海洋资源开发

海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养中甾体类成分研究Ⅱ

  • 司徒美霞 , 1 ,
  • 雷祖发 1 ,
  • 杨倩茹 2 ,
  • 邓胜毅 1 ,
  • 吴科键 2 ,
  • 陈鸿皓 2 ,
  • 韦霞 1, 3 ,
  • 樊浩 1 ,
  • 张伟 , 2 ,
  • 张翠仙 , 1
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  • 1. 广州中医药大学, 广东 广州 510006
  • 2. 中山大学附属中学, 广东 广州 510275
  • 3. 广西医科大学, 广西 南宁 530021
张伟。email: ;
张翠仙。email:

司徒美霞(1997—), 女, 广东省江门市人, 硕士研究生, 从事天然药效物质基础研究。email:

收稿日期: 2022-11-08

  修回日期: 2022-12-06

  网络出版日期: 2022-12-08

基金资助

广东省自然资源厅省级促进经济高质量发展专项资金(海洋经济发展用途)项目(GDNRC[2021]48)

广东省自然资源厅省级促进经济高质量发展专项资金(海洋经济发展用途)项目(GDNRC[2020]039)

国家自然科学基金项目(82273845)

国家自然科学基金项目(81741160)

广州市青少年科技教育项目(KP市2022027)

Research on the steroids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3

  • SITU Meixia , 1 ,
  • LEI Zufa 1 ,
  • YANG Qianru 2 ,
  • DENG Shengyi 1 ,
  • WU Kejian 2 ,
  • CHEN Honghao 2 ,
  • WEI Xia 1, 3 ,
  • FAN Hao 1 ,
  • ZHANG Wei , 2 ,
  • ZHANG Cuixian , 1
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  • 1. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
  • 2. The Middle School Attached to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
  • 3. Pharmaceutical college, Guangxi Medicinal University, Nanning 530021, China
ZHANG Wei. email: ;
ZHANG Cuixian. email:

Received date: 2022-11-08

  Revised date: 2022-12-06

  Online published: 2022-12-08

Supported by

Special fund of Guangdong Provincial Department of Natural Resources for Promoting High-quality Economic Development (Marine Economic Development)(GDNRC[2021]48)

Special fund of Guangdong Provincial Department of Natural Resources for Promoting High-quality Economic Development (Marine Economic Development)(GDNRC[2020]039)

National Natural Science Foundation of China(82273845)

National Natural Science Foundation of China(81741160)

Guangzhou Youth Science and Technology Education Project(KP市2022027)

摘要

文章模拟微生物自然生长环境, 对两株海洋本草软珊瑚曲霉属真菌Aspergillus sp. EGF7-0-1和Aspergillus sp. EGF15-0-3进行共培养, 以期发现新颖骨架成分。采用硅胶、反相色谱、羟丙基葡聚糖凝胶和高效液相色谱等方法对其次生代谢产物进行分离、纯化; 采用高分辨质谱、核磁共振、旋光及物理常数对照等方法对所分离得到的化合物进行结构鉴定; 采用全球天然产物分子网络(Global Natural Products Social Molecular Networking, GNPS)方法对次生代谢产物进行分析。从两株软珊瑚来源的曲霉属真菌大米共培养中分离得到10个甾体类化合物: Chaxine (1)、Herbarulide (2)、dankasterones A (3)、25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one (4)、Ganodermasides D (5)、Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (6)、Ergosta-4,7,22-trien-3-one (7)、Isocyathisterol (8)、Stigmasta-4,22-dien-3-one (9)和β-sitostenone (10)。化合物1~3均为高度氧化重排的甾体类化合物。化合物4579首次从曲霉属真菌中分离得到。GNPS分析表明与菌株EGF7-0-1和EGF15-0-3单培养相比, 两株真菌共培养能诱导出更为丰富的甾体类化合物。

本文引用格式

司徒美霞 , 雷祖发 , 杨倩茹 , 邓胜毅 , 吴科键 , 陈鸿皓 , 韦霞 , 樊浩 , 张伟 , 张翠仙 . 海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养中甾体类成分研究Ⅱ[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(5) : 161 -170 . DOI: 10.11978/2022240

Abstract

In order to simulate the growth environment of microorganisms to change or increase the production of secondary metabolites in the presence of other microorganisms and protect the ecological environment of marine herbs, soft coral-associated two fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3 were cocultured on rice medium. Firstly, GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) method was used to analyze secondary metabolites. Then, the secondary metabolites were separated and purified by silica gel, ODS (Octadecylsilyl), Sephadex LH-20 and HPLC (Preparative High Performance Liquid Chromatography). Their structures were identified by HR-ESI-MS (High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectroscopy), NMR (Nuclear Magnetic Resonance), ORD (Optical Rotatory Dispersion) and the relative physical constants were compared with the literature. Ten steroids were obtained and identified as Chaxine C (1), Herbarulide (2), dankasterones A (3), 25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one (4), Ganodermasides D (5), Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (6), Ergosta-4,7,22-trien-3-one (7), Isocyathisterol (8), Stigmasta-4,22-dien-3-one (9) and β-sitostenone (10). Compounds 1~3 were steroids with oxidative rearrangement and 4, 5, 7 and 9 were firstly acquired from Aspergillus sp. compared with the single culture of EGF7-0-1 and EGF15-0-3. Based on the coculture strategy, the content types of steroids were more abundant.

海洋是新颖甾体的重要来源, 这些甾体类化合物往往具有非常规的母核和侧链结构(Darmas et al, 2000), 表现出强抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗衰老和免疫抑制等多种生物活性(Chang et al, 2007; Ding et al, 2019; 肖细姬 等, 2019; Liu et al, 2021)。文献调研表明甾体骨架上官能团变化可能使其生物活性发生显著变化, 高度氧化的甾体多具有抗氧化和抗肿瘤等活性(Sultana, 2018)。到目前为止, 已有100多个甾体类化合物被FDA批准应用于临床(Ren et al, 2019), 同时它们又被发现新的适应症, 如最初用于治疗超难治性癫痫状态的allopregnanolone (Vaitkevicius et al, 2017), 最近又通过了治疗产后抑郁症的Ⅲ期临床试验(Meltzer et al, 2018)。因此, 进一步发现骨架新颖、生物活性强的天然甾体化合物具有重要的化学、医药价值。
通过模拟目标菌株的自然生长环境进行微生物共培养, 既可以通过刺激目标菌株沉默基因的表达影响其次级代谢产物的生成(Okada et al, 2017), 又因为空间资源有限, 通过共培养菌株往往会形成竞争和拮抗关系, 而产生单培养中所没有的次生代谢产物, 且具良好活性(Oh et al, 2005)。课题组前期分别对两株海洋本草软珊瑚共附生真菌Aspergillus sp. EGF15-0-3和Aspergillus sp. EGF7-0-1进行单培养研究(刘炳新 等, 2021; 黎咏怡 等, 2022; Wei et al, 2022), 研究发现菌株EGF15-0-3主要产生二酮哌嗪类生物碱、二氢异香豆素、蒽醌、色酮及其杂合二聚体类化合物, 菌株EGF7-0-1主要产生γ-芳环丁烯内酯类、杂萜类、甾体类、聚酮类(他汀类)化合物; 而将两株真菌共培养后发现, 不仅代谢出丰富的杂萜类成分(蔡金旋 等, 2022), 其甾体类成分也比EGF7-0-1单培养时丰富。对产生的甾体类成分进行研究, 目前共分离鉴定10个甾体类化合物(图1)。
图1 来源于两株曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养的甾体化合物1~10

Fig. 1 Steroids 1~10

1 试验部分

1.1 材料与试剂

试验过程中所涉及的仪器与试剂材料见表1, 真菌规模培养所用的大米培养基和PDB培养基的配制方法与蔡金旋等(2022)相同。
表1 试验所用仪器与试剂信息表

Tab. 1 Instruments and reagents used in the experiment

仪器/试剂 型号/规格 品牌
高分辨液质联用仪 Triple TOFTM 5600+ 美国 AB SCIEX公司
核磁共振波谱仪 400 MHz AVANCE Ⅲ型 德国Bruker公司
高效液相色谱 QuikSep半制备型 北京慧德易科技有限公司
自动旋光仪 MCP 500 安东帕公司
紫外透射反射仪 WFH-201B 上海精科实业有限公司
超净工作台 SW-CJ-1FD 苏州净化设备厂
立式压力蒸汽灭菌器 LS-100H 江阴滨江医疗设备有限公司
电子天平 PWN224ZH 奥豪斯仪器(常州)有限制造公司
旋转蒸发器 XHRE-2000A 上海宵汉实业发展有限公司
低温冷却液循环泵 XHDLSB-5/25 上海宵汉实业发展有限公司
色谱柱a: Luna 分析柱 4.6mm×100mm, 5μm 美国Phenomenex公司
色谱柱b: YMC-Pack ODS-A半制备柱 10mm×250mm, 5μm 日本YMC Co.,Ltd.公司
色谱柱c: H& EC18半制备柱 10mm×250mm, 5μm 北京慧德易科技有限公司
常规柱层析硅胶 200~300目、300~400目 青岛海洋化工厂
Sephadex LH-20 YILIMART 500G 瑞典 cytiva公司
C-18反相色谱填料 YMC*GEL ODS-A-HG 日本 YMC公司
乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙腈、二氯甲烷、
三氯甲烷和正丁醇
分析纯 广东光华科技股份有限公司
氘代氯仿 25G 美国剑桥CIT公司
葡萄糖 分析纯 天津致远化学试剂有限公司
技术琼脂粉 分析纯 广东环凯微生物科技有限公司
土豆、大米、海盐 购于市场

1.2 菌种的活化与规模培养

菌种活化: 用无菌接种环分别从EGF7-0-1和EGF15-0-3菌种液体石蜡斜面保存管中蘸取适量菌种, 在无菌PDB固体培养基中进行活化, 待培养基中长出单菌落后, 用接种环挑取单菌落于提前准备好的无菌PDB液体培养基中, 28℃下于恒温摇床(165r·min-1)中培养2~3d, 分别获得两株真菌的种子液。
规模发酵: 用移液器分别吸取两株真菌的种子液(各5mL)于无菌大米培养基中对两种真菌进行混合培养, 28℃下静置培养35d, 共培养400瓶。

1.3 次生代谢产物的提取、分离与纯化

提取: 发酵完成后, 依次采用乙酸乙酯(EtOAc)和甲醇(MeOH)浸提, EtOAc提取液减压浓缩得EtOAc-1浸膏(1250g), MeOH提取液减压浓缩, 用水分散溶解后依次使用乙酸乙酯和正丁醇(n-BuOH)萃取, 分别减压浓缩后得EtOAc-2浸膏(50g)和n-BuOH浸膏(235g), EtOAc-1和EtOAc-2浸膏经薄层色谱(thin-layer chromatograph, TLC)和液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析后合并得EtOAc浸膏(1300g)。
分离与纯化: EtOAc浸膏(1300g)经硅胶柱层析, 以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱、纯甲醇冲柱, TLC薄层跟踪合并后得11个流分: Fr.1 ~ Fr.11, 经核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和LC-MS共同分析后, 确定甾体目标流分为Fr.5和Fr.6。Fr.5 (72g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE, 体积比10:90→70:30)得到11个流份Fr.5-1 ~ Fr.5-11。Fr.5-8 (8.5g)经反相色谱(octadecylsilyl, ODS)柱层析(H2O-MeOH, 体积比60:40→0:100)得到6个流份Fr.5-8-1 ~ Fr.5-8-6。Fr.5-8-3 (1.7g)经半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)(H2O-MeOH, 体积比5:95, 流速2mL·min-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱b)共得到15个流份Fr5-8-3-1 ~ Fr5-8-3-15, 其中得到化合物6 (τR=47min, 10mg)、7 (τR=48min, 19mg)、8 (τR=33min, 9.1mg)、9 (τR=60min, 9.2mg)和10 (τR=65min, 18mg)。Fr.6 (34.1g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE, 体积比10:90→70:30)得到13个流份Fr.6-1 ~ Fr.6-13。Fr.6-7 (2g)经Sephadex LH-20 (150g)柱层析(CH2Cl2-MeOH, 体积比30:70)得到12个流份Fr.6-7-1 ~ Fr.6-7-12, 随后Fr.6-7-3 (189mg)经半制备HPLC (H2O-MeOH, 体积比10:90, 流速2mL·min-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱b)得到8个流份, 其中得到化合物1 (τR=22min, 5.5mg)、2 (τR=28min, 5mg)和3 (τR=40min, 3.3mg)。Fr.6-9 (2.5g)经Sephadex LH-20 (150g)柱层析(CH2Cl2-MeOH, 体积比30:70)得到12个流份Fr.6-9-1 ~ Fr.6-9-12, Fr.6-9-3 (300mg)经半制备HPLC (H2O-MeOH, 体积比15:85, 流速2mL·min-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱c)得到10个流份Fr.6-9-3-1 ~ Fr.6-9-3-10, 其中得到化合物4 (τR=23min, 24mg)和5 (τR=58min, 14mg)。

1.4 物理常数与波谱数据

化合物1: 白色无定型粉末(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+50.1° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 441.2980 [M+H]+ (计算值: C28H41O4+ 441.2960), 分子式C28H40O41H和13C NMR数据见表2表3
表2 化合物 1~101H NMR数据(400MHz, CDCl3, δH, 多重峰mult, 偶合常数J in Hz)

Tab. 2 1H NMR Data of 1~10 in CDCl3

No. 1 2 3 4 5
4 6.03, d, 10.1 5.74, s 6.36, s 5.74, s 5.88, s
6 6.04, d, 9.5 6.12, d, 9.6
7 5.64, d, 2.4 5.72, s 2.65, dd, 16.9, 1.5 6.60, d, 9.5 6.49, d, 9.6
9 2.81, t, 9.1
18 0.87, s 0.63, s 0.98, s 0.96, s 0.96, s
19 1.47, s 1.23, s 1.26, s 0.99, s 1.11, s
21 1.02, d, 6.6 1.02, d, 6.6 1.09, d, 7.1 1.08, d, 6.7 1.08, d, 6.7
22 5.14, dd, 15.3, 8.4 5.14, dd, 15.3, 8.4 5.24, dd, 15.2, 6.0 5.34, dd, 15.2, 7.6 5.20, dd, 15.3, 7.9
23 5.26, dd, 15.3, 7.7 5.25, dd, 15.2, 7.6 5.28, d, 15.2, 6.1 5.39, dd, 15.2, 7.8 5.27, dd, 15.3, 7.2
26 0.84, d, 6.8 0.82, d, 6.8 0.81, d, 6.8 1.14, s 0.83, d, 6.8
27 0.82, d, 6.8 0.82, d, 6.8 0.83, d, 6.8 1.17, s 0.85, d, 6.8
28 0.91, d, 6.8 0.91, d, 6.8 0.91, d, 6.8 1.01, d, 6.7 0.93, d, 6.9
No. 6 7 8 9 10
4 5.73, s 5.79, d, 2.0 5.72, s 5.72, s 5.71, s
6 6.03, d, 9.5 6.09, d, 9.6
7 6.61, d, 9.5 6.16, d, 9.6
18 0.96, s 0.60, s 1.02, s 0.73, s 0.70, s
19 0.99, s 1.17, s 1.32, s 1.18, s 1.17, s
21 1.06, d, 6.7 1.03, d, 6.6 0.99, d, 6.6 1.02, d, 6.6 .91, d, 6.5
22 5.26, dd, 15.2,7.1 5.16, dd, 15.2, 7.7 5.12, dd, 15.3, 8.2 5.15, dd, 15.2, 8.5
23 5.20, dd, 15.2,7.8 5.23, dd, 15.2, 6.9 5.22, dd, 15.3, 7.6 5.02, dd, 15.2, 8.5
26 0.83, d, 6.8 0.82, d, 6.5 0.82, d, 6.8 0.84, d, 6.3 0.83, d, 6.8
27 0.85, d, 6.8 0.84, d, 6.5 0.83, d, 6.8 0.79, d, 6.3 0.82, d, 6.8
28 0.93, d, 6.9 0.91, d, 6.5 0.91, d, 6.8
29 0.80, t, 7.3 0.84, t, 7.3
表3 化合物 1~1013C NMR数据(100MHz, CDCl3, δC, type)

Tab. 3 13C NMR Data of 1~10 in CDCl3

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 32.1, t 33.9, t 39.0, t 34.1, t 27.6, t 34.3, t 33.2, t 35.2, t 35.7, t 35.7, t
2 24.8, t 33.2, t 34.5, t 34.1, t 34.0, t 34.3, t 34.3, t 33.8, t 34.0, t 32.1, t
3 148.8, d 198.4, s 199.3, s 199.7, s 199.5, s 199.7, t 199.6, s 199.9, s 199.7, s 199.8, s
4 128.1, d 114.7, d 126.7, d 123.2, d 126.4, d 123.1, d 122.8, d 125.3, d 123.8, d 123.7, d
5 195.8, s 173.9, s 156.2, s 124.7, s 161.4, s 124.6, s 169.2, s 163.5, s 171.7, s 171.9, s
6 164.3, d 162.4, s 200.2, s 124.7, d 124.8, d 124.6, d 33.2, t 128.2, d 33.0, t 33.0, t
7 117.5, d 113.3, d 41.0, t 134.1, d 130.9, d 134.2, d 115.7, d 139.4, d 32.0, t 33.9, t
8 156.2, s 159.5, s 62.3, s 164.5, s 126.7, s 164.5, s 139.7, s 71.9, s 35.6, d 35.6, d
9 204.6, s 47.2, d 49.5, d 44.5, d 72.6, s 44.5, d 45.9, d 53.3, d 53.8, d 53.8, d
10 81.2, s 40.4, s 36.1, s 36.9, s 42.4, s 36.9, s 38.2, s 36.3, s 38.6, s 38.7, s
11 39.0, t 25.4, t 25.3, t 19.0, t 25.5, t 19.1, t 22.1, t 18.0, t 21.0, t 21.0, t
12 38.0, t 39.1, t 38.5, t 35.6, t 32.1, t 35.7, t 39.1, t 40.9, t 39.5, t 39.4, t
13 46.5, s 47.0, s 54.1, s 44.2, s 44.6, s 44.1, s 43.5, s 44.2, s 42.3, s 42.5, s
14 57.9, d 58.1, d 215.0, s 155.7, s 158.3, s 156.3, s 55.1, d 57.2, d 56.0, d 56.0, d
15 21.9, t 22.6, t 38.1, t 25.3, t 25.7, t 25.5, t 23.0, t 19.1, t 24.3, t 24.2, t
16 29.1, t 27.7, t 23.3, t 27.7, t 27.8, t 27.9, t 28.2, t 28.2, t 28.9, t 28.2, t
17 55.3, d 56.3, d 49.5, d 55.6, d 55.7, d 55.8, d 55.9, d 56.6, d 55.9, d 55.9, d
18 12.1, q 12.5, q 17.2, q 19.1, q 17.9, q 19.1, q 12.3, s 14.6, q 12.2, q 12.0, s
19 21.9, q 20.0, q 24.2, q 16.8, q 20.9, q 16.8, q 21.4, q 19.0, q 17.4, q 19.0, s
20 40.1, d 40.2, d 37.4, d 39.5, d 39.3, d 39.4, d 40.6, d 39.9, d 40.5, d 36.1, d
21 21.0, q 21.0, q 23.8, q 21.2, q 21.3, q 21.4, q 21.2, q 20.7, q 19.0, q 18.7, q
22 134.6, d 134.7, d 132.5, d 138.4, d 134.9, d 135.2, d 135.6, d 135.4, d 138.1, d 34.0, t
23 132.9, d 132.8, d 135.3, d 129.9, d 132.9, d 132.7, d 132.4, d 132.3, d 129.5, d 29.1, t
24 42.8, d 42.8, d 43.4, d 48.3, d 43.0, d 43.0, d 42.9, d 43.0, d 51.2, d 45.8, d
25 33.0, d 33.1, d 33.2, d 72.5, s 33.2, d 33.2, d 33.0, d 33.2, d 31.9, d 26.1, d
26 19.7, q 20.0, q 19.8, q 27.1, q 19.8, q 20.1, q 20.1, q 19.8, q 21.2, q 17.4, q
27 20.0, q 19.6, q 20.2, q 26.6, q 20.1, q 19.8, q 19.8, q 20.1, q 21.1, q 19.8, q
28 17.6, q 17.6, q 17.1, q 15.8, q 17.8, q 17.8, q 17.7, q 17.8, q 25.4, t 23.1, t
29 12.3, q 12.0, q
化合物2: 无色片状结晶(MeOH), 熔点: 139~141℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+169.2° (c 0.1, CH2Cl2), HR-ESI-MS: m/z 425.3039 [M+H]+ (计算值: C28H41O3+ 425.3011), 分子式C28H40O31H和13C NMR数据见表2表3
化合物3: 黄色油状物, $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+60.2° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 425.3030 [M+H] + (计算值: C28H41O3+ 425.3011), 分子式C28H40O31H和13C NMR数据见表2表3
化合物4: 黄色无定型粉末(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+560.1° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 409.3076 [M+H]+ (计算值: C28H41O2+ 409.3062), 分子式C28H40O21H和13C NMR数据见表2表3
化合物5: 黄色油状物, $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+287.3° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 409.3089 [M+H] + (计算值: C28H41O2+ 409.3062), 分子式C28H40O21H和13C NMR数据见表2表3
化合物6: 黄色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+582.6° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 393.3127 [M+H]+ (计算值: C28H41O+ 393.3113), 分子式C28H40O。1H和13C NMR数据见表2表3
化合物7: 无色针状结晶(MeOH), 熔点: 112~114℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+9.1° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 395.3295 [M+H]+ (计算值: C28H43O+ 395.3269), 分子式C28H42O。1H和13C NMR数据见表2表3
化合物8: 白色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+64.2° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 411.3237 [M+H]+ (计算值: C28H43O2+ 411.3218), 分子式C28H42O21H和13C NMR数据见表2表3
化合物9: 白色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+39.6° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 411.3606 [M+H]+ (计算值: C29H47O+ 411.3582), 分子式C29H46O。1H和13C NMR数据见表2表3
化合物10: 无色针状结晶(MeOH), 熔点: 67~69℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+62.2° (c 0.1, CHCl3), HR-ESI-MS: m/z 413.3747 [M+H]+ (计算值: C29H49O+ 413.3739), 分子式C29H48O。1H和13C NMR数据见表2表3

1.5 LC-MS分析及GNPS建立

样品配制: 取两株真菌共培养、EGF7-0-1单培养、EGF15-0-3单培养浸膏配制成1.0mg·mL-1甲醇溶液, 备用。
超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)条件: 流动相、流速和柱温等与文献(蔡金旋 等, 2022)相同, 进样量为5μL, 色谱柱a, 将样品于Triple TOFTM5600+质谱中测试。
质谱(mass spectrometry, MS)条件: 离子喷雾电压、雾化器压力、辅助气压力、气帘气压力、离子源温度、碰撞能量、扩散碰撞能量、去簇电压、飞行时间质谱(TOF-MS)分子量扫描范围等条件与文献(蔡金旋 等, 2022)相同。
全球天然产物分子网络(global natural products social molecular networking, GNPS)构建方法: 二级质谱原始数据文件(.wiff格式)通过MSConver软件转换成网络可识别的格式(.mzXML格式), 将转换后的数据通过FileZilla软件提交至GNPS数据中转站, 登录GNPS网站服务器(https://gnps.ucsd.edu), 按要求设置参数(cosine值为0.8, 最低匹配峰值为6, 母体离子质量差为±0.02Da, 碎片离子质量差为±0.02Da)建立GNPS分子网络图, 生成数据后导出采用Cytoscape软件进行分析。
LC-MS分析方法: 使用peakview软件进行目标性筛查, 通过peakview软件打开质谱原始数据文件, 显示总离子流图(total ion chromatography, TIC)图, 根据目标化合物的分子式和离子化形式提取粗流份中的目标峰(显示相应的RT值、Error Da和Formula等信息)。以此方法确定甾体化合物在3种培养基中的存在情况。
数据分析处理软件: GNPS分析采用ProteoWizard (MS Conver)、FileZilla和Cytoscape。LC-MS分析采用Triple TOFTM5600+质谱系统自配的peakview和analysis数据处理软件。

2 结果及分析

2.1 结构解析

化合物1: HR-ESI-MS m/z 441.2980 [M+H]+ (计算值: C28H41O4+ 441.2960), 13C NMR和无畸变极化转移增强谱图(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, DEPT)信息显示28个碳(7个 C、9个 CH、6个 CH2和 6个 CH3), 确定1的分子式为 C28H40O2, 不饱和度为9。NMR信息提示1含有1个长程共轭酮酯羰基(δC 164.3, s, C-6、117.5, d, C-7、156.2, s, C-8、204.6, s, C-9; δH 5.64, d, 2.4, 1H, H-7)、1个α,β-共轭酮羰基(δC 148.8, d, C-3、128.1, d, C-4、195.8, s, C-5; δH 6.86~6.91, m, 1H, H-3、6.03, d, 10.1Hz, 1H, H-4)、1个三取代双键(δC 134.6, d, C-22、132.9, d, C-23; δH 5.14, dd, 15.3, 8.4Hz, 1H, H-22、5.26, dd, 15.3, 7.7Hz, 1H, H-23)、1个连氧且不含氢原子的碳(δC 81.2, s, C-10)、6个麦角甾体特征甲基(δC 12.1, q, C-18、21.9, q, C-19、21.0, q, C-21、19.7, q, C-26、20.0, q, C-27、17.6, q, C-28; δH 0.87, s, 3H, H3-18、1.47, s, 3H, H3-19、1.02, d, 6.6Hz, 3H, H3-21、0.84, d, 6.8Hz, 3H, H3-26、0.82, d, 6.8Hz, 3H, H3-27、0.91, d, 6.8Hz, 3H, H3-28), 除此外无任何不饱和度信息, 说明该化合物含有3个环, 推测其为发生了氧化重排的麦角甾类化合物(Mccloskey et al, 2017)。将1的NMR信息与Chaxine C对照(Choi et al, 2009; Hirata et al, 2017), 二者基本一致, 确定1为Chaxine C。
化合物2: HR-ESI-MS m/z 425.3039 [M+H]+ (计算值: C28H41O3+ 425.3011), 13C NMR和DEPT信息显示28个碳(6个C、10个CH、6个CH2和6个CH3), 确定其分子式为C28H40O3, 不饱和度为9。根据NMR信息提示结构中含有1个氧取代α,β-共轭酮羰基(δC 198.4, s, C-3、114.7, d, C-4和δC 173.9, s, C-5; δH 5.74, s, 1H, H-4)和1个α,β-共轭内酯基(δC 162.4, s, C-6、113.3, d, C-7和δC 159.5, s, C-8; δH 5.72, s, H-7), 推测其亦为高度氧化重排的麦角甾类化合物(Krohn et al, 1999)。将2的NMR信息与herbarulide对照(Duecker et al, 2020), 二者基本一致, 确定2为herbarulide。
化合物3: HR-ESI-MS m/z 425.3030 [M+H]+ (计算值: C28H41O3+ 425.3011), 13C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个 C、8个 CH、7个 CH2和 6个 CH3), 确定其分子式为C28H40O3, 不饱和度为9。NMR信息提示结构中有1个长程α,β-共轭双酮羰基(δC 199.3, s, C-3、26.7, d, C-4、156.2, s, C-5、200.2, s, C-6; δH 6.36, s, 1H, H-4)、1个孤立酮羰基(δC 215.0, s, C-14)、1个三取代双键(δC 1132.5, d, C-22、135.3, d, C-23; δH 5.24, dd 15.2, 6.1Hz, 1H, H-22、5.28, d, 15.2, 6.0Hz, 1H, H-23), 提示该化合物含有4个环。严格分析3的NMR数据发现增加了1个明显向低场移动的饱和季碳信息(δC 62.3, s, C-8), 提示其可能环结构发生改变且高度氧化重排的麦角甾类化合物(Hu et al, 2017)。将3的NMR信息与Dankasterone A对照(Amagata et al, 2007), 二者基本一致。故确定3为Dankasterone A。
化合物4: HR-ESI-MS: m/z 409.3076 [M+H]+ (计算值: C28H41O2+ 409.3062), 13C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个C、9个CH、6个CH2和 6个CH3), 确定其分子式为C28H40O3, 不饱和度为9。NMR信息提示4含有1个长程共轭酮羰基(δC 199.7, s, C-3、123.2, d, C-4、124.7, s, C-5、124.7, d, C-6、134.1, d, C-7、164.5, s, C-8、155.7, s, C-14; δH 5.74, s, 1H, H-4、6.04, d, 9.5Hz, 1H, H-6、6.60, d, 9.5Hz, 1H, H-7)、1个三取代双键(δC 138.4, d, C-22、129.9, d, C-23; δH 5.34, dd, 15.2, 7.6Hz, 1H, H-22、5.39, dd, 15.2, 7.8Hz, 1H, H-23)、1个连氧且不含氢原子的碳(δC 72.5, s, C-25)以及6个麦角甾体特征甲基。说明其为麦角甾类化合物(Duecker et al, 2019)。将4的NMR数据与25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one对照(Fujimoto et al, 2004), 二者基本一致, 确定4为25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。
化合物5: HR-ESI-MS: m/z 409.3089 [M+H]+ (计算值: C28H41O2+ 409.3062), 13C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个C、9个CH、6个CH2和6个CH3), 确定其分子式为C28H40O2, 不饱和度为9。将5的NMR数据与4对比, 二者结构中碳的类型均相同, 但1H NMR中2个甲基由单峰(4: δH 1.14, H3-26和δH 1.17, H3-27)变成了双峰(5: δH 0.83, d, 6.8Hz, 3H, H3-26和δH 0.85, d, 6.8Hz, 3H, H3-27), 且其化学位移向高场移动, 推测其可能是结构中羟基位置发生了改变(Fujmoto et al, 2004)。将5的NMR数据与Ganodermasides D对照(Weng et al, 2011), 二者基本一致, 确定5为Ganodermasides D。
化合物6、78的HR-ESI-MS、13C NMR及DEPT谱信息确定其分子式依次为C28H40O、C28H42O和C28H42O2, 不饱和度依次为9、8和8。将6 ~ 8的NMR数据与5对比, 它们十分相似。65少了1个连氧且不含氢原子的碳(5: δC 72.9, s, C-9)而多了1个次甲基信息(6: δC 44.5, d, C-9; δH 2.14, m, H-9)。将6的NMR数据与Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (Quang et al, 2008)对照, 二者基本一致, 确定6为Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。75缺少1个连氧且不含氢原子的碳(5: δC 72.6, s, C-9)信息。将7的数据与Ergosta-4,7,22-trien-3-one进行对比(Zhang et al, 2009), 二者基本一致, 确定7为Ergosta-4,7,22-trien-3-one。而85少了1个四取代双键(5: δC 126.7, s, C-8、158.3, s, C-14), 将8的NMR数据与Isocyathisterol对照(Chan et al, 2014), 二者基本一致, 确定8为Isocyathisterol
化合物9: HR-ESI-MS: m/z 411.3606 [M+H]+ (计算值: C29H47O+ 411.3582), 13C NMR和DEPT信息提示29个碳(4个C、10个CH、9个CH2和6个CH3), 确定其分子式为C29H46O, 不饱和度为7。NMR信息提示9同样具有甾体类化合物典型的角甲基信息(δC 12.2, q, C-18、17.4, q, C-19; δH 0.73, s, 3H, H3-18、1.18, s, 3H, H3-19)。将9的NMR数据与7相比, 发现9消失了1个双键信号, 同时1个甲基也从双峰(7: δH 0.91, d, 6.5Hz, 3H, H3-28)裂分成三重峰(9: δH 0.80, t, 7.3Hz, 3H, H3-29), 暗示9为豆甾类化合物(Migliuol et al, 1990)。将9的NMR数据与Stigmasta-4,22-dien-3-one (Wang et al, 2015)对照, 二者基本一致, 确定9为Stigmasta-4,22-dien-3-one。
化合物10: HR-ESI-MS: m/z 413.3747 [M+H]+ (计算值: C29H47O+ 413.3739)、13C NMR和DEPT信息提示29个碳(4个C、8个CH、11个CH2、6个CH3), 确定其分子式为C29H48O, 不饱和度为6。与9的NMR对比, 二者十分相似, 仅比9少了1个双键信息(9: δC 138.1, d, C-22、129.5, d, C-23; δH 5.15, dd, 15.2, 8.5Hz, H-22、5.02, dd, 15.2, 8.5Hz, H-23), 多了2个亚甲基(10: δC 34.0, t, C-22、29.1, t, C-23)信息。将10的数据与β-sitostenone对比(Lee et al, 2008), 二者基本一致, 确定10β-sitostenone。

2.2 菌株共培养和单培养中甾体类化合物的分析

观察共培养菌株生长状态(图2), 发现在第1周内两株真菌生长速度相当, 第1周后EGF7-0-1逐渐占据空间中的有限资源, 成为优势菌株, 而生长后期肉眼基本观察不到EGF15-0-3。将两株真菌共培养及其单培养所得粗流份进行LC-MS分析(图3), 化合物710在EGF7-0-1的TIC图中不存在, 化合物1345在EGF15-0-3单培养的TIC图中均不存在, 因此两株真菌共培养能诱导出更丰富的甾体类化合物。
图2 共培养曲霉属真菌不同时间生长图片(土黄色菌落为EGF7-0-1, 灰绿色菌落为EGF15-0-3)

Fig. 2 Growth pictures of co-cultured Aspergillus sp. at different times (earthy yellow is EGF7-0-1, grayish green is EGF15-0-3)

图3 两株真菌共培养(蓝色曲线)、EGF7-0-1单培养(粉色曲线)、EGF15-0-3单培养(红色曲线)的TIC对比图

Fig. 3 TIC comparison of the cocultivation, the single culture of EGF7-0-1or EGF15-0-3 (The blue curve is the cocultivation, the pink curve is the single culture of EGF7-0-1, and the red curve is the single culture of EGF15-0-3)

将菌株单培养、共培养的MS数据建立GNPS, 分子笼(cluster)中每个节点(node)的不同颜色代表化合物的不同来源。对分离得到的甾体化合物进行分子笼分析(图4b), 可直观看出共培养可产生较为丰富甾体类, 且多在菌株共培养和EGF7-0-1单培养中出现, 而在菌株EGF15-0-3中很少出现。同时分析GNPS的成笼特点发现两株真菌的共培养与EGF7-0-1单培养能形成的分子笼较多, 而菌株EGF15-0-3单培养多单独成笼, 说明菌株共培养与菌株EGF7-0-1单培养两者次生代谢产物类型的相似度较大; 而菌株EGF15-0-3单培养时次生代谢产物类型与前2种培养情况差别较大, 图3中也观察到此特点, 其原因可能为共培养时生长后期, 菌株EGF7-0-1为优势生长, 几乎占据所有培养空间, 而菌株EGF15-0-3基本消失。
图4 两株真菌共培养、EGF15-0-3单培养、EGF7-0-1单培养的GNPS分析

a. 总图; b. 甾体类成分分子笼放大图, 节点里的数字表示母离子质量

Fig. 4 GNPS analysis of the cocultivation, the single culture of EGF7-0-1 and the single culture of EGF15-0-3. (a) general view; (b) enlarged view of molecular cage of isolated components, the number in the node represents parent mass

3 结论

本文从两株海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌Aspergillus sp. EGF7-0-1和Aspergillus sp. EGF15-0-3的大米共培养中分离得到10个甾体类化合物。化合物1~3均为高度氧化重排的甾体类化合物, 此类化合物最早主要来源于大型真菌: 如茶树菇(Agrocybe chaxingu)(Choi et al, 2009)、樟芝(Antrodia camphorate)(Lee et al, 2014)、炭棒菌(Xylaria allantoidea)(Mccloskey et al, 2017)等; 此后陆续从海洋和陆生不同种属的共附生及内生微生物中报道, 如Phyllosticta capitalensis (Zhu et al, 2021)、Aspergillus terreus (Li et al, 2020)和Diaporthe sp. (Li et al, 2015), 说明其来源广泛。该类甾体化合物具有较好抗肿瘤与抗氧化活性(Choi et al, 2009; Sultana, 2018)。化合物1对海拉细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HT29)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和非洲绿猴肾细胞(Vero)肿瘤细胞株的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值依次为5.09、5.70、7.95、8.57、8.30μmol·L-1 (Chan et al, 2014); 化合物3对直肠癌细胞株(CT-26)的IC50值为6.7μmol·L-1 (Lee et al, 2014)。化合物4579首次从曲霉属真菌中分离得到。对两株曲霉属真菌单培养及共培养成分进行分析发现: 二者共培养较单培养时产生更丰富的甾体类化合物, 且共培养与菌株EGF7-0-1单培养的化合物类型相似度较高, 与菌株EGF15-0-3单培养时次生代谢产物类型差别较大(EGF15-0-3在大米培养基上单培养时主要产生吲哚二酮哌嗪类生物碱、吲哚二酮哌嗪-苯甲醛杂合二聚体及苯骈色满类化合物)(Wei et al, 2022), 是否与共培养后期EGF7-0-1占据优势生长相关有待进一步研究。
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