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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 104 - 114

DOI: https://doi.org/10.11978/2022242

海洋生物学

深海真菌101#的分子鉴定、次生代谢产物及其生物活性研究*

  • 曾步燕 , 1 ,
  • 梁志凤 1 ,
  • 罗琴琴 3 ,
  • 曾玲 3 ,
  • 杨长庚 1 ,
  • 王锂韫 1 ,
  • 孙玉林 , 1, 2
展开
  • 1. 岭南师范学院生命科学与技术学院, 广东 湛江 524048
  • 2. 岭南师范学院红树林研究院, 广东 湛江 524048
  • 3. 岭南师范学院化学化工学院, 广东 湛江 524048
孙玉林(1980—)。email:

曾步燕(2000—), 女, 学士, 研究方向为海洋生物活性物质挖掘。email:

收稿日期: 2022-11-11

  修回日期: 2022-12-26

  网络出版日期: 2022-12-28

基金资助

国家自然科学基金项目(31902373)

广东省自然科学基金项目(2021A1515011398)

广东省教育厅项目(2021ZDJS034)

广东省教育厅项目(2021KCXTD039)

广东省教育厅项目(2022-K08)

南海海洋生物医药资源研发公共服务平台项目(2017C8B2)

岭南师范学院燕岭优秀青年教师培养计划项目(YL20200213)

岭南师范学院红树林研究院开放课题项目(PYXM05)

收起

Molecular identification, secondary metabolites and biological activities of a deep-sea-derived fungus 101#*

  • ZENG Buyan , 1 ,
  • LIANG Zhifeng 1 ,
  • LUO Qinqin 3 ,
  • ZENG Ling 3 ,
  • YANG Changgeng 1 ,
  • WANG Liyun 1 ,
  • SUN Yulin , 1, 2
Expand
  • 1. School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China
  • 2. Mangrove Institute, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China
  • 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China
SUN Yulin. email:

Received date: 2022-11-11

  Revised date: 2022-12-26

  Online published: 2022-12-28

Supported by

National Natural Science Foundation of China(31902373)

Natural Science Foundation of Guangdong Province, China(2021A1515011398)

Project of Education Department of Guangdong Province, China(2021ZDJS034)

Project of Education Department of Guangdong Province, China(2021KCXTD039)

Project of Education Department of Guangdong Province, China(2022-K08)

Public Service Platform of Biomedical Resources Research and Development of South China Sea(2017C8B2)

Yanling Outstanding Young Teacher Training Program of Lingnan Normal University(YL20200213)

Open Project of Mangrove Research Institute, Lingnan Normal University(PYXM05)

Fold

摘要

文章对分离自南海深海沉积物的1株真菌101#进行分子鉴定、次生代谢产物及其生物活性研究。基于rDNA-ITS基因序列分析法对菌株进行鉴定, 运用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)跟踪其发酵产物含量的变化, 采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20层析、HPLC等多种方法进行代谢产物分离纯化; 利用核磁共振、质谱等波谱学方法并结合参考文献报道对分离的单体化合物进行结构鉴定。采用滤纸片扩散法和卤虫致死法分别测定抗菌和卤虫致死性活性。结果表明, 该菌株鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus), 第28天的发酵产物含量最丰富。此外, 该粗提物对15种指示菌均具有一定的抑制活性, 其中对10种革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)范围为0.781~6.25μg·mL-1, 对3种植物病原菌MIC范围为50~200μg·mL-1, 对海洋生物污损菌(麦氏交替单胞菌)和致病真菌(多耐白色念珠菌) MIC值分别为3.125μg·mL-1和1.563μg·mL-1, 对卤虫1、12、24和48 h的半数致死浓度(Median Lethal Dose 50, LD50)分别为74.597、24.322、13.797和8.559mg·mL-1。最后, 从乙酸乙酯萃取部位中共得到4个单体化合物, 分别鉴定为5-chloro-2-hydroxyphenylacetic acid (1)、aspergamide A (2)、WF-3681 methyl Ester (3)和(E)-But-2-enedioic acid monomethyl Ester (4), 这4个化合物对枯草芽孢杆菌、多耐白色念珠菌、苏云金芽孢杆菌、希瓦氏菌和藤黄微球菌显示出一定的抑制活性, 其MIC值范围为6.25~200μg·mL-1, 此外, 化合物 1~4均显示出较强的卤虫致死活性, 其LD50值分别为7.40、11.95、17.69和23.35μg·mL-1。

关键词： 深海真菌; 分子鉴定; 次生代谢产物; 抑菌活性; 生物毒性

本文引用格式

曾步燕 , 梁志凤 , 罗琴琴 , 曾玲 , 杨长庚 , 王锂韫 , 孙玉林 . 深海真菌101#的分子鉴定、次生代谢产物及其生物活性研究*[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(5) : 104 -114 . DOI: 10.11978/2022242

Abstract

In order to provide reference basis for development and application of deep-sea microbial resources, the molecular identification, secondary metabolites and biological activity of a fungal strain (named as 101#) isolated from deep-sea sediment of the South China Sea was studied. The fungal strain was analyzed based on rDNA-ITS gene sequence. The changes in the content of its fermentation products were tracked by high performance liquid chromatography (HPLC). The secondary metabolites were isolated by silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 and HPLC. The structures of compounds were identified by nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry (MS), and literature analysis. The biological activities were detected by filter paper-agar diffusion and brine shrimp lethal methods, respectively. The results show that the fungal strain 101# was identified as Aspergillus flavus. The optimal fermentation period was 28 d. In addition, the crude extract had certain inhibitory activities against 15 indicator bacteria. The minimum inhibitory concentration (MIC) against 10 Gram-positive and negative bacteria and 3 plant pathogenic bacteria were 0.781 ~ 6.25 μg·mL-1 and 50 ~ 200 μg·mL-1, respectively, and the MIC against marine biofouling bacterium (Alteromonas macleodii) and pathogenic fungus (Candida albicans) were 3.125 μg·mL-1 and 1.563 μg·mL-1, respectively. The crude extract had lethal activity against brine shrimp, and their LD50 at 1, 12, 24 and 48 h were 74.597, 24.322, 13.797 and 8.559 mg·mL-1, respectively. Finally, 4 monomer compounds were isolated from the ethyl acetate extraction site of the strain and their structures were identified as 5-chloro-2-hydroxyphenylacetic acid (1), aspergamide A (2), WF-3681 methyl Ester (3) and (E)-But-2-enedioic acid monomethyl Ester (4). The four compounds showed certain inhibitory activities against B. subtilis, C. albicans, B. thuringiensis, Shewanella and M. luteus, which MIC value were 6.25 ~ 200 μg·mL-1. Furthermore, compounds 1 ~ 4 showed strong brine shrimp lethal activity with LD50 values of 7.40, 11.95, 17.69, 23.35 μg·mL-1, respectively.

Key words： deep-sea-fungus; molecular identification; secondary metabolite; antibacterial activity; biological toxicity

广袤的海洋孕育着丰富的生物资源, 海洋微生物就是其中一个大的类群。海洋微生物是所有以海洋水体为正常栖居环境的微生物的总称, 它们能够在许多极端环境(低温、高压、高盐及寡营养)中得以生存, 在进化过程中可能呈现出特异的遗传背景和代谢途径, 从而产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物, 是开发新药的重要来源(张长生 等, 2018; 安昶亮, 2019; 钱生辉, 2022)。深海真菌是海洋微生物的重要组成部分, 其次级代谢产物因结构多样、活性丰富、“创新指数高”等特点, 已成为药学、化学和生物学等领域关注的焦点。据统计, 2018—2020年间, 从海洋来源新型天然产物4451个(Carroll et al, 2021; Carroll et al, 2022), 其中深海真菌来源的新型天然产物194个, 79个具有生物活性(Wang et al, 2020)。这些化合物的结构类型包括萜类、生物碱、聚酮、肽类、甾体等(Blunt et al, 2018; Newman et al, 2020; Yao et al, 2021), 其中一些表现出良好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性(Cheng et al, 2021; Xie et al, 2022)。本文以深海沉积物来源的真菌为目标, 经大量筛选, 从南海北部2403m深的沉积样品发现了一株具有显著抑菌和卤虫致死活性的真菌菌株101#。基于rDNA-ITS基因序列分析, 对菌株101#进行了分子鉴定, 并初步探究了该菌株代谢产物的发酵规律及其粗提物的抑菌活性和卤虫致死活性, 通过柱层析和半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)等方法从乙酸乙酯萃取部位分离纯化出4个单体化合物, 均显示出较强的抑菌和卤虫致死活性。

1 材料与方法

1.1 仪器材料

LS-35HD型立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司); ZHJH-C1209B超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司); AR224CN型电子天秤(奥豪斯仪器(常州)有限公司); LC-20AD型高效液相色谱仪(岛津企业管理(中国)有限公司); Bruker Avance DRX-400MHz型超导核磁共振仪(内标为TMS)(德国布鲁克仪器有限公司); Bruker amaZonSL低分辨电喷雾质谱仪(ESI-MS)(布鲁克(北京)科技有限公司); SB-800DT型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司); Direct-Q5UV-R型超纯水一体机(密理博中国有限公司); SB-1300型水浴锅、CCA-1112A型冷却水循环和N-1210B型(EYELA)旋转蒸发仪, 均产自日本东京理化株式会社; 薄层板和柱层析硅胶(烟台江友硅胶开发有限公司); 分析级石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯等(广东光华科技股份有限公司); 色谱级甲醇、乙腈(默克化工技术(上海)有限公司)。
深海真菌101#从采自南海北部(18°01′39.24″N, 112°30′12.18″E) 2403m深的沉积物样品中分离得到, 保存于水生生物学实验室超低温冰箱中备用。革兰氏阳性菌: 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae); 革兰氏阴性菌: 稀瓦氏菌(Shewanella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae); 海洋生物污损菌: 麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii SCAU-003); 致病真菌: 多耐白色念珠菌(Candida albicans); 植物病原菌: 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、意大利青霉(Penicillium italicum)、茄镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、盘长孢状刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosprioides)。其中, M. luteus、S. agalactiae、S. flexneri、A. macleodii SCAU-003以及6种植物病原菌均由华南农业大学张晓勇课题组惠赠, 其他指示菌均来自于本课题组。
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基: 葡萄糖 20g, 马铃薯 200g, 海盐 30g, 琼脂 30g, 蒸馏水1L;
真菌3#培养基: 葡萄糖 1.5g, 甘露醇 3g, 麦芽糖3g, 玉米浆 0.15g, 味精 1.5g, KH2PO4 0.075g, MgSO4 0.045g, 酵母浸膏 0.45g, 海盐 4.5g, 蒸馏水150mL;
大米培养基: 大米 80g, 酵母膏 0.4g, 葡萄糖 0.4g, 海盐 3.6g, 蒸馏水150mL;
溶菌肉汤(Luria-Bertani Agar, LBA)培养基: 胰蛋白胨 10g, 酵母提取物 5g, 氯化钠 10g, 琼脂 30g, 蒸馏水1L;
以上培养基均121℃灭菌30min, 备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株鉴定

菌株101#的总DNA按照文献方法(潘力 等, 2010)进行提取, 采用ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)真菌通用引物进行PCR扩增, 回收纯化PCR产物, 并委托DNA测序公司(广州美吉生物科技有限公司)进行测序。对测出的rDNA-ITS序列, 利用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析, 采用MEGA11.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建各菌株基于rDNA-ITS序列的系统发育进化树, Bootstrap设置1000次重复。

1.2.2 菌株发酵

从PDA固体培养基的平板上, 用接种环刮取2环该菌株的孢子于250mL的三角瓶中(内含80mL真菌3#液体培养基), 共接种5瓶, 置于摇床上28℃, 150r·min-1, 3~7d, 培养种子液。待种子液培养好后, 转入1L三角瓶中(内含大米培养基), 每瓶转入5mL, 共接种50瓶。28℃静置培养, HPLC跟踪检测并收瓶。

1.2.3 HPLC跟踪发酵规律

在上述发酵过程中的第24、26、28、29天, 随机选取3瓶菌株, 用灭过菌的药勺挖一勺固体培养基, 分别置于3个100mL三角瓶中, 加入30mL的80%丙酮-水溶液, 并用药勺将培养基捣碎, 之后置于超声波清洗仪中超声30min, 布氏漏斗抽滤, 收集滤液, 重复上述步骤3次。将每次得到的滤液合并, 减压蒸馏直到丙酮被完全除去, 剩下的水相再用乙酸乙酯萃取4次(v乙酸乙酯 : v水 = 1 : 1), 收集乙酸乙酯层直到其颜色变浅至无色, 将乙酸乙酯蒸干最后得到粗提物, 称重备用。将粗提物用甲醇和丙酮(v甲醇 : v丙酮 = 1 : 1)溶解, 配成20mg·mL-1浓度, 进行液相梯度分析, 整个分析条件为甲醇/水梯度洗脱: 0~35min: MeOH浓度5%→ ~100%; 35~45min: MeOH浓度100%; 45~50min: MeOH浓度100%→5%; 50~60min: MeOH浓度5%, YMC-Pack, ODS S-5μm 150×4.6mm i.d., DAD检测器, 流速为1mL·min-1, 进样量为5μL。本试验检测波长为254nm。

1.2.4 抑菌活性及最小抑菌浓度试验

采用滤纸片等倍稀释法(单体壮 等, 2020): 将供试粗样分别配成12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391μg·mL-1的溶液(v甲醇 : v氯仿 = 1 : 1), 用移液枪移取5μL样品溶液加到已灭菌的干燥滤纸片(直径为6mm)上, 置于无菌风下吹干。分别将上述18种指示菌制成106~108个·mL-1的悬菌液。取100μL的悬菌液加入冷却至55℃左右的100mL培养基中(细菌用LBA培养基、真菌用PDA培养基), 混匀后备用。每个菌各设3个平行, 待培养基凝固后, 夹取滤纸片均匀贴于平板上。细菌和真菌的阳性对照分别为硫酸庆大霉素和两性霉素B。细菌置于37℃培养24h, 真菌置于28℃培养48h后, 观察滤纸片周围的抑菌圈, 并用十字测量法测量抑菌圈直径, 以有抑菌圈的滤纸片所含样品的最小浓度为最小抑菌浓度。此外, 单体化合物抑菌浓度采用二倍稀释法, 分别配成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.56μg·mL-1等8个浓度梯度。

1.2.5 生物毒性试验

取2g卤虫卵加入1L无菌海水, 用供氧气泵供氧, 在室温中孵化培养24h之后, 人工除去卵外壳和未孵化的卤虫卵, 再继续培养孵化的卤虫幼虫4h, 备用。按等倍稀释法将供试样品(粗提物)溶液稀释至100、50、25、12.5、6.25mg·mL-1, 单体化合物测试浓度为50、25、12.5、6.25、3.125μg·mL-1, 无菌海水为空白对照。参照于清武等(2015)的方法, 取96孔细胞培养板, 每孔含195μL无菌海水和15~20个卤虫幼虫, 制成测试培养板; 加样体积5μL, 每组3个平行孔。室温下培养, 分别在培养1h (急性中毒)和12、24、48h (慢性中毒)后用体视显微镜统计每孔卤虫死亡数。在完成所有计数后每孔加入100μL甲醇灭活, 15min后统计每孔卤虫总数, 利用下面公式进行计算校正死亡率(单位: %)(王发左, 2008):
校正死亡率=(对照组存活率-处理组存活率)/对照存活率×100
运用EXCEL软件对数据进行统计, 得出虫体的死亡率和校正死亡率。在SPSS 24.0软件中的Probit对5个处理浓度进行统计分析, 求出半数致死量(Median Lethal Dose 50, LD50)和95%置信区间。

1.2.6 深海真菌101#次级代谢产物的提取分离

提取: 发酵结束后, 向每瓶大米培养基中加入300mL 80%丙酮-水溶液, 浸泡24h后超声30min, 再用组织匀浆机粉碎, 布氏漏斗抽滤, 合并滤液并减压蒸馏, 直至不含丙酮, 接着再使用2倍体积乙酸乙酯萃取3次, 减压浓缩至干, 最后得到粗提物65.0g。
分离: 粗提物用正相硅胶柱层析, 然后经CHCl3 : CH3OH (100 : 0 → 0 : 100, v/v)梯度洗脱, 通过薄层层析板(TLC)点板合并, 最终得到11个组分Fr.1 ~ Fr.11。组分Fr.3 (12g)采用正相硅胶柱, 经PE : CH3COCH3 (19 : 1 → 0 : 1, v/v)进行洗脱分离, 通过TLC点板合并, 得到17个组分Fr.3-1 ~ Fr.3-17。组分Fr.3-15 (991.7mg)采用凝胶柱层析(CHCl3 : CH3OH = 1 : 1)进行二次洗脱, 得到组分Fr.3-15-5-3 (30.3mg), 最后通过半制备HPLC (${{v}_{\mathrm{C}{{\mathrm{H}}_{\mathrm{3}}}\mathrm{OH}}}$:${{v}_{{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}}\mathrm{O}}}$= 5 : 95, 流速3mL·min-1)进行制备, 得到化合物1 (4.8mg, tR=92.5min)。组分Fr.3-12 (2.758g)采用凝胶柱层析(CHCl3 : CH3OH = 1 : 1)进行二次洗脱, 得到组分Fr.3-12-4-4 (16.5mg), 最后通过半制备HPLC (${{v}_{\mathrm{C}{{\mathrm{H}}_{\mathrm{3}}}\mathrm{OH}}}$:${{v}_{{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}}\mathrm{O}}}$= 35 : 65, 流速3mL·min-1)进行制备, 得到化合物2 (2.7mg, tR=55min)。组分Fr.3-7 (0.5576g)经凝胶柱层析(CHCl3 : CH3OH = 1 : 1)二次洗脱, 获得组分Fr.3-7-3-2 (94.9mg), 接着采用硅胶柱层析(PE : CH3COCH3 = 8 : 2)进行等度洗脱, 得到组分Fr.3-7-3-2-2 (37.4mg), 最后再通过半制备HPLC (${{v}_{\mathrm{C}{{\mathrm{H}}_{\mathrm{3}}}\mathrm{OH}}}$:${{v}_{{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}}\mathrm{O}}}$ = 45 : 55, 含1‰ CF3COOH, 流速3mL·min-1)进行制备, 得到化合物3 (11.2mg, tR=50min)。组分Fr.3-12 (2.758g)采用凝胶柱层析(CHCl3 : CH3OH = 1 : 1)进行洗脱, 得到8个组分组分Fr.3-12-1 ~ Fr.3-12-8。再对其中的组分Fr.3-12-7 (1.518g)采用硅胶柱层析, 经CHCl3 : CH3OH (50 : 1 → 5 : 1, v/v)梯度洗脱, 得到10个组分组分Fr.3-12-7-1 ~ Fr.3-12-7-10, 将组分Fr.3-12-7-8 (59.1mg)经半制备HPLC (${{v}_{\mathrm{C}{{\mathrm{H}}_{\mathrm{3}}}\mathrm{OH}}}$:${{v}_{{{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}}\mathrm{O}}}$ = 5 : 95, 流速3mL·min-1)进行制备, 得到化合物4 (8mg, tR=23min)。化合物1~4的结构如图1所示。
图1 化合物1~4的化学结构

Fig. 1 The chemical structures of compounds 1~4

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

采用真菌的通用引物ITS 1和ITS 4扩增101#菌株的rDNA-ITS区的片段, 扩增产物大小为546bp (图2)。将扩增的序列提交GenBank数据库, 登录号为KY612329.1。经BLAST在线比对结果显示, 菌株101#与Select seq KR076752.1 Aspergillus flavus strain meijun5序列相似性为99.44%。经MEGA11.0 软件用邻接法构建系统进化树(图3)分析显示, 菌株101#与黄曲霉的rDNA-ITS基因核苷酸序列相似性聚为一簇。因此, 通过分子系统学分析确定菌株101#为黄曲霉。
图2 101#真菌PCR扩增电泳图

M为分子标记(marker)

Fig. 2 The PCR electrophoregram of 101# fungus. M: Marker

图3 基于菌株 101#的rDNA-ITS区域序列信息构建的系统进化树

Fig. 3 Phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS region sequence information of strain 101#

2.2 发酵规律分析

根据HPLC指纹谱图(图4)可知, 随着发酵时间的推移, 菌株101#次级代谢产物的吸收峰的种类和强度先增加后减少, 其中第20~30min的吸收峰强度变化尤为明显, 在发酵的第28d达到最大, 之后呈现下降趋势。此外, 在第35~40min的吸收峰随着时间的推移也逐渐增多, 当发酵时间超过28d后, 这些吸收峰开始减弱, 因此菌株101#的次级代谢产物最佳发酵时间为第28d。
图4 不同发酵时间高效液相指纹图谱

a. 发酵24 d; b. 发酵26 d; c. 发酵28 d; d. 发酵29 d

Fig. 4 Fingerprints chromatogram of high performance liquid chromatography at different times. (a) fermentation 24 d; (b) fermentation 26 d; (c): fermentation 28 d; (d) fermentation 29 d

2.3 粗提物抑菌活性及最小抑菌浓度测定

菌株101#的发酵粗提物对18种指示菌的抑制活性如下, 由结果可知, 该粗提物对10种革兰氏阳性菌或阴性菌、海洋生物污损菌、多耐白色念珠菌以及3种植物病原菌均具有明显的抑制作用, 抑菌圈直径均达7.6mm以上, 其中对A. macleodii SCAU-003的抑制作用最为显著, 抑菌圈直径达14.0mm, 对C. albicans的抑菌圈直径为12.8mm左右, 对其他10种指示菌的抑菌圈直径为7.6~11.67mm, 对F. proliferatum、C. gloeosprioides和F. solani则无抑菌作用。
最小抑菌浓度的测试结果(表1)显示, 该粗提物对上述菌株均具有不同程度的抑制活性。对10种革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度范围为0.781~ 6.25μg·mL-1, 其中对B. subtilis的抑制作用最强, 其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为0.781μg·mL-1, 对K. Pneumoniae和S. agalactiae的抑制作用最弱, 其MIC值均为6.25μg·mL-1。对海洋生物污损菌A. macleodii SCAU-003和多耐白色念珠菌C. albicans的最小抑菌浓度MIC分别为3.125μg·mL-1和1.563μg·mL-1。对3种植物病原菌(表2)的最小抑菌浓度范围为50~200μg·mL-1, 其中对F. graminearum的抑制作用最强, 其MIC值为50μg·mL-1, 对P. italicum和F. oxysporum的抑制作用较弱, MIC值均为200μg·mL-1。
表1 菌株101#粗提物对12种指示菌的抑制活性及最小抑制浓度(MIC值)(n=3)

Tab. 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extract of strain 101# against 12 indicator bacteria (n=3)

指示菌 阳性对照 粗提物浓度/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1)
12.5 6.25 3.125 1.563 0.781 0.391
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ － 0.781
藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1.563
苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ － － 1.563
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Methicillin-resistant staphylococcus aureus) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － － 3.125
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － － 3.125
无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ － － － － 6.250
稀瓦氏菌 (Shewanella) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ － － 1.563
大肠杆菌 (Escherichia coli) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － － 3.125
福氏志贺菌 (Shigella Flexneri) ＋＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － － 3.125
肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae) ＋＋＋＋ ＋ ＋ － － － － 6.250
麦氏交替单胞菌 (Alteromonas macleodii) SCAU-003 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ － － － 3.125
多耐白色念珠菌 (Candida albicans) ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1.563

注: －: 无抑制作用; +: 抑菌圈为6~9mm; + +: 抑菌圈为9~12mm; + + +: 抑菌圈为12~15mm; + + + +: 抑菌圈≥15mm。阳性对照组为硫酸庆大霉素

表2 菌株101#粗提物对6种植物病原菌的抑制活性及最小抑制浓度(MIC值)(n=3)

Tab. 2 Minimum inhibitory concentration (MIC) of crude extract of strain 101# against 6 plant pathogens (n=3)

指示菌 阳性对照 粗提物浓度/(μg·mL-1) MIC/(μg·mL-1)
200 100 50 25 12.5
禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum) ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 50
意大利青霉 (Penicillium italicum) ＋＋＋＋ ＋ － － － － 200
尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) ＋ ＋ － － － － 200
层出镰刀菌 (Fusarium proliferatum) ＋ － － － － － >200
盘长孢状刺盘孢 (Colletotrichum gloeosprioides) ＋ － － － － － >200
茄镰孢菌 (Fusarium solani) ＋＋ － － － － － >200

注: －: 无抑制作用; +: 抑菌圈为6~9mm; + +: 抑菌圈为9~12mm; + + +: 抑菌圈为12~15mm; + + + +: 抑菌圈≥15mm。对照组为两性霉素B

2.4 粗提物生物毒活性测定

卤虫毒性测试结果(表3)显示, 该粗提物对卤虫表现出较强的生物致死毒性, 随着样品浓度增大, 卤虫死亡率逐渐增加, 呈正相关。当作用时长为1h (急性中毒), 12、24和48h (慢性中毒), 粗提物浓度为6.25mg·mL-1时, 对卤虫致死率分别为0、12.5%、18.8%和37.5%, 而当浓度为100mg·mL-1时, 对卤虫致死率为64.7%、100%、100%和100%, 1h (急性中毒)的LD50值为74.597mg·mL-1, 12、24和48h (慢性中毒)的LD50值分别为24.322、13.797和8.559mg·mL-1。整个梯度试验说明该粗提物对卤虫致死活性有一定的浓度效应关系。
表3 菌株101#粗提物对卤虫致死活性的测试结果

Tab 3. Test results of lethal activity of strain 101# crude extract against brine shrimp

时间/h 粗提物浓度/( mg·mL-1) LD50/(mg·mL-1) 95%置信区间
100 50 25 12.5 6.25 下限 上限
1 64.7 38.9 25.0 10.0 0.0 74.597 54.900 118.483
12 100.0 83.3 56.3 30.0 12.5 24.322 17.238 34.071
24 100.0 100.0 87.5 35.5 18.8 13.797 9.739 19.393
48 100.0 100.0 93.8 65.0 37.5 8.559 4.888 12.455

2.5 单体化合物结构鉴定

化合物1为白色无定型粉末, 1H NMR可知, 有3个芳香氢信号δH 6.85(1H, d, J=8.0Hz, H-3), 7.24(1H, dd, J1=2Hz, J2=8.0Hz, H-4), 7.01(1H, d, J=2Hz, H-6); 1个亚甲基信号δH 3.39(2H, s, H-7)。13C NMR和DEPT135谱可知: 有4个季碳δC 176.9(s, C-8), 153.3(s, C-2), 129.0(s, C-1), 121.5(s, C-5); 3个次甲基碳信号δC 131.5(d, C-4), 129.7(d, C-6), 117.6(d, C-3); 1个亚甲基碳信号δC 42.1(t, C-7)。从碳谱的化学位移值推测该化合物可能有1个羰基、1个苯环、1个连在苯环上的羟基和亚甲基。低分辨质谱(+)-ESIMS给出准分子离子峰m/z 209.10 [M+Na]+, (-)-ESIMS给出准分子离子峰m/z 371.30 [2M-H]-, 提示该化合物的分子量为186。上述核磁与质谱数据与文献(Kadin, 1972)报道一致, 故鉴定该化合物为5-chloro-2-hydroxyphenylacetic acid。
化合物2为白色油状物, 1H NMR存在3个苯环氢信号δH 7.05(1H, d, J=1.6Hz, H-2), 6.94(1H, d, J=5.2 Hz, H-5)和6.89 (1H, m, H-6); 2个反式烯氢信号δH 6.92(1H, d, J=15.6Hz, H-11), 6.84(1H, d, J=15.6Hz, H-12); 1个次甲基氢信号δH 4.92(1H, m, H-8); 1个亚甲基氢信号δH 3.12(1H, d, J=5.6Hz, H-7a), 3.09(1H, d, J= 5.6Hz, H-7b)和2个连氧甲基氢信号δH 3.81(3H, s, H-14), 3.77(3H, s, H-15)。13C NMR和DEPT135谱图显示有2个酯羰基信号δC 171.3(s, C-9), 165.8(s, C-13); 6个芳香碳信号δC 129.6(s, C-1), 129.3(d, C-2), 120.0(s, C-3), 150.7 (s, C-4), 116.4 (d, C-5), 130.9(d, C-6); 2个反式烯烃碳信号δC 135.5(d, C-11), 128.6(d, C-12); 1个次甲基碳信号δC 53.5(d, C-8); 1个亚甲基碳信号δC 36.7(t, C-7); 2个甲氧基碳信号δC 52.3(q, C-14), 52.7(q, C-15)。低分辨质谱(+)-ESIMS给出准分子离子峰m/z 342.07 [M+H] +, 因此该化合物的分子量为341。该化合物与已报道的化合物(-)-xylariamide A (Davis, 2005)唯一区别在于C-9的羧基被甲酯化。上述数据与文献(Zhang et al, 2020) 进行比对鉴定为aspergamide A。
化合物3为粉色油状物, 1H NMR谱可知, 有5个单取代苯的芳香氢信号δH 7.75(2H, d, J=8.0 Hz, H-2ʹ, H-6ʹ), 7.44(2H, t, J=8.0Hz, H-3ʹ, H-5ʹ), 7.35(1H, d, J=7.2Hz, H-4ʹ); 1个次甲基氢信号δH 5.52(1H, d, J=7.6Hz, H-5); 2个亚甲基氢信号δH 1.73(1H, m, H-6a), 2.45(1H, m, H-6b), 2.41(1H, m, H-7a), 2.49(1H, m, H-7b)和1个甲氧基氢信号δH 3.64(3H, s, H-9)。13C NMR和DEPT135中有5个季碳信号δC 174.9(s, C-8), 171.1(s, C-2), 139.5(s, C-3), 131.9(s, C-1ʹ), 130.6(s, C-4); 6个次甲基碳信号δC 129.7(d, C-4ʹ), 129.7(d, C-3ʹ), 129.7(d, C-5ʹ), 128.6(d, C-2ʹ), 128.6(d, C-6ʹ), 79.3(d, C-5); 2个亚甲基碳δC 30.5(t, C-6), 29.7(t, C-7)和1个甲基碳信号δC 52.3(q, C-9)。从碳谱数据可知, 该化合物有2个酯羰基、1个单取代的苯环和1个连氧的甲基。低分辨质谱(+)-ESIMS给出准分子离子峰m/z 263.09 [M+H] +, 因此该化合物的分子量为262。结合上述数据并与文献(Ancheeva et al, 2017; Itsuo et al, 1986)比对得知, 该化合物鉴定为WF-3681 methyl ester。
化合物4为白色无定型粉末, 1H NMR谱中含有2个反式烯氢信号δH 6.58(1H, d, J=15.6Hz, H-2), 6.99(1H, d, J=15.6Hz, H-3)和1个甲氧基氢信号δH 3.72(3H, s, H-1)。13C NMR谱图显示含有2个季碳δC 166.1(s, C-5), 164.9(s, C-4); 2个次甲基碳信号δC 138.5(d, C-3), 128.9(d, C-2)和1个甲基碳信号δC 52.5(q, C-1)。从碳谱的化学位移值可以得出该化合物有2个羰基、2个烯碳和1个连氧的甲基。低分辨质谱(+)-ESIMS给出准分子离子峰m/z 261.05 [2M+H]+, m/z 283.65 [2M+Na]+, 因此该化合物的分子量为130。结合上述数据并与文献(Davis, 2005)比对得知, 该化合物鉴定为(E)-but-2-enedioic acid monomethyl ester。
化合物1~4波谱数据如下:
化合物1: 白色无定型粉末, 分子式为C8H7ClO3, (+)-ESIMS m/z 209.10 [M+Na]+, (-)-ESIMS m/z 371.30 [2M-H]; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δH 7.25(1H, dd, J1=2Hz, J2=8.4Hz, H-4), 7.05(1H, d, J=2Hz, H-6), 6.85(1H, d, J=8.0Hz, H-3), 3.39(2H, s, H-7); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δC 176.9(s, C-8), 153.3(s, C-2), 131.5(d, C-4), 129.7(d, C-6), 129.0(s, C-1), 121.5(s, C-5), 117.6(d, C-3), 42.1(t, C-7)。
化合物2: 白色油状物, 分子式为C15H16ClNO6, (+)-ESIMS m/z 342.07 [M+H]+; 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δH 7.05(1H, d, J=1.6Hz, H-2), 6.94(1H, d, J=5.2Hz, H-5), 6.92(1H, d, J=15.6Hz, H-11), 6.89(1H, m, H-6), 6.84(1H, d, J=15.6Hz, H-12), 4.92(1H, m, H-8), 3.81(3H, s, H-14), 3.77(3H, s, H-15), 3.12(1H, d, J=5.6Hz, H-7a), 3.09(1H, d, J=5.6Hz, H-7b); 13C NMR (CDCl3, 125MHz) δC 171.3(s, C-9), 165.8(s, C-13), 150.7(s, C-4), 135.5(d, C-11), 131.0(d, C-6), 129.6(s, C-1), 129.3(d, C-2), 128.6(d, C-12), 120.0(s, C-3), 116.4(d, C-5), 53.5(d, C-8), 52.7(q, C-15), 52.3(q, C-14), 36.7(t, C-7)。
化合物3: 粉色油状物, 分子式为C14H14O5, (+)-ESIMS m/z 263.09 [M+H]+; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δH 7.75(2H, d, J=8.0Hz, H-2ʹ, H-6ʹ), 7.44(2H, d, J=7.6Hz, H-3ʹ, H-5ʹ), 7.35(1H, d, J=7.2Hz, H-4ʹ), 5.52(1H, d, J=7.6Hz, H-5), 3.64(3H, s, H-9), 2.45(1H, m, H-6b), 1.73(1H, m, H-6a), 2.49(1H, m, H-7b), 2.41(1H, m, H-7a); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) δC 174.9(s, C-8), 171.1(s, C-2), 139.5(s, C-3), 131.9(s, C-1ʹ), 130.6(s, C-4), 129.7(d, C-4ʹ), 129.7(d, C-3ʹ), 129.7(d, C-5ʹ), 128.6(d, C-2ʹ), 128.6(d, C-6ʹ), 79.3(d, C-5), 52.2(q, C-9), 30.5(t, C-6), 29.7(t, C-7)。
化合物4: 白色无定型粉末, 分子式为C5H6O4, (+)-ESIMS m/z 261.05 [2M+H]+, m/z 283.65 [2M+Na]+; 1H NMR (CD3OD, 400MHz) δH 6.98(1H, d, J=15.6Hz, H-3), 6.58(1H, d, J=15.6Hz, H-2), 3.72(3H, s, H-1); 13C NMR (CD3OD, 125MHz) δC 166.1(s, C-5), 164.9(s, C-4), 138.5(d, C-3), 128.9(d, C-2), 52.5(q, C-1)。

2.6 单体化合物MIC值测定

将粗提物对5株具有较好抑菌活性的指示菌挑选出来, 进行单体化合物的MIC值测定, 测定结果见下表4, 从结果中可以看出化合物1~4对多耐白色念珠菌抑制活性最好, 对稀瓦氏菌的抑制活性最弱。其中, 化合物2和4对多耐白色念珠菌抑制活性最好, 其MIC值均为6.25μg·mL-1。
表4 化合物1~4对5株指示菌的MIC值(单位: μg·mL-1)

Tab. 4 Minimum inhibitory concentration (MIC) of compounds 1 ~ 4 against 5 indicator bacteria

化合物 枯草芽孢杆菌 多耐白色念珠菌 苏云金芽孢杆菌 希瓦氏菌 藤黄微球菌
1 25 12.5 50 200 >200
2 >200 6.25 25 >200 100
3 25 12.5 12.5 >200 >200
4 12.5 6.25 50 200 12.5
硫酸庆大霉素 12.5 6.25 1.56 12.5 12.5

2.7 单体化合物卤虫致死活性测定

卤虫致死活性测试方法同上, 在致死试验为24h时, 化合物 1~4均显示出较强的卤虫致死活性, 其LD50值分别为7.40、11.95、17.69和23.35μg·mL-1。

3 讨论

曲霉属(Aspergillus)属于子囊菌门, 在陆地和海洋均有分布, 其种类繁多, 代谢产物丰富。研究表明, 该菌属具有丰富的酶类, 能够产生多种化学类型丰富且生理活性显著的代谢产物, 是寻找活性物质的重要资源(江北 等, 2019)。本试验获得的深海真菌101#的粗提物对上述15种指示菌均具有不同的抑制活性, 其中对海洋生物污损菌(A. macleodii SCAU-003)的最小抑菌浓度MIC为3.125μg·mL-1, 目前, 还未见文献报道深海曲霉属真菌粗提物对该菌抑制活性的报道。对另外10种革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度范围为0.781~6.25μg·mL-1, 其中对B. subtilis的抑制作用最强, 其MIC值为0.781μg·mL-1。Zhu等(2019)从海洋衍生杂色曲霉(A. versicolor MCCC 3A00080)中分离出一种新的联苯衍生物versiperol A (1), 该化合物对S. aureus的MIC值为8μg·mL-1, 表现出适度的抑制活性。Ding等(2019)从海洋衍生杂色曲霉中分离出两种新的呋喃二酮衍生物, 鉴定为曲霉菌A (1)和B (2), 曲霉菌A和B对C. albicans的MIC值均为64μg·mL-1, 表现出中度抗菌活性。Hu等(2019)从渤海海洋沉积物中分离得到的杂色曲霉(A. versicolor MF180151)中分离出6种新型二酮哌嗪类化合物, 其中化合物1~4对B. subtilis、S. aureus、MRSA、C. albicans的MIC > 100μg·mL-1, 没有表现出抑菌活性; 而花青素B (5)和奥佛尼红素 (6)对S. aureus、MRSA的MIC值均为6.25μg·mL-1和12.5μg·mL-1, 二者均表现出一定抑菌活性。董怡飞等(2022)从西太平洋海洋沉积物中分离得到的Aspergillus sp. 20220129分离并鉴定了9个化合物, 其中化合物5、8和9对S. aureus的MIC值分别为100μg·mL-1、100μg·mL-1和50μg·mL-1。本试验的抑菌活性结果均高于上述报道数据。对C. albicans而言, 本试验的抑菌圈直径大小为12.8mm, 叶禹秀等(2022)从南海礁栖腔节藻Coelarthrum sp.共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403中分离得到化合物7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (3), 该化合物对C. albicans的抑菌圈直径大小为25mm, 其抑菌活性优于本试验结果。此外, 本试验粗提物对禾谷镰刀菌(F. graminearum)、意大利青霉(P. italicum)和尖孢镰刀菌(F. oxysporum)均具有不同程度的抑制作用, 最小抑菌浓度范围为50~200μg·mL-1。禾谷镰刀菌主要导致小麦赤霉病, 罗寒等(2017)从分离自红树林植物榄李新鲜叶片中的内生真菌杂色曲霉Aspergillus versicolor MA-229的发酵产物中分离得到9个化合物(1~9), 其中化合物6对小麦赤霉病菌(即F. graminearum)的MIC值为16μg·mL-1, 化合物1则大于64μg·mL-1, 本试验获得的粗提物对F. graminearum的MIC值为50μg·mL-1, 介于两个化合物之间。尖孢镰刀菌主要导致香蕉枯萎病, 谭雁鸿等(2019)从中国南海软珊瑚来源真菌Eupenicillium sp. DX-SER3 (KC871024)的次级代谢产物中分离得到化合物烟曲霉酸, 该化合物对F. oxysporum不显示抑制活性, 而本试验获得的粗提物对F. oxysporum呈现出一定的抑制活性, 其MIC值为200μg·mL-1, 略高于其报道的试验结果。卤虫致死活性方面, 黄智等(2012)从南海北部2801m深的沉积样品发现了一株白黄笋顶孢霉真菌(Acrostalagmus luteoalbus), 该真菌粗浸膏在50μg·mL-1的浓度下, 24h时对卤虫的致死率都达到100%; 曾奇等(2018)发现2株深海真菌的粗提物对卤虫致死活性显著, 其LD50值分别为68.59μg·mL-1和78.83μg·mL-1; 罗寒等(2017)获得的化合物1的LD50值为0.756 mg·mL-1, 以上数据均优于本试验结果(13.797mg·mL-1); 而于清武等(2015)从南海1001m沉积物中分离得到1株细菌Exiguobacterium profundum, 其粗提物的LD50值为9.33mg·mL-1, 与本试验结果较为接近。上述抑菌活性和卤虫致死活性的差异可能是由于不同深海缺氧环境以及不同菌株之间代谢产物活性差异所致。
单体化合物抑菌活性方面, 化合物1~4具有一定抑菌活性, 可能原因是这些化合物中含有氯酚类、杂环类和有机酸酯类结构片段, 这些基团具有一定的抗菌效果(Scicutella et al, 2021)。另外, 卤虫致死活性方面, 化合物2的卤虫致死活性LD50值为11.95μg·mL-1, 而化合物(-)-xylariamide A在浓度为20μg·mL-1时, 卤虫致死率为0, 化合物2的卤虫致死活性明显优于(-)-xylariamide A, 可能的原因是C-9位羧基被甲酯化后提高了卤虫的致死毒性。

4 结论

本试验基于rDNA-ITS基因序列分析方法, 对深海真菌101#菌株进行分子鉴定, 结果表明该真菌为黄曲霉(Aspergillus flavus)。采用高效液相色谱跟踪该菌株发酵规律的变化, 结果显示第28天其次级代谢产物吸收峰的种类最丰富、吸收强度最大, 且在200~350nm范围内的紫外吸收最强。抑菌活性测定表明该菌株的发酵粗提物对多株指示菌均具有一定的抑制活性, 其中对A. macleodii SCAU-003、B. subtilis和F. graminearum的最小抑菌浓度MIC分别为3.125、0.781和50μg·mL-1, 且对A. macleodii SCAU-003的抑菌活性数据为首次报道。卤虫致死活性显示该粗提物表现出较强的生物致死毒性, 1、12、24和48h的LD50值分别为74.597、24.322、13.797和8.559mg·mL-1。对该菌株的次级代谢产物进行了分离纯化, 共分离得到4个单体化合物, 化合物1~4对枯草芽孢杆菌、多耐白色念珠菌、苏云金芽孢杆菌、希瓦氏菌和藤黄微球菌显示出一定的抑制活性, 其MIC值范围为6.25~200μg·mL-1。此外, 这4个化合物均显示出较强的卤虫致死活性, 其IC50值分别为7.40、11.95、17.69和23.35μg·mL-1。本研究不仅丰富了深海真菌次级代谢产物的结构类型, 而且在生物医药和农业病虫害防治方面具有潜在的应用价值。

*藤黄微球菌、无乳链球菌、福氏志贺菌、麦氏交替单胞菌以及6种植物病原菌均由华南农业大学张晓勇课题组惠赠, 在此表示衷心的感谢！

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