的水合氯醛(AR)(上海源叶生物科技有限公司)。

1.1.4 仪器与设备

Lynx6000 高速落地离心机(Thermo公司, 美国); 5810R型高速台式冷冻离心机(Eppendorf公司, 德国); FD8508冷冻干燥机(ilshin公司, 韩国); Varioskan Flash全波长扫描式酶标仪(Thermo公司, 美国); RM2020石蜡切片; DMI4000B智能型倒置荧光显微镜(Leica公司, 德国); 3H30RI 国产台式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 牡蛎酶解产物的制备

酶解条件参考李婉等(2017)的方法并进行改进。将牡蛎肉与蒸馏水按照料水比1 : 3进行匀浆, 动物蛋白酶加入量为1000U·g-1, 酶解温度为53℃, 调节pH为7.0, 酶解4h后100℃沸水浴灭酶10min, 得到牡蛎酶解液, 冷却到室温后进行离心(离心条件: 3459g, 20min)取上清液冷冻干燥后得到牡蛎酶解产物(oyster hydrolysis, OH)。

1.2.2 OH肽含量及基本营养成分测定

肽含量测定: 采用福林酚法(张佩 等, 2022); 水分含量测定: 参考国标GB5009.3-2016采用直接干燥法; 脂肪含量测定: 参考国标GB5009.6-2016采用索氏抽提法; 总糖含量测定: 采用苯酚硫酸法; 粗蛋白含量测定: 参考GB5009.5-2016采用凯氏定氮法, 转换系数为6.25; 灰分含量测定参考国标GB5009.4-2016采用高温灼烧法。

1.2.3 OH氨基酸组成测定

参照GB5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

1.2.4 试验动物分组及造模

将购买回来的试验大鼠雌雄分笼, 适应性暂养一周后, 将雌鼠与雄鼠按2 : 1的比例进行同笼交配, 连续同笼一周, 直到母鼠阴道涂片观察到精子为止。将受精的成功的母鼠与雄鼠分开饲养, 在母鼠妊娠20d时, 将其调整为每笼1只妊娠鼠, 并换窝放置干净, 等待分娩。取产仔时间前后相差不超过24h的36只母鼠作为试验对象, 具体分组见表1。参考董世起(2015)的方法, 除了空白组外, 其他各组每天均用浓度为0.5mg·mL-1、体积为1mL·100g-1的甲磺酸溴隐亭灌胃, 构建产后缺乳模型, 连续灌胃8d。
表1 动物分组及处理

Tab. 1 Grouping and treatment of animals

组别 母鼠数量/只 每窝仔鼠数量/只 处理方式
空白组(B组) 6 12 用1mL·100g-1蒸馏水灌胃, 每天一次
模型组(M组) 6 12 同时用甲磺酸溴隐亭溶液(浓度0.5mg·mL-1、体积1mL·100g-1)和1mL·100g-1蒸馏水灌胃, 每天一次
阳性药物组(P组) 6 12 同时用甲磺酸溴隐亭溶液(浓度0.5mg·mL-1、体积1mL·100g-1)和补血生乳颗粒(浓度267mg·mL-1、体积1mL·100g-1)灌胃, 每天一次
牡蛎酶解产物低剂量组(OH-L组) 6 12 同时用甲磺酸溴隐亭溶液(浓度0.5mg·mL-1、体积1mL·100g-1)和牡蛎酶解粉(浓度31.25mg·mL-1、体积1mL·100g-1)灌胃, 每天一次
牡蛎酶解产物中剂量组(OH-M 组) 6 12 同时用甲磺酸溴隐亭溶液(浓度0.5mg·mL-1、体积1L·100g-1)和牡蛎酶解粉(浓度62.5mg·mL-1、体积1 mL·100g-1)灌胃, 每天一次
牡蛎酶解产物高剂量组(OH-H 组) 6 12 同时用甲磺酸溴隐亭溶液(浓度0.5mg·mL-1、体积1mL·100g-1)和牡蛎酶解粉(浓度125mg·mL-1、体积1mL·100g-1)灌胃, 每天一次

1.3 观察指标

1.3.1 母鼠每小时泌乳量测定(Lin et al, 2017)

每日早上08:00将仔鼠与母鼠分开, 并称量分开前每窝仔鼠体重, 计为W1; 仔鼠与母鼠分离4h后再次称量仔鼠体重, 计为W2, 将仔鼠放回母鼠身边进行哺乳, 哺乳1h后称量仔鼠体重, 计为W3 (公式1):
母 鼠 每 小 时 泌 乳 量 = W 3 − W 2 + W 1 − W 2 ÷ 4

1.3.2 仔鼠存活率

分娩结束后, 将每只母鼠哺乳总仔鼠数量均调整为12只, 每天记录仔鼠存活数量, 计算仔鼠存活率(公式2):
仔 鼠 存 活 率 = 存 活 仔 鼠 数 量 ÷ 总 仔 鼠 数 量 × 100 %

1.3.3 脏器指数、乳腺器官指数

通过注射7%的水合氯醛将母鼠麻醉然后进行眼球取血, 采用脊椎脱臼法处死母鼠, 将其解剖取出心脏、胸腺、脾脏、肝脏、脾脏分别进行称重, 记录各个脏器组织质量; 将母鼠第 3 对左侧乳房取出, 称重, 记录乳腺组织质量, 然后浸泡于 10%的甲醛固定液, 计算脏器指数(公式3)和乳腺器官指数(公式4):
脏 器 指 数 = 脏 器 组 织 质 量 ÷ 母 鼠 体 重 × 100 %
乳 腺 器 官 指 数 = 乳 腺 组 织 质 量 ÷ 母 鼠 体 重 × 100 %

1.3.4 血清、乳腺组织PRL、PRLR、血清DA含量及乳腺组织中乳糖和甘油三酯含量测定

将采集到的血液进行以2330g离心15min, 取上清液得到血清, 按照ELISA试剂盒说明操作, 酶标仪进行测定。
大鼠处死后迅速分离乳腺组织, 取大小适宜的大鼠乳腺组织, 加入生理盐水使用研磨珠研磨, 制备 10%的组织匀浆液, 1400g离心10min, 取上清液备用, 按照ELISA试剂盒说明操作, 酶标仪进行测定。

1.3.5 平均血红蛋白含量和红细胞数测定

采用全自动血液分析仪测定母鼠血常规, 包括平均血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHCC)和红细胞数(red blood cell, RBC)测定。

1.3.6 乳腺组织切片观察

取出1.3.3中固定后的乳腺组织, 使用常规石蜡做包埋切片, 然后用苏木精-伊红(HE)染色, 采用光学显微镜, 对母鼠的乳腺组织进行病理组织学检测(蒋博 等, 2022)观察乳腺组织结构。

1.4 数据统计分析

试验数据采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析, Origin2022作图。试验结果以(均数±标准差)( X - ± SD) 表示, 两两比较采用独立样本 t 检验, 多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 OH肽含量、基本营养成分分析

OH肽含量、基本营养成分含量见表2。酶解得到的OH肽含量为33.4%, 稍高于杨发明等(2020)测得的肽含量(25.26%)。OH基本成分中蛋白质含量最高, 为45.09%, 其次是总糖, 含量为33.83%, 脂肪仅有4.55%, 因此OH属于一种高蛋白、低脂肪的物质。
表2 牡蛎酶解产物(OH)基本营养成分组成( X - ± SD, n=3 )

Tab. 2 Basic nutritional components of OH ( X - ± SD, n=3 )

成分 肽/% 水分/% 脂肪/% 总糖/% 蛋白质/% 灰分/%
OH 33.4±0.14 7.17±0.15 4.55±0.21 33.83±1.52 45.09±0.98 6.60±0.17

2.2 OH氨基酸组成分析

OH氨基酸种类齐全且分布均匀, 游离氨基酸与水解氨基酸中都含有7种必需氨基酸, 其中水解氨基酸中EAA/TAA为39.8%, EAA/NEAA为66%, 接近FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式(孙龙生, 2011)。此外, 水解氨基酸中支链氨基酸占总氨基酸含量的18.9% (表3)。
表3 OH氨基酸组成表

Tab. 3 Amino acid composition of OH

种类 水解氨基酸含量/(g·100g-1) 游离氨基酸含量/(g·100g-1)
天门冬氨酸(ASP) 3.81 0.74
苏氨酸(THR)* 1.67 1.37
丝氨酸(SER) 1.80 1.00
谷氨酸(GLU) 5.94 1.97
脯氨酸(PRO) 1.46 0.59
甘氨酸(GLY) 2.45 0.65
丙氨酸(ALA) 2.20 1.56
缬氨酸(VAL)* 2.16 1.30
蛋氨酸(MET)* 1.34 0.97
异亮氨酸(ILE)* 1.79 1.43
亮氨酸(LEU)* 2.79 2.39
酪氨酸 TYR 1.04 2.09
苯丙氨酸(PHE)* 1.57 2.02
赖氨酸(LYS)* 2.84 0.92
组氨酸(HIS) 0.48 0.27
精氨酸(ARG) 2.31 1.52
氨基酸总和(TAA) 35.60 20.80
必需氨基酸(EAA) 14.16 10.40
非必需氨基酸(NEAA) 21.44 10.40
EAA与TAA比值/% 39.80 50.00
EAA与NEAA比值/% 66.00 100.00

注: *为必需氨基酸

2.3 乳腺器官指数、乳腺组织结构及脏器指数的测定

乳腺是哺乳动物特有的器官, 乳腺的健康发育是泌乳的前提。与M组比较, P组、OH高、中、低剂量组乳腺器官指数差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, OH高、中、低剂量组差异不显著(p > 0.05), 表明OH能够促进缺乳大鼠乳腺发育, 使乳腺器官指数显著提高, 其作用效果接近于P组, 但未能恢复到正常水平(表4)。
表4 乳腺器官指数( X - ± SD, n=6 )

Tab. 4 Mammary organ index ( X - ± SD, n=6 )

组别 B组 M组 P组 OH-L组 OH-M组 OH-H组
指数 6.49±0.72 3.35±0.3## 5.65±0.69** 4.76±0.64##** 4.81±0.57##** 4.98±0.44##**

注: 与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

与B组比较, M组大鼠乳腺组织腺泡较少, 结缔组织增多, 呈现萎缩状。与M组乳腺组织结构相比, OH各剂量组的大鼠乳腺组织腺泡较多, 腺泡呈现圆形且充盈, 内有较多的分泌物, 腺泡有明显扩大增生, 且OH高剂量组的效果较明显(图1)。
图1 OH对大鼠乳腺组织结构的影响(×400)

Fig.1 Effects of OH on mammary gland tissue structure of rats

脏器指数结果表明, OH各剂量组与B组和M组、P组间各个脏器指数均无显著性差异(p > 0.05), 说明试验中灌胃的造模药物甲磺酸溴隐亭和牡蛎酶解粉对大鼠脏器重量无影响(表5)。
表5 脏器器官指数( X - ± SD, n=6 )

Tab. 5 Organ index ( X - ± SD, n=6 )

指标 B组 M组 P组 OH-L组 OH-M组 OH-H组
心脏指数 0.45±0.11 0.43±0.03 0.43±0.05 0.40±0.03 0.44±0.05 0.43±0.06
胸腺指数 0.09±0.02 0.11±0.02 0.12±0.01 0.11±0.01 0.11±0.02 0.12±0.02
脾脏指数 0.22±0.01 0.24±0.02 0.24±0.02 0.23±0.01 0.25±0.02 0.25±0.04
肝脏指数 3.94±0.42 3.41±0.37 3.20±0.22 3.20±0.24 3.28±0.21 3.41±0.21
肾脏指数 0.70±0.07 0.74±0.07 0.74±0.04 0.75±0.08 0.72±0.06 0.71±0.05

2.4 每小时泌乳量、泌乳量总和平均值和仔鼠存活率的测定

泌乳量是直接反映催乳效果的指标。经过8d的给药, 各组大鼠泌乳量均不同程度下降, 但与M组比较, OH各剂量组下降程度较小。M组大鼠的每小时泌乳量从第3d起就开始表现出显著的减少(p < 0.05); 与M组比较, OH高剂量组从第5d开始每小时泌乳量极显著(p < 0.01), OH中、低剂量组每小时泌乳量与M组比较差异不显著(p > 0.05)(表6)。
表6 每小时泌乳量( X - ± SD, n=6 )(单位: g·h-1 )

Tab. 6 Lactating capacity per hour ( X - ± SD, n=6)

时间 B组 M组 P组 OH-L组 OH-M组 OH-H组
第1天 2.28±0.73 1.49±0.40## 3.35±0.50** 1.75±1.94 2.51±0.48** 2.93±0.50**
第2天 2.29±1.04 2.57±1.04 2.07±0.86 0.81±1.82 1.21±0.41 3.19±0.32
第3天 4.11±0.79 1.98±1.26# 1.60±0.77 2.33±0.77 0.89±0.83 2.02±0.57
第4天 4.46±0.56 0.90±1.13## 2.17±0.77 0.71±1.42 1.99±0.88 1.74±0.12
第5天 6.38±1.15 0.44±0.48## 1.05±0.98 1.77±1.24 0.67±0.41 2.47±1.00**
第6天 6.20±1.1 0.03±0.48## 1.82±0.31** 1.05±1.39 0.13±0.66 2.79±0.89**
第7天 4.88±1.62 0.39±0.51## 0.05±0.79 0.57±1.29 1.00±0.79 3.10±0.85**
第8天 4.74±1.45 0.05±0.10## 1.64±2.10** 0.93±1.48 0.18±0.23 1.11±0.70

注: 与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著( p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

与B组比较, M组每小时泌乳量总和平均值极显著减少(p < 0.01), 说明甲磺酸溴隐亭致产后缺乳大鼠模型造模成功。与M组比较, OH高剂量组大鼠的泌乳量总和平均值极显著增加(p < 0.01), 增加了195.12% (表7), 与P组比较, OH高剂量组显著提高(p < 0.05)。以上结果表明OH能使产后缺乳大鼠泌乳量增加, 且高剂量组增加效果较明显。
表7 泌乳量总和平均值( X - ± SD, n=6 )(单位: g )

Tab. 7 Average total milk yield ( X - ± SD, n=6)

组别 B组 M组 P组 OH-L组 OH-M组 OH-H组
平均值 4.39±1.81 0.82±1.30##△△ 1.72±1.35##** 1.16±1.65## 1.08±1.09##△ 2.42±0.97##**△

注: 与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

刚出生的仔鼠唯一的食物就是乳汁, 通过测定仔鼠存活率可以侧面反映母鼠泌乳量。在甲磺酸溴隐亭的作用下, 大鼠在哺乳期间乳汁不足, 导致部分仔鼠出现死亡现象。前3天无仔鼠死亡现象, M组从第5天开始出现仔鼠死亡, 从第6天起, 与B组比较, M组仔鼠存活率差异极显著(p < 0.01), 到第8天仔鼠存活率仅为77.78%。与M组比较, OH高剂量组仔鼠存活率在第6天有极显著差异(p < 0.01), OH中剂量组在第5天出现仔鼠死亡, 第6天仔鼠存活率具有显著差异(p < 0.05)、OH低剂量组由于剂量较低以及个体差异性, 从第4天开始就出现仔鼠死亡, 与M组比较, 差异不显著(p > 0.05)(表8)。仔鼠存活率结果能从侧面反映OH能够提高大鼠泌乳量, 从而提高仔鼠存活率。
表8 仔鼠存活率( X - ± SD, n=12 ) (单位: %)

Tab. 8 Survival rate of their offspring ( X - ± SD, n=12)

组别 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天
B组 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00
M组 100±0.00 100±0.00 94.44±8.61 88.88±6.21## 84.72±3.40## 77.78±4.30##
P组 100±0.00 100±0.00 100±0.00 98.61±3.40* 95.84±4.56** 87.50±4.57**
OH-L组 100±0.00 97.22±4.30 98.61±3.40 98.61±3.40* 87.50±4.57##△△ 81.94±3.40△
OH-M组 100±0.00 100±0.00 98.61±3.40 95.84±4.56 94.45±4.30** 84.72±3.40**
OH-H组 100±0.00 100±0.00 100±0.00 100±0.00** 98.61±3.40** 93.06±3.40**△

注: 与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

2.5 血清和乳腺组织PRL、PRLR及血清DA的含量测定

与B组比较, M组血清和乳腺组织PRL、PRLR含量明显减少(p < 0.05); 与M组比较, P组血清和乳腺组织PRL、PRLR含量显著增加(p < 0.05)(图2)。图2a显示: 与M组比较, OH高、中剂量组血清、乳腺组织PRL含量均显著增加(p < 0.05), 血清中OH高剂量组作用效果最明显(p < 0.01), 中剂量组次之(p < 0.05), 低剂量组不明显(p > 0.05), OH高、中剂量组乳腺组织PRL含量与B组差异不显著(p > 0.05)。图2b显示: 与M组比较, OH各剂量组血清和乳腺组织PRLR含量显著提高(p < 0.05); 血清PRLR含量测定结果表明, 与P组比较, OH各剂量组无显著性差异(p > 0.05), 乳腺组织PRLR含量测定结果表明, 与B组比较, OH各剂量组差异不显著(p > 0.05)。以上结果表明, OH能够增加缺乳大鼠血清和乳腺组织PRL、PRLR含量, 且OH组血清和乳腺组织PRL、血清PRLR含量与P组结果相似, 基本可达到阳性对照组水平。
图2 缺乳大鼠血清和乳腺组织催乳素(PRL, a)、催乳素受体(PRLR, b)的质量浓度 ( X - ± SD, n=6 )

与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

Fig. 2 Content of PRL (a) and PRLR (b) in mammary gland and serum of postpartum lactation deficient rats ( X - ± SD, n=6)

与B组比较, M组血清DA含量极显著增加(p < 0.01), OH各剂量组血清DA含量均极显著降低(p < 0.01), P组、OH高剂量组与B组之间差异不显著(p > 0.05)(图3)。说明灌胃甲磺酸溴隐亭能够增加缺乳大鼠血清DA含量, 而OH能够降低血清DA含量, 作用效果与剂量呈正相关, 且OH高剂量组能基本恢复到正常水平。
图3 缺乳大鼠血清多巴胺(DA)质量浓度( X - ± SD, n=6 )

与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

Fig. 3 Content of DA in serum of postpartum lactation deficient rats ( X - ± SD, n=6)

2.6 乳腺组织LC、TG和血液MCHC、RBC的含量测定

LC和TG是母乳的主要成分, 乳腺组织上皮细胞则是合成这两种物质的重要场所。OH高、中剂量组乳腺组织中LC的质量浓度均显著高于M组(p < 0.05), 低剂量组效果不明显(p > 0.05); P组、OH高剂量组乳腺组织TG浓度高于M组(p < 0.05), 而OH中、低剂量组效果不显著(p > 0.05)(图4)。
图4 缺乳大鼠乳腺组织中乳糖(LC)和甘油三酯(TG)含量( X - ± SD, n=6 )

与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

Fig. 4 Content of LC and TG in mammary gland of postpartum lactation deficient rats ( X - ± SD, n=6)

与B组比较, M组MCHC、RBC含量显著降低(p > 0.05); 与M组比较, P组、OH高、中、低剂量组MCHC、RBC含量均显著增高(p < 0.05)。与P组比较, MCHC含量差异不显著(p > 0.05), 与B组比较, RBC差异不显著(p > 0.05)。提示灌胃甲磺酸溴隐亭会导致大鼠平均血红蛋白含量、红细胞数降低, 而OH可使缺乳大鼠平均血红蛋白含量、红细胞数增加, 且MCHC、RBC含量与P组效果相似, RBC甚至恢复到B组水平(图5)。
图5 缺乳大鼠平均血红蛋白质量浓度(MCHC)和红细胞数(RBC)( X - ± SD, n=6 )

与B组比较, #表示差异显著(p < 0.05), ##表示差异极显著(p < 0.01); 与M组比较, *表示差异显著(p < 0.05), **表示差异极显著(p < 0.01); 与P组比较, △表示差异显著(p < 0.05), △△表示差异极显著(p < 0.01)

Fig. 5 Content of MCHC and RBC of postpartum lactation deficient rats ( X - ± SD, n=6)

3 讨论

乳母膳食成分的摄入可直接影响乳汁营养成分, 而母乳作为婴幼儿最佳营养来源, 其成分安全性关乎婴幼儿健康成长(林怀美 等, 2021)。相关研究表明, 乳汁中的乳糖、脂肪、蛋白质含量与膳食中的碳水化合物、脂肪含量及蛋白质含量有相关性(杨华 等, 2017)。OH基本营养成分含量丰富, 是一种高蛋白低脂肪的物质, 而喂食高蛋白、低碳水化合物膳食的哺乳期大鼠能显著提高血清中PRL浓度以及乳腺中的SNAT2蛋白丰度(Velázquez-Villegas et al, 2015), 因此OH对母乳的合成具有积极作用, 对产妇体型的恢复影响较小。OH氨基酸含量丰富, 种类齐全, 游离氨基酸中, 蛋氨酸(4.67%)、赖氨酸(9.71%)等必需氨基酸含量较高, 而蛋氨酸、赖氨酸可以通过激活乳腺上皮细胞中的信号传导及转录激活蛋白5 (signal transducer and activator of transcription, STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路来增加β-酪蛋白mRNA的丰度, 促进乳腺上皮细胞乳蛋白合成; OH中支链氨基酸比例高(18.9%), 而支链氨基酸能在乳腺组织代谢中发挥调节作用, 如亮氨酸可激活哺乳动物mTOR信号通路靶点, 促进乳腺上皮细胞蛋白质合成(Lei et al, 2012)。同时, OH中还含有较高比例的精氨酸(7.3%), 而精氨酸能够通过调节乳腺组织miRNAs潜在地促进乳腺组织的发育(Zhou et al, 2021a)。近年来, 肽对乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响受到广泛关注, 肽能够促进乳腺发育, 且其合成乳蛋白的效率优于游离氨基酸, 而小肽的浓度和肽包含的氨基酸组成是影响乳蛋白合成的重要因素(付琳 等, 2020), 而血液中的肽与氨基酸结合能够形成肽结合氨基酸，并通过多肽转运体运输到乳腺上皮细胞, 进入细胞后水解为游离氨基酸, 能够上调哺乳动物mTOR信号通路(Zhou et al, 2021b)。通过试验观察可知, OH能够使乳腺组织腺泡充盈, 腺泡数量增加, 其可能是OH中的肽(33.4%)和游离氨基酸(50%)经乳腺快速吸收和利用, 促进了乳腺的发育, 可能加快了泌乳蛋白的合成, 与谷子林等(2020)发现, 在基础日粮中添加复方中药小肽, 可以提高母兔泌乳能力以及仔兔存活率有相似的结论, 从仔鼠存活率的变化对比结果也可以再次论证, OH可以促进乳腺发育, 提高哺乳期泌乳量和子代的存活性能。
乳汁的分泌过程极其复杂, 人类的泌乳调节机制属于PRL依赖型, 与鼠类接近。PRL属于一种多肽类激素, 当处于哺乳状态时, PRL与乳腺组织中的PRLR结合能够激活JAK2/STAT5信号通路, 促进乳腺发育, 刺激并维持泌乳(Zhang et al, 2019; Paré et al, 2020), 目前许多催乳剂都是通过提高PRL的分泌来实现催乳效果(Luke et al, 2021), 通过添加外源性PRL也能够促进乳腺的发育(Josephine et al, 2008), 因此PRL的分泌水平提高是解决缺乳问题的关键。灌胃甲磺酸溴隐亭后, 模型组大鼠血清和乳腺组织PRL、PRLR含量减少, 泌乳量降低, 成功复制出产后缺乳模型。灌胃OH组血清和乳腺组织PRL、PRLR含量均显著提高, 血清DA含量极显著降低, 该结果与胡培丽等(2014)、谌素华等(2021)等研究结果一致。推测OH可能通过介导下丘脑-垂体-卵巢轴负反馈调节机制, 降低血清中DA含量, 而低水平的DA与多巴胺D2受体的结合位点减少, 垂体PRL分泌得到释放, 因此血清与乳腺组织PRL、PRLR含量增加, PRL与PRLR结合位点增加, 调节产后缺乳激素水平恢复正常, 使泌乳通道顺畅, 改善缺乳症。
LC是乳腺中乳汁渗透压调节剂, 是影响产奶量的关键因素; 乳中主要的脂类物质是TG, TG的合成量是评定外源脂肪酸能否促进乳汁中脂肪合成的重要指标(Lin et al, 2016; 李君 等, 2019), 而乳腺组织是合成TG和LC的重要场所。本文结果表明, OH各剂量组均能够提高乳腺组织中LC含量, 而TG测定结果表明, OH高剂量组TG含量较模型组显著, 但中、低剂量组效果不明显。其原因可能是LC、TG的合成需要葡萄糖, 脂肪等前体物质, 而OH中糖相对于脂肪来说含量较高, 因此可能对乳腺组织中LC以及TG的合成产生一定影响, LC、TG的增加从侧面反映OH对乳汁的合成, 乳成分的调节具有一定的影响。中医理论认为母乳为气血所化, 无血不成乳(高亚红, 2016), 产后气血亏虚是导致缺乳的重要原因。采用甲磺酸溴隐亭建立的产后缺乳模型母鼠形体消瘦, 四肢末端近似苍白, 与中兽医诊断的“气血亏虚”型产后缺乳症状相似(王一飞 等, 2018)。本试验的阳性对照为补血生乳颗粒, 其功效主要是补益气血, 通络生乳, 阳性对照组与OH组均提高了MCHC含量及RBC数量, 且和阳性对照组相比无明显差别, 推测OH对机体血红蛋白的合成、红细胞数量的增加具有促进作用(曾新斌, 2011), 对“气血亏虚”型产后缺乳具有改善作用。

4 结论

牡蛎酶解产物能够使乳腺组织腺泡增加, 腺泡充盈, 显著提高产后缺乳大鼠的泌乳量, 从而提高仔鼠存活率, 证实了牡蛎酶解产物具有一定的促进泌乳功效。其可能与提高血清和乳腺组织中的PRL、PRLR含量, 降低血清中DA水平, 改善乳腺组织发育相关。同时, OH还提高了乳腺组织中LC、TG含量, 间接证明OH对催乳起到一定的作用, 此外, OH能够提高MCHC以及RBC, 对产后气血虚弱有一定的改善作用。本试验就牡蛎酶解产物对产后缺乳症的影响进行了初步探究, 证实了牡蛎酶解产物是一种能够改善缺乳症的天然活性物质, 此外, 牡蛎作为一种药食同源的物质, 安全性较高, 与传统的中药汤剂与药物治疗相比有较大的优势, 牡蛎酶解产物在催乳产品方面的应用能为食疗理论和现代营养学的有机结合提供参考依据。但目前, 牡蛎酶解产物促进泌乳的机制尚不够完善, 仍需要更进一步探究。

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