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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 4: 133 - 145

DOI: https://doi.org/10.11978/2022183

海洋生物学

除草剂乙草胺胁迫下两种软珊瑚生理响应

  • 郁强 , 1, 2 ,
  • 董娴娴 1, 2 ,
  • 李长青 3 ,
  • 张欣 3 ,
  • 赵国理 1, 2 ,
  • CHIN Yaoxian 1, 2 ,
  • 王沛政 , 1, 2
展开
  • 1.海南省近岸海洋生态环境过程与碳汇重点实验室, 海南 三亚 572022
  • 2.海南热带海洋学院崖州湾创新研究院, 海南 三亚 572022
  • 3.海南三亚国家级珊瑚礁自然保护区管理处, 海南 三亚 572000
王沛政, email: ; CHIN Yaoxian, email:

郁强(1997—), 男, 江苏省南通市人, 硕士研究生, 从事海洋生物遗传多样性研究。email:

Copy editor: 姚衍桃

收稿日期: 2022-08-23

  修回日期: 2022-10-06

  网络出版日期: 2022-10-11

基金资助

海南省自然科学基金(321MS0821)

收起

Physiological responses of two soft corals to herbicide acetochlor stress

  • YU Qiang , 1, 2 ,
  • DONG Xianxian 1, 2 ,
  • LI Changqing 3 ,
  • ZHANG Xin 3 ,
  • ZHAO Guoli 1, 2 ,
  • CHIN Yaoxian 1, 2 ,
  • WANG Peizheng , 1, 2
Expand
  • 1. Hainan Provincial Key Laboratory of Marine Ecological Environment Processes and Carbon Sequestration, Sanya 572022, China
  • 2. Yazhou Bay Innovation Research Institute, Hainan Institute of Tropical Oceanography, Sanya 572022, China
  • 3. Hainan Sanya National Coral Reef Nature Reserve Management Office, Sanya 572000, China
WANG Peizheng. email: ; CHIN Yaoxian. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2022-08-23

  Revised date: 2022-10-06

  Online published: 2022-10-11

Supported by

Natural Science Foundation of Hainan Province(321MS0821)

Fold

摘要

文章以乙草胺(acetochlor, ACT)为环境胁迫因子, 利用不同浓度的乙草胺对肉质软珊瑚(Sarcophyton sp.)和短指软珊瑚(Sinularia sp.)进行长期和短期胁迫, 以研究胁迫下的珊瑚生理指标变化情况。研究结果显示, 肉质软珊瑚和短指软珊瑚受到不同浓度乙草胺胁迫后, 珊瑚的叶绿素a和虫黄藻含量呈现先升高后降低的趋势, 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性持续升高然后降低并保持低活性水平, 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)活性先升高后逐渐降低, 谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione s-transferase, GST)活性升高并保持在较高水平。胁迫后肉质软珊瑚的共生虫黄藻多样性变低, 而短指软珊瑚的共生虫黄藻则是丰富度变低。丰度高的虫黄藻都属于系群C, 而短指软珊瑚G系群丰度升高。胁迫后软珊瑚Cyanobacteria(蓝细菌)丰度逐渐增加, Firmicutes(厚壁菌门)丰度逐渐减少。以上结果表明, 肉质软珊瑚(Sarcophyton sp.)和短指软珊瑚(Sinularia sp.)在受到乙草胺胁迫后, 其珊瑚生理指标产生了较大变化。

关键词： 软珊瑚; 乙草胺; 虫黄藻; 生理指标

本文引用格式

郁强 , 董娴娴 , 李长青 , 张欣 , 赵国理 , CHIN Yaoxian , 王沛政 . 除草剂乙草胺胁迫下两种软珊瑚生理响应[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(4) : 133 -145 . DOI: 10.11978/2022183

Abstract

In this paper, using acetochlor (ACT) as the stress environment, the long-term and short-term stress of Sarcophyton sp. and Sinularia sp. with different concentrations of acetochlor were used to study the stress changes in coral physiological indicators. Studies have shown that the chlorophyll a and zooxanthellae contents of succulent soft corals and brachydactyly soft corals increased first and then decreased after different concentrations of acetochlor stress. Superoxide dismutase (SOD) and Catalase (CAT) activity will continue to increase and then decrease and maintain a low level, Alkaline Phosphatase (AKP) activity will first increase and then gradually decrease, Glutathione S-Transferase (GST) activity increased and maintained at a high level. The symbiotic zooxanthellae diversity of succulent soft corals became lower, while the abundance of symbiotic zooxanthellae of Brachydactyly soft corals became lower. The zooxanthellae with high abundance all belonged to group C, while the abundance of group G of Brachydactyly was increased. The abundance of soft coral Cyanobacteria gradually increased and the abundance of Firmicutes gradually decreased after stress. The above studies showed that acetochlor had great changes in coral physiological indicators after the stress of Sarcophyton sp. and Sinularia sp..

Key words： soft coral; acetochlor; zooxanthellae; Physiological indicators

珊瑚礁是热带海洋系统中重要的生态系统, 对于维持海洋资源平衡、渔业资源再生、生态旅游观光、海洋药物开发和海岸线保护等起到重要作用(赵美霞 等, 2006)。软珊瑚属于珊瑚礁的重要组成部分, 具有极强的药用价值。在我国海南岛周边及南海软珊瑚种类资源十分丰富。近年来, 珊瑚礁生态系统不仅受到全球气候变化的影响, 同时也遭受着生活污水、工业废水排放等人类活动的侵害(Degeorges et al, 2010; Reopanichkul et al, 2010), 以及随着农业的发展, 越来越多的农药产品, 也通过地表径流或污水排放被释放到海洋环境中(Risk et al, 2009), 生活在近海岸的珊瑚礁群落受农药产品的影响也越发明显。乙草胺(acetochlor, ACT)是一种以氯乙酰胺为主要成分的除草剂, 是我国使用最广泛的除草剂之一(Nemeth-konda et al, 2002)。除草剂一般都是通过水体从农田生态系统向水生生态系统转移, 而且也会通过食物链向上传递, 对水生生态系统中的动植物造成伤害(Harris et al, 2008)。ACT在美国春秋季的地表水和饮用水中被检出, 成为了美国中西部流域潜在的生态风险主要因素之一(Hladik et al, 2008)。近年来, 在地下水、地表水、海水、水生生物群以及沉积物中经常检测到有机农药的成分(Barbash et al, 2001)。乔丹等(2017)在山东沿海3处海域的海水、沉积物样品中均检测出多种除草剂。多项研究表明农药已经流入了海洋环境之中。部分珊瑚群落生活在浅水或潮间带, 其受除草剂的影响日益增加。有研究发现, ACT会导致鱼类甲状腺激素等相关基因的特异性表达, 致使其甲状腺激素(thyroid hormones, THs)相关基因发生突变(Li et al, 2009), 会破坏斑马鱼甲状腺功能并影响其胚胎发育(Xu et al, 2019), 会诱发斑马鱼肾脏和肝脏的损伤, 致使抗氧化系统功能障碍, 并影响到脂肪酸的形成(Li et al, 2016)。对铜绿微囊藻而言, ACT会积聚在铜绿微囊藻中, 对藻类造成氧化损伤并导致其释放毒素(Xie et al, 2019), 高浓度的ACT会抑制铜绿微囊藻的生长(李薪芳 等, 2016)。而在乙草胺胁迫下, 珊瑚群落会受到何等的影响, 目前暂时不得而知。
生物机体对不良环境会产生适应机制(呼光富 等, 2009), 即机体在环境胁迫下产生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS), 机体为了减轻ROS对自身造成的损害(晁华 等, 2016), 又会产生过氧化氢酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(superoxde dismutase, SOD)等抗氧化酶对ROS进行清除, 起到对自身机体的保护作用。珊瑚体内含有共生虫黄藻, 当珊瑚受到环境胁迫时, 虫黄藻也会分泌抗氧化酶来清除机体内的自由基, 从而降低胁迫物质的伤害(Dias et al, 2018; Dias et al, 2019)。氧化还原系统是软珊瑚精准识别并清除病原微生物的重要防御系统, 当外界环境改变时, 软珊瑚的氧化还原系统也会发生一定的改变(陆昊 等, 2019)。谷胱甘肽巯基转移酶(glutathiones-transferase, GST)是所有真核生物解毒过程中的关键Ⅱ期代谢酶(Nicosia et al, 2014)。在环境发生改变后, 不仅抗氧化机制参与了珊瑚的免疫, 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)也会调节珊瑚细胞的稳定性(Palmer et al, 2010)。珊瑚的SOD、CAT和GST活性也因环境中热应激和高光的变化而变化(Teixeira et al, 2013), 因此这些酶活性指标常被用作为珊瑚受到胁迫后的生物标志物(Tang et al, 2018; Dias et al, 2019; 陆昊 等, 2021)。
有研究发现, 珊瑚共生体内的菌落组成是一个动态的组合, 其菌落结构会随着外界因素的改变而改变, 即当珊瑚所处外界环境发生改变时共生菌群落结构也会发生调整(Röthig et al, 2016)。此外, 温度的升高也会改变珊瑚中微生物Endozoicomonas的相对丰度(Shiu et al, 2020); 珊瑚的共生菌在正常环境下拥有相对稳定的微生物群落结构, 但若人为改变它们的微生物群落(Torda et al, 2017; Ziegler et al, 2017), 部分珊瑚会表现出了较为广泛的适热能力。以上种种现象均表明, 一些特异性的细菌群落在提高共生体的环境适应力方面存在巨大潜能, 因此珊瑚共生细菌的变化在一定程度上能够反映珊瑚在受到胁迫后的响应机制。
海南三亚是我国重要的反季节菜篮子基地, 同时也是重要的农业南繁基地。由于热带气候适宜, 杂草一年四季生长, 为控制杂草, 常年需要频繁使用除草剂, 因而不可避免地造成环境中除草剂严重积累。海南三亚周边海域不仅有国家珊瑚礁自然保护区, 而且近岸的礁石海区基本都有珊瑚生长, 构成了典型的热带海洋生态系统。但近10年来由于各种原因, 珊瑚礁退化严重, 而一些礁区造礁石珊瑚群落也被软珊瑚群落替代。目前有关软珊瑚群落受除草剂污染胁迫的生理响应尚未见报道, 本研究旨在阐明海洋环境遭受除草剂污染后, 软珊瑚应对胁迫的响应机制, 为珊瑚礁生态系统的保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 珊瑚材料

肉质软珊瑚(Sarcophyton sp.)和短指软珊瑚(Sinularia sp.)的活体样本均采自三亚, 并长期在实验室水族箱(规格为70cm×50cm×60cm)养殖和繁育。繁育条件为水温28℃, 盐度34‰, 光暗比12h:12h, 水流循环为每小时2000L。

1.2 实验方法

农药对海洋生物的毒性性质和大小主要由农药的化学结构和理化性质决定。农药对海洋生物的毒性表现为对海洋生物的杀灭和生长的抑制作用, 半数生物受其影响通常用药物安全性指标(median effect concentration, EC50)来表示。EC50常常被用来评价农药对环境的安全性, 其毒性分级参考标准(林玉锁 等, 2000)为: 在96h时, EC50>3.0mg·L-1为低毒性, 0.3mg·L-1≤EC50≤3.0mg·L-1为中毒性, EC50<0.3mg·L-1为高毒性。乙草胺浓度梯度设置参照以上标准和李丽君(2006)的方法并加以调整。实验分为两组, 第一组进行短期胁迫实验: 不同浓度的乙草胺短期胁迫两种软珊瑚和一个空白对照, 每组设3个平行。实验处理的浓度分别为: 0.5μg·L-1、2μg·L-1、5μg·L-1和10μg·L-1(李丽君, 2006)。胁迫实验的时间为7d, 在实验过程中分别在0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d进行取样, 同时需要在珊瑚受到胁迫之后的0h、24h和72h分别取样, 用于对其共生虫黄藻和细菌的丰度测定。
第二组进行长期胁迫实验: 不同浓度的乙草胺长期胁迫两种软珊瑚和一个空白对照, 每组设3个平行。实验组的浓度分别为0.1μg·L-1、2μg·L-1、4μg·L-1和8μg·L-1(李丽君, 2006)。整个实验的周期为60d, 在实验过程中分别在1d、7d、15d、30d、45d和60d进行取样。

1.3 叶绿素a、酶活、共生虫黄藻及细菌丰度的测定方法

叶绿素a含量测定参考Murray等(2011)的方法。共生虫黄藻密度测定参考雷新明(2008)的报道, 蛋白质浓度测定采用上海索桥生物科技有限公司和南京建成生物工程研究所的试剂盒。准确称取组织重量, 按重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入生理盐水后, 置于冰浴的研钵中迅速研磨成10%的组织匀浆液。用冷冻离心机离心(3000r·min-1, 10min, 4℃), 取定量上清液用生理盐水稀释, 用试剂盒(A001、A007、A059和A004, 南京建成, 中国)测定稀释液中的SOD、CAT、AKP和GST活性, 最后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(QS3202, 索莱宝, 中国)测定各样品的总蛋白含量, 分别使用公式计算, 将5种酶活性的单位统一为U·mg-1。软珊瑚共生细菌和虫黄藻丰度测定方法: 利用虫黄藻ITS2基因(~320bp)特异性扩增引物GTL2-F:5’-GAATTGCAGAACTCCGTG-3’和GTL2-R:5’-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’(Lajeunesse et al, 2000), 细菌16rRNA基因(~468bp)特异性扩增引物338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’(Moreno et al, 2002)进行PCR扩增, 之后所有样品送上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。

1.4 数据处理

对样本进行多样性分析(Alpha多样性)可以反映出微生物群落的丰度和多样性, Chao指数可以反映出群落的混乱程度, Ace指数可以反映出群落的丰富度, 其中Chao指数和Ace指数是生态学中估计物种总数的常用指数。Shannon指数可以反映群落的多样性, Shannon值越大, 说明群落多样性越高; Simpson对物种的均匀度更为明显, Simpson指数值越大, 说明群落多样性越低; Simpson指数和Shannon指数可以在生态学中定量描述一个区域的生物多样性。Coverage可以表示出各样本文本库的覆盖率, 其数值越高, 则样本中序列被检出的概率越高, 而没有被检出的概率越低。Coverage指数可以反映出本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。各项指数均在美吉生物云平台分析得到, 本实验分别计算这5种指数, 并以此对乙草胺胁迫后的珊瑚共生细菌和虫黄藻丰度做出评价。
Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接, 同时对序列质量进行质控和过滤, 得到最终的有效数据。利用Uparse软件对质量筛选后的所有序列进行聚类, 以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU), 并选取OTU中出现次数最多的序列作为OTU的代表性序列。OTU代表性序列取得分类学信息后, 分别在各个分类水平上统计每个样本的群落组成。序列Alpha多样性分析均在美吉生物云平台上进行。

2. 结果与讨论

2.1 乙草胺短期胁迫实验

2.1.1 乙草胺短期胁迫对软珊瑚虫黄藻和叶绿素a的影响

肉质软珊瑚和短指软珊瑚在受到不同浓度乙草胺胁迫之后的24h内单位面积的叶绿素a含量均出现了明显下降趋势(图1), 且乙草胺浓度越高, 软珊瑚单位面积的叶绿素a含量下降越快; 24h后, 两种软珊瑚的叶绿素a含量开始回升, 其中短指软珊瑚的叶绿素a含量恢复更快(图1)。对比两个空白对照组, 肉质软珊瑚的叶绿素a含量较短指软珊瑚低。
图1 不同浓度乙草胺胁迫下肉质软珊瑚(a)和短指软珊瑚(b)的单位面积叶绿素a浓度变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.5μg·L-1表示软珊瑚在0.5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 5μg·L-1表示软珊瑚在5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 10μg·L-1表示软珊瑚在10μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 1 Changes of chlorophyll a per unit area of the Sarcophyton sp. (a) and Sinularia sp. (b) under different concentrations of acetochlor

2.1.2 乙草胺短期胁迫对软珊瑚酶活性的影响

当受到不同浓度乙草胺胁迫时, 两种珊瑚的CAT活性都呈现出逐渐升高的趋势(图2、图3)。当乙草胺浓度为0.5μg·L-1时, 肉质软珊瑚的CAT活性在第四天时达到峰值, 为25.66U·mg-1, 之后下降; 当乙草胺浓度为2μg·L-1、5μg·L-1和10μg·L-1时, 短指软珊瑚不同处理的CAT活性均在第五天出现峰值, 分别为10.33U·mg-1、10.84U·mg-1和11.59U·mg-1。以上数据表明, 受到不同浓度乙草胺胁迫时, 胁迫浓度越大, 两种珊瑚的CAT活性也越大, 而且肉质软珊瑚的CAT活性较短指软珊瑚高2~3倍。
图2 不同浓度乙草胺胁迫下肉质软珊瑚CAT、AKP、SOD、GST活性的变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.5μg·L-1表示肉质软珊瑚在0.5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示肉质软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 5μg·L-1表示肉质软珊瑚在5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 10μg·L-1表示肉质软珊瑚在10μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 2 Changes in the activities of CAT, AKP, SOD, GST enzymes of Sarcophyton sp. under different concentrations of acetoxine stress

图3 不同浓度乙草胺胁迫下短指软珊瑚CAT、AKP、SOD、GST活性的变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.5μg·L-1表示短指软珊瑚在0.5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示短指软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 5μg·L-1表示短指软珊瑚在5μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 10μg·L-1表示短指软珊瑚在10μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 3 Changes in the activities of CAT, AKP, SOD, GST enzymes of Sinularia sp. under different concentrations of acetochlor stress

受到不同浓度乙草胺胁迫时, 两种珊瑚的AKP活性均呈现先短暂降低后升高再降低的趋势(图2、图3)。数据表明, 受到不同浓度乙草胺胁迫时, 乙草胺浓度越大两种珊瑚的AKP活性升高也越大, 最大变化量可以达到正常时的3倍。
SOD为抗氧化防御性功能酶, 不同浓度乙草胺短期胁迫处理下, 两种珊瑚的SOD活性均呈现明显升高的趋势(图2、图3), 且乙草胺浓度越高, 胁迫的时间越长, 软珊瑚的SOD活性值越大。同时实验表明, 肉质软珊瑚较短指软珊瑚SOD活性低3倍左右, 其原因有待进一步分析。
在不同浓度乙草胺胁迫下, 两种珊瑚的GST活性均呈现稳定上升趋势, 且乙草胺浓度越高, 胁迫时间越长, GST活性上升越快(图2、图3)。实验数据表明, 肉质软珊瑚较短指软珊瑚GST活性高2倍左右, 其原因也有待进一步分析。

2.1.3 乙草胺短期胁迫下软珊瑚共生虫黄藻的Alpha多样性分析

乙草胺短期胁迫下短指软珊瑚共生虫黄藻的Alpha多样性分析结果显示, 各个样本的覆盖率均为1, 样本数据的可靠性较高(表1)。短指软珊瑚受到乙草胺短期胁迫后, S72S4组的Shannon指数和Simpson指数分别为0.287和0.890, 表示珊瑚在受到高浓度的乙草胺胁迫后, 珊瑚内虫黄藻的多样性变高; S0S0空白组的Ace和Chao指数分别为7.4和6.5, 而S24S8组的Ace和Chao指数分别为4.0和8.5, 表示珊瑚受到乙草胺胁迫之后珊瑚内的虫黄藻丰富度变低。
表1 短指软珊瑚虫黄藻多样性指数表

Tab. 1 Zooxanthellae diversity index of Sinularia sp.

实验类别 Shannon指数 Simpson指数 Ace指数 Chao指数 Coverage指数
S0S0 0.165±0.003 0.945±0.001 7.4±1.38 6.5±0.5 1
S24S0.5 0.347±0.051* 0.867±0.021* 4.5±0.21* 8.5±0.5 1
S24S4 0.488±0.156* 0.798±0.073* 4.6±0.15 7.0±1.0 1
S24S8 0.279±0.031 0.902±0.009 4.0±0.14* 8.5±0.5 1
S72S0.5 0.273±0.024* 0.895±0.008* 3.0±0.95* 6.5±0.5 1
S72S4 0.287±0.005* 0.890±0.001* 3.0±1.13* 6.5±0.5 1
S72S8 0.223±0.025* 0.922±0.012* 7.0±1.07 7.0±0.6 1

注: *表示数据差异性显著(P<0.5)。S0S0表示短指软珊瑚空白组; S24S0.5、S24S4、S24S8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后短指软珊瑚的状态; S72S0.5、S72S4、S72S8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后短指软珊瑚的状态

乙草胺短期胁迫下肉质软珊瑚共生虫黄藻的Alpha多样性分析结果显示, 各个样本的覆盖率均为1, 样本数据的可靠性高(表2)。当肉质软珊瑚受到胁迫后, M24M8组的Shannon指数和Simpson指数分别为0.759和0.657, 表示当珊瑚受到高浓度乙草胺胁迫后, 珊瑚内共生虫黄藻多样性变低, 均匀度变高; M0M0空白组的Ace指数和Chao指数分别为4和7, 而M24M8组分别为9.5、9.0以及M72M8组分别为9.1和 8.5, 表示珊瑚受到乙草胺胁迫之后珊瑚内的虫黄藻丰富度变低。
表2 肉质软珊瑚的虫黄藻多样性指数表

Tab. 2 Zooxanthellae diversity index of Sarcophyton sp.

实验类别 Shannon指数 Simpson指数 Ace指数 Chao指数 Coverage指数
M0M0 1.042±0.006 0.488±0.009 4.0±0.76 7.0±1.0 1
M24M0.5 1.049±0.025 0.499±0.002 4.5±0.38 8.0±0.2 1
M24M4 1.029±0.008 0.503±0.005 8.0±1.23 8.0±0.1 1
M24M8 0.759±0.292* 0.657±0.155* 9.5±1.5 9.0±1.0* 1
M72M0.5 1.066±0.055 0.498±0.018 4.0±0.28 8.0±0.3 1
M72M4 1.018±0.006 0.506±0.005 4.0±0.09 7.5±0.5 1
M72M8 0.749±0.283* 0.660±0.155* 9.1±0.06* 8.5±0.5* 1

注: *表示数据差异性显著(P<0.5)。M0M0表示肉质软珊瑚空白组; M24M0.5、M24M4、M24M8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后肉质软珊瑚的状态; M72M0.5、M72M4、M72M8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后肉质软珊瑚的状态

2.1.4 乙草胺短期胁迫下软珊瑚共生虫黄藻的组成分析

乙草胺短期胁迫下软珊瑚共生虫黄藻的组成分析结果显示, 除8μg·L-1浓度乙草胺, 其他处理组在短期胁迫24h和72h后, 肉质软珊瑚共生虫黄藻OTU的组成变化不明显(图4)。除了4μg·L-1浓度乙草胺短期胁迫24h后短指软珊瑚共生虫黄藻OTU51丰度有所下降外, 其余组成变化不明显。对比肉质软珊瑚与短指软珊瑚共生虫黄藻的组成发现, 短指软珊瑚共生虫黄藻OTU51丰度显著比肉质软珊瑚共生虫黄藻OTU51丰度大很多, 而OTU49丰度则显著比肉质软珊瑚共生虫黄藻OTU49小很多, 反映了肉质软珊瑚与短指软珊瑚在不同物种方面的共生虫黄藻丰度差异。
图4 两种珊瑚受到乙草胺胁迫后的共生虫黄藻OTU组成图

M0表示肉质软珊瑚空白组; M2405、M244、M248分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后肉质软珊瑚的状态; M7205、M724、M728分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后肉质软珊瑚的状态。S0表示短指软珊瑚空白组; S2405、S244、S248分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后短指软珊瑚的状态; S7205、S724、S728分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后短指软珊瑚的状态。OTU51、OTU49、OTU38、OTU58、OTU36、OTU14、OTU21、OTU42、OTU54代表不同虫黄藻亚种

Fig. 4 Composition of the OTU of two kinds of corals after acetoxaline stress

通过常用的9个系群(clade)设置和比对, 对上述软珊瑚共生虫黄藻的不同OTU进行系统进化树构建(图5), 结果显示上述OTU被分为两个系群——C系群和G系群。肉质软珊瑚与短指软珊瑚共生虫黄藻的绝大部分细菌群落组成为C系群, 肉质软珊瑚共生虫黄藻的多样性高于短指软珊瑚。
图5 珊瑚共生虫黄藻分类图

Fig. 5 Coral symbiotic xanthophyllum taxonomy

2.1.5 乙草胺胁迫对珊瑚共生细菌的Alpha多样性和组成分析

肉质软珊瑚细菌的多样性指数计算结果显示, 肉质软珊瑚的Ace指数和Chao指数均较空白组要小(表3), 表明在乙草胺短期胁迫下肉质软珊瑚细菌群落的丰富度下降。随着乙草胺胁迫时间和浓度的增加, 短指软珊瑚细菌群落的多样性也出现降低。
表3 肉质软珊瑚细菌多样性指数表

Tab. 3 Bacterial diversity index of Sarcophyton sp.

实验类别 Shannon指数 Simpson指数 Ace指数 Chao指数 Coverage指数
M0M0 5.116±0.267 0.019±0.003 743.1±119.5 744.2±121.8 1
M24M0.5 4.257±0.468* 0.079±0.023* 580.0±140.3* 580.6±137.1* 1
M24M4 3.170±0.046* 0.221±0.019* 400.1±26.8* 401.1±29.5* 1
M24M8 3.595±0.541* 0.189±0.078* 763.5±99.5 768.6±64.9 1
M72M0.5 3.932±0.248 0.087±0.001* 519.1±51.0 529.9±45.1 1
M72M4 3.375±0.193* 0.158±0.004* 523.1±45.5 527.4±42.1 1
M72M8 5.023±1.039 0.032±0.004 1065.2±49.7 1075.6±65.4 1

注: *表示数据差异性显著(P<0.5)。M0M0表示肉质软珊瑚空白组; M24M0.5、M24M4、M24M8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后肉质软珊瑚的状态; M72M0.5、M72M4、M72M8分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后肉质软珊瑚的状态

当肉质软珊瑚受到乙草胺胁迫时, 随着乙草胺浓度和胁迫时间的增加, 肉质软珊瑚群落中的Cyanobacteria(蓝细菌)丰度逐渐增加, Firmicutes(厚壁菌门)丰度逐渐减少(图6)。当短指软珊瑚受到不同浓度或不同时间的乙草胺胁迫时, Bacteroidota(拟杆菌门)和Actinobacteriota(放线菌门)的丰度呈现不同程度的波动, 但变化不大; Proteobacteria(变形菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)丰度也变化不大。
图6 乙草胺胁迫实验中两种珊瑚在门水平上的细菌群落组成图

M0表示肉质软珊瑚空白组; M2405、M244、M248分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后肉质软珊瑚的状态; M7205、M724、M728分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后肉质软珊瑚的状态。S0表示短指软珊瑚空白组; S2405、S244、S248分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫24h后短指软珊瑚的状态; S7205、S724、S728分别表示在0.5μg·L-1、4μg·L-1、8μg·L-1乙草胺浓度胁迫72h后短指软珊瑚的状态

Fig. 6 Composition (gate level) of two coral bacterial communities in the acetoxaline stress experiment

2.2 乙草胺长期胁迫实验

2.2.1 乙草胺长期胁迫对软珊瑚虫黄藻和叶绿素a的影响

不同浓度乙草胺长期胁迫下, 肉质软珊瑚和短指软珊瑚的单位面积叶绿素a含量均呈现略微升高后转为下降趋势(图7)。其中, 肉质软珊瑚60d内单位面积叶绿素a含量一直下降, 而短指软珊瑚的单位面积叶绿素a含量持续下降30d后趋于稳定。
图7 不同浓度乙草胺胁迫下肉质软珊瑚(a)和短指软珊瑚(b)单位面积叶绿素a含量的变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.1μg·L-1表示软珊瑚在0.1μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 4μg·L-1表示软珊瑚在4μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 8μg·L-1表示软珊瑚在8μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 7 Changes of chlorophyll a per unit area of the Sarcophyton sp. (a) and Sinularia sp. (b) under different concentrations of acetochlor

2.2.2 乙草胺长期胁迫对软珊瑚酶活性的影响

不同浓度乙草胺长期胁迫时, 两种珊瑚的CAT活性均呈现先升高后逐渐降低的趋势, 且乙草胺浓度越高, 珊瑚的CAT活性升高越快(图8、图9)。当乙草胺的胁迫浓度为8μg·L-1时, 肉质软珊瑚和短指软珊瑚的CAT活性在胁迫后第15天出现峰值, 分别为34.58U·mg-1和11.02U·mg-1; 与同组其他时间段的数据比较, 差异性显著(P≤0.05), 而对照组各时间段的CAT差异不显著。
图8 不同浓度乙草胺胁迫下肉质软珊瑚CAT、AKP、SOD、GST活性的变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.1μg·L-1表示肉质软珊瑚在0.1μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示肉质软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 4μg·L-1表示肉质软珊瑚在4μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 8μg·L-1表示肉质软珊瑚在8μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 8 Changes in the activities of CAT, AKP, SOD, GST enzymes of Sarcophyton sp. under different concentrations of acetoxine stress

图9 不同浓度乙草胺胁迫下短指软珊瑚CAT、AKP、SOD、GST活性的变化

0μg·L-1表示为空白对照组; 0.1μg·L-1表示短指软珊瑚在0.1μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 2μg·L-1表示短指软珊瑚在2μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 4μg·L-1表示短指软珊瑚在4μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫; 8μg·L-1表示短指软珊瑚在8μg·L-1的乙草胺浓度下遭受胁迫

Fig. 9 Changes in the activities of CAT, AKP, SOD, GST enzymes of Sinularia sp. under different concentrations of acetochlor stress

不同浓度乙草胺长期胁迫时, 两种珊瑚的AKP活性均呈现先升高后降低的趋势(图8、图9); 高浓度组(4μg·L-1和8μg·L-1)的AKP酶活性升高速率快, 低浓度组(0.1μg·L-1和2μg·L-1)的AKP酶活性变化则较为平缓。
不同浓度乙草胺长期胁迫时, 两种珊瑚的SOD活性呈现出先升高后降低的趋势, 但降低趋势相对较慢(图8、图9); 在受到不同浓度乙草胺长期胁迫后, 短指软珊瑚的SOD活性在60d后依然很高。
不同浓度的乙草胺长期胁迫时, 两种珊瑚的GST活性均呈现先升高后逐渐下降的趋势; 乙草胺浓度越高, GST升高越快(图8、图9), 短指软珊瑚的GST活性在60d后依然较高。

3 讨论

3.1 乙草胺胁迫对珊瑚虫黄藻和叶绿素a的影响

在两种软珊瑚受到不同浓度的乙草胺短期胁迫实验中, 肉质软珊瑚和短指软珊瑚单位面积内的虫黄藻密度以及肉质软珊瑚的叶绿素a含量变化趋势相似, 均呈现先降低后波动升高的状态。而短指软珊瑚的叶绿素a含量变化趋势较为显著, 呈现先降低后平缓上升的趋势。李俊杰等(2020)的研究表明, 随着乙草胺浓度的增加, 水华微囊藻的叶绿素a含量会逐渐降低, 这可能是因为ACT对水华微囊藻光合色素的合成有抑制作用, 从而导致叶绿素a含量的下降。Wang等(2019)的研究表明, 三角褐指藻的叶绿素a含量会随着对氯苯胺浓度的增加而降低; Smythers等(2019)的研究表明, 除草剂拿捕净的暴露会导致小球藻的叶绿素a含量降低。之后叶绿素a和虫黄藻密度的回升则是因为细胞具有一定范围的自我调节能力, 当胁迫压力在可承受区域时, 一段时间后其功能状况可以恢复正常(Abdel-hamid et al, 2011)。当两种珊瑚受到不同浓度的乙草胺长期胁迫时, 叶绿素a含量和虫黄藻密度在前7天出现升高, 但后期整体呈现下降趋势。当外界环境的变化超出了珊瑚虫的耐受临界值时, 虫黄藻的光合能力就会受到抑制, 从而导致光合效率降低(李泽鹏, 2012)。本研究中, 肉质软珊瑚和短指软珊瑚在受到不同浓度的乙草胺胁迫时, 单位面积虫黄藻密度和叶绿素a含量会出现短暂性升高, 这与Tang等(2018)和陆昊等(2019)的研究结果一致。而在长时间的环境胁迫下, 叶绿素a含量和共生藻密度会持续下降, 这与乙草胺对虫黄藻光合作用能力有负面影响的研究结果一致(李薪芳 等, 2016; Xie et al, 2019)。本实验表明两种软珊瑚受浓度为0.1μg·L-1到8μg·L-1的乙草胺胁迫后, 所造成的生理影响是长期的, 其中叶绿素a浓度显著降低, 乙草胺浓度越高, 叶绿素a浓度降低越多。尽管未发现软珊瑚死亡现象, 但叶绿素a浓度降低将影响软珊瑚的能量补给, 从而造成软珊瑚生长减慢, 这都会给珊瑚礁生态系统造成影响。

3.2 乙草胺短期胁迫对珊瑚酶活性的影响

SOD和CAT是生物体内两种非常重要的抗氧化防御性功能酶, 在受到环境中的各种因素胁迫时, 珊瑚内的SOD和CAT活性或含量会随着污染物的胁迫而发生变化(Munn et al, 2008); GST是真核生物在解毒过程中的关键Ⅱ期代谢酶, 参与生物受到胁迫之后的自身的代谢反应; AKP则会参与细胞后期恢复的稳定过程, 在珊瑚受到胁迫后期的恢复阶段发挥非常重要的作用。当珊瑚受到不同浓度的乙草胺短期胁迫时, 起初SOD和CAT活性均呈现稳定上升趋势, 而低浓度的乙草胺胁迫时珊瑚在一周内能够恢复其原来的水平, 而高浓度的乙草胺胁迫使SOD和CAT活性一直处于一个高水平状态。在受到除草剂短期胁迫时, 短指软珊瑚SOD活性增加速度较肉质软珊瑚高好几倍, 这也可能是短指软珊瑚相较于肉质软珊瑚的抗氧化能力更强; 两种珊瑚受到胁迫之后的GST和AKP活性呈稳定升高趋势, 此结果与陆昊等(2019)报道的珊瑚受到微塑料胁迫后GST活性呈现出显著升高并维持在高水平状态的实验结果一致, 有关GST活性后期在什么样的浓度胁迫下并是否可以维持高水平状态仍需要更长期的胁迫实验来验证。本实验表明在不同浓度的乙草胺胁迫后, 两种软珊瑚都对除草剂的胁迫表现出长期的强烈应激反应, 这种应激反应在高浓度胁迫时尤为明显。这种长期的应激反应会对软珊瑚的内部生理生态平衡造成影响。

3.3 乙草胺胁迫对珊瑚共生虫黄藻的影响

实验珊瑚样本中并未检测出虫黄藻D系群, D系群虫黄藻的特点是耐热性较强, 当珊瑚受到所处的外界环境温度变化胁迫时, 珊瑚内部的D系群虫黄藻丰度最高(Silverstein et al, 2017), 可能原因是实验珊瑚样本长期在珊瑚馆养殖, 没有高温环境胁迫条件。实验中每个实验组都检测到了高丰度的C系群, 仅在受到除草剂短期胁迫之后的短指软珊瑚样本中检测到了G系群, 肉质软珊瑚受到胁迫之后其共生虫黄藻优势系群没有发生显著改变。在肉质软珊瑚与短指软珊瑚共生虫黄藻的组成对比中发现, 尽管两种珊瑚的养殖环境一致, 短指软珊瑚共生虫黄藻OTU51丰度比肉质软珊瑚共生虫黄藻OTU51丰度显著大很多, 而OTU49丰度比肉质软珊瑚共生虫黄藻OTU49显著小很多, 显示了两种珊瑚物种共生虫黄藻分群方面的特异性。

3.4 乙草胺胁迫对珊瑚共生菌的影响

研究发现在受到除草剂短期胁迫之后肉质软珊瑚实验组中出现了蓝细菌相对丰度上升的现象。有研究认为蓝细菌与珊瑚属于互相竞争的关系, 会诱发珊瑚发生疾病, 严重时会造成珊瑚礁退化(Rützler et al, 1993)。但同时也有学者认为, 蓝细菌可以抵御高强度的太阳辐射(Hallock et al, 2005)并且参与多种化学生物过程(Reid et al, 2000; Charpy et al, 2010)。本实验表明随着除草剂的不断胁迫, 蓝细菌的相对丰度确实增加了, 这在一定程度上支持了蓝细菌与珊瑚属于互相竞争的关系且会诱发珊瑚发生疾病的观点。

4 结论

1) 两种软珊瑚在不同浓度的乙草胺胁迫后, 叶绿素a以及CAT、AKP、SOD、GST活性都会迅速应激反应, 而且除草剂的胁迫表现出的应激反应是长期的, 这种应激反应在高浓度除草剂胁迫时尤为明显。
2) 对照肉质软珊瑚CAT活性是短指珊瑚的约3倍, 而SOD活性是短指珊瑚的三分之一, 可能表明肉质软珊瑚对除草剂的胁迫适应性较强, 但对于这两种酶活在珊瑚内部的关联作用则仍需要进一步研究。
3) 两种软珊瑚在除草剂胁迫前后都检测到了高丰度的虫黄藻C系群, 但两种软珊瑚受到胁迫之后, 其共生虫黄藻优势系群并没有发生显著改变, 表明除草剂胁迫对软珊瑚虫黄藻优势种群影响不大。但是通过两种软珊瑚的共生虫黄藻丰度的表达, 表明了两种珊瑚物种共生虫黄藻分群方面的特异性。
4) 在受到除草剂短期胁迫之后肉质软珊瑚实验组中出现了蓝细菌相对丰度上升的现象。本研究认为蓝细菌与珊瑚属于互相竞争的关系, 会诱发珊瑚发生疾病, 严重时会造成珊瑚礁退化。
5) 海水中除草剂的危害会长期造成软珊瑚的各种生理指标的显著应激反应, 长此以往必定会对软珊瑚的内部生理生态平衡造成影响, 从而影响软珊瑚的生长, 并进一步危害珊瑚礁生态系统的稳定性。因此, 对于海南省这样一个农业大省, 规范近海居民对除草剂的使用应当成为珊瑚礁生态系统保护的重要环节。

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