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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 124 - 133

DOI: https://doi.org/10.11978/2022263

海洋生物学

高产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其在方斑东风螺养殖中的应用

  • 武慧宇 , 1, 2 ,
  • 高秀菊 1, 2 ,
  • 葛东振 2 ,
  • 朱军 2, 3, 4 ,
  • 邹潇潇 2, 3, 4 ,
  • 黄惠琴 2, 3, 4 ,
  • 顾志峰 1 ,
  • 鲍时翔 , 2, 3, 4
展开
  • 1. 海南大学海洋学院, 海南 海口 570228
  • 2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南热带农业资源研究院海南省热带农业资源保护与利用重点实验室, 海南 海口 571101
  • 3. 中国热带农业科学院湛江实验站, 广东 湛江 524013
  • 4. 海南省海洋生物功能性成分研究与利用重点实验室, 海南 海口 571101
鲍时翔。email:

武慧宇(1995—), 男, 山西省太原市人, 硕士研究生, 从事水生动植物疫病防控研究。email:

收稿日期: 2022-12-26

  修回日期: 2023-02-27

  网络出版日期: 2023-03-08

基金资助

农业农村部财政专项(NFZX2021)

农业农村部财政专项(NHYYSWZZZYKZX2020)

中央级公益性科研院所基金项目(1630052019014)

收起

Screening and identification of high protease producing strain and its application in culture of Babylonia areolata

  • WU Huiyu , 1, 2 ,
  • GAO Xiuju 1, 2 ,
  • GE Dongzhen 2 ,
  • ZHU Jun 2, 3, 4 ,
  • ZOU Xiaoxiao 2, 3, 4 ,
  • HUANG Huiqin 2, 3, 4 ,
  • GU Zhifeng 1 ,
  • BAO Shixiang , 2, 3, 4
Expand
  • 1. College of Oceanography, Hainan University, Haikou 570228, China
  • 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, CATAS & Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Haikou 571101, China
  • 3. Zhanjiang Experimental Station, CATAS, Zhanjiang 524013, China
  • 4. Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources, CATAS, Haikou 571101, China
BAO Shixiang. email:

Received date: 2022-12-26

  Revised date: 2023-02-27

  Online published: 2023-03-08

Supported by

Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P. R. of China(NFZX2021)

Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P. R. of China(NHYYSWZZZYKZX2020)

Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund(1630052019014)

Fold

摘要

方斑东风螺是我国及东南亚地区重要的海水养殖品种, 由于养殖底质污染, 导致方斑东风螺病害频发。文章从健康方斑东风螺养殖池底沙中筛选蛋白酶高产菌株, 基于形态、生理生化和分子特征对高产蛋白酶菌株进行鉴定, 通过菌株溶血性检测和药敏试验初步评价其安全性, 在单因素试验的基础上通过正交试验对其发酵培养基碳源、氮源及金属盐进行优化, 并在室内养殖条件下考察了其对方斑东风螺养殖水体(氨氮、亚硝酸盐氮、化学需氧量)、底沙(总氮、有机碳)以及方斑东风螺生长(存活率、特定生长率)的影响。结果表明: 从健康方斑东风螺养殖池底沙分离得到一株高产蛋白酶芽孢菌, 其蛋白酶活性为324.0U·mL-1, 命名为YZS02, 经鉴定菌株YZS02为越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis), 该菌株没有溶血活性, 对24种抗生素敏感, 其最优发酵培养基为酵母粉15g·L-1、可溶性淀粉20g·L-1、MgCl2 8g·L-1、NaCl 30g·L-1, 用此优化培养基在30℃, 200r·min-1条件下摇瓶发酵24h, 菌体密度可达到7.19×109个·毫升-1, 该密度是优化前的2.89倍, 同时优化后蛋白酶活性可达753.3U·mL-1, 为原来的2.3倍。YZS02能够有效降低方斑东风螺养殖水体氨氮和化学需氧量水平, 对底沙中的总氮也有很好的去除效果, 试验结束时对照组水体氨氮浓度为2.33mg·L-1、化学需氧量为278.37mg·L-1、底沙总氮含量为538.31μg·g-1, 而试验组水体氨氮浓度为0.78 mg·L-1、化学需氧量为128.47mg·L-1、底沙总氮含量为128.71μg·g-1。YZS02还能有效提高方斑东风螺的存活率及特定生长率。

关键词： 方斑东风螺; 养殖; 越南蔷薇菌; 蛋白酶; 培养基优化

本文引用格式

武慧宇 , 高秀菊 , 葛东振 , 朱军 , 邹潇潇 , 黄惠琴 , 顾志峰 , 鲍时翔 . 高产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其在方斑东风螺养殖中的应用[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(5) : 124 -133 . DOI: 10.11978/2022263

Abstract

Babylonia areolata is an important marine aquaculture variety in China and Southeast Asia. Due to the pollution of the breeding substrate, the disease of Babylonia areolata happens frequently. In this study, high-yielding protease strains were screened from the bottom sand of the healthy Babylonia areolata breeding pond. The high-yielding protease strain was identified based on morphology, physiological, biochemical and molecular characteristics. Its safety was preliminarily evaluated through strain hemolytic detection and drug sensitivity test, and its fermentation medium was optimized by single-factor and orthogonal tests. Chemicalization, and under indoor aquaculture conditions, the effects of the water bodies (ammonia nitrogen, nitrite nitrogen, COD), sediment (total nitrogen, organic carbon) and the growth (survivability rate and specific growth rate) of snails were investigated. The results showed that one strain YZS02 of high-yielding protease bacillus was isolated from the bottom sand of one healthy Babylonia areolata breeding pond, and was identified as Rossellomorea vietnamensis. The strain has no hemolysis activity. Sensitive to 24 antibiotics, the optimal fermentation medium is composed of 15 g·L-1 yeast powder, soluble starch 20 g·L-1, MgCl2 8 g·L-1, sodium chloride 30 g·L-1. This optimized liquid medium is used to shake bottle fermentation for 24 hours at 30℃ and 200 r·min-1. Under this conditions, the bacterial density can reach 7.19×109 cfu·mL-1, which is 2.89 times than that before optimization. YZS02 can effectively reduce the level of ammonia nitrogen and COD in the water cultured by Babylonia areolata. It also has a postive effect on removing the total nitrogen in the bottom sand, which can effectively improve the survival rate and specific growth rate of Babylonia areolata. At the end of the experiment, the ammonia nitrogen concentration in the control group was 2.33 mg·L-1, COD was 278.37 mg·L-1, and the total nitrogen content of sis was 538.31 μg·g-1, while the ammonia nitrogen concentration in the water body of the experimental group 3 was 0.78 mg·L-1 and COD was 128.47 mg·L-1. The total nitrogen content of sediment was 128.71 μg·g-1. YZS02 can also effectively improve the survival rate and specific growth rate of Babylonia areolate.

Key words： Babylonia areolata; aquaculture; Rossellomorea vietnamensis; protease; Medium optimization

方斑东风螺(Babylonia areolata)为肉食性海洋底栖贝类, 是我国及东南亚地区重要的海洋经济物种。方斑东风螺在我国海南省的养殖方式主要采用水泥池流水沙层自净养殖模式, 由于高蛋白的饵料残渣及东风螺排泄物等积累在沙床中, 引起底质恶化, 导致方斑东风螺病害爆发(Ruangsri et al, 2018), 底质恶化已成为方斑东风螺产业发展的瓶颈。目前生产上主要通过大量换水的方法来降低底质恶化, 不仅费水、费电, 而且带来严重的水污染问题。Zokaeifar等(2014)研究发现枯草芽孢杆菌可以使得对虾养殖水体中的氨态氮和硝态氮含量得到有效减少, Kuebutornye等(2019)研究表明, 微生物菌剂可替代抗生素和化学品预防水生动物疾病且对水产养殖环境无副作用。由此可见, 在水产养殖环境改善方面, 微生物制剂具有良好的应用前景。针对方斑东风螺养殖底沙污染问题开发的微生物菌剂, 目前尚未见报道。
众所周知, 微生物可分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等各种胞外酶, 这些胞外酶可以促进养殖环境中有机物的分解, 有效减少有机物积累(Yi et al, 2018)。为了降低东风螺养殖池底沙蛋白残余, 本研究从健康东风螺养殖环境中取样, 筛选高产蛋白酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定, 通过溶血性检测以及抗药性检测评价菌株的生物安全性, 以OD600值作为菌体密度响应指标, 在单因素试验基础上通过正交试验对其发酵培养基的碳源、氮源及金属盐进行了优化, 并在室内养殖条件下考察了其对方斑东风螺养殖水体[氨氮、亚硝酸盐氮、化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)]、底沙(总氮、有机碳)以及方斑东风螺生长(存活率、特定生长率)的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

昌江某东风螺养殖场健康池塘底沙和排水口底沙。

1.1.2 培养基

高产蛋白酶菌株分离培养基: 脱脂奶粉 10.0g·L-1, 氯化钠 30.0g·L-1, 琼脂 20g·L-1。
种子培养基: 2216E。
基础培养基: 蛋白胨 5.0g·L-1, 酵母粉 1.0g·L-1, 氯化钠 30.0g·L-1, pH 7.0。
LB固体培养基: 氯化钠 10g·L-1, 酵母粉 5g·L-1, 胰蛋白胨 10g·L-1, 琼脂 20g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取10g底沙样品, 置于250mL锥形瓶中, 并装入90mL无菌海水, 在30℃, 200r·min-1条件下振荡30 min, 使样品分散均匀。置80℃水浴处理15min, 杀死非芽孢菌。

1.2.2 蛋白酶高产菌株筛选

取100μL经热处理的菌悬液均匀涂布于脱脂奶粉平板, 28℃培养48h, 选择透明圈较大的单菌落进行平板划线, 获得纯培养菌株, 用于复筛。将初筛获得的候选菌株接种于基础培养基中, 28℃, 200r·min-1振荡培养24h, 培养液在4℃, 12000r·min-1条件下离心10min, 获得粗酶液。蛋白酶活力测定方法为福林酚法。蛋白酶活力: 在40℃和pH 7.5的条件下, 1mL粗酶液1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸即为1个酶活力单位, 以U·mL-1表示(Liu et al, 2022)。

1.2.3 菌株的鉴定

形态学观察: 用平板划线法将纯化后的目的菌株接种于2216E平板上, 置于28℃恒温培养箱培养48h, 观察菌落的形状、颜色、粘稠度以及边缘等特征。
生理生化特征鉴定: 按照参照文献(东秀珠 等, 2001)对目的菌株进行触酶、蛋白酶、甲基红、V-P试验等生化测试, 以进行生理生化特征鉴定。
16S rDNA系统发育分析: 采用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。以菌株YZS02基因组DNA为模板, 利用细菌16S rDNA的通用引物27F和1492R进行PCR扩增, PCR扩增体系(50μL)为: 模板2μL、PCRMix 25μL、27F 2μL、1492R 2μL、ddH2O 19μL。PCR扩增条件: 95℃预变性10min; 95℃变性30s, 50℃退火40s, 72℃延伸1.5min, 30个循环; 72℃ 10min。取3μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。将所得结果于EzBioCloud (www.ezbiocloud.net/eztaxon)数据库中进行序列比对, 选择与比对序列相似度高的模式菌株, 采用MEGA11软件中的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树(Tamura et al, 2021), 确定菌株分类地位。

1.2.4 菌株安全性分析

溶血性检测(Amoah et al, 2021): 将分离菌株在2216E平板活化传代后, 划线接种于哥伦比亚绵羊血平板中, 于37℃恒温培养箱中培养24h, 观察菌落周围是否出现溶血环。
抗生素抗性试验(Kim, et al, 2018): 活化分离菌株, 使菌株OD600值达到1, 取1mL菌液, 在4℃条件下离心, 用PBS缓冲液重悬菌体, 取100μL重悬后的菌液均匀涂布于LB固体培养基上, 用灭菌后小镊子夹取抗生素药敏纸片放于涂过菌液的平板表面, 将平板密封后放入恒温培养箱中培养24h, 观察是否产生抑菌圈。

1.2.5 发酵培养基优化

单因素试验: 分别选取不同碳源(甘油、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖)作为唯一碳源, 按照10g·L-1的添加量加入基础培养基中, 将种子液按2% (v/v)的接种量接种, 28℃, 200r·min-1条件下培养24h, 测定发酵液菌体浓度。以去离子水为空白对照校准后, 将发酵液用去离子水按一定倍数稀释摇匀后加入比色皿中, 在波长600nm测定其吸光值, 数值保持在0.2~0.8, 发酵液菌体浓度OD600=吸光值×稀释倍数。在此基础上, 考察碳源浓度(5g·L-1、10g·L-1、15g·L-1、20g·L-1、25g·L-1)对发酵的影响。按照此方法, 分别开展氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硝酸铵)和金属离子(CuCl2、MnCl2、MgCl2、ZnCl2、CaCl2)单因素试验。
正交试验: 在单因素优化基础上, 按照L9(34)正交设计进行正交试验, 研究碳源、氮源、金属离子对目标菌株发酵的影响。每个处理设定3个重复。

1.2.6 YZS02在方斑东风螺养殖中的应用评价

YZS02在方斑东风螺养殖中的应用评价, 主要考察添加YZS02对方斑东风螺养殖水体(氨氮、亚硝酸盐氮、COD)、底沙(总氮、有机碳)以及方斑东风螺生长(存活率、特定生长率)的影响。试验设计3组YZS02添加量, 添加后养殖水体YZS02浓度分别为1.38×105个·毫升-1、1.38×106个·毫升-1、1.38×107个·毫升-1, 另设不添加YZS02的对照组, 每组处理设置3个重复。养殖箱的规格为40cm× 30cm×30cm, 箱底铺3~5cm厚的底沙(经7目筛网去除河沙中的大颗粒沙石, 然后用9目筛网筛出粒径2~3mm的沙粒作为养殖底沙), 海水养殖, 水体高度25cm。选取活力良好、规格相近(重量约为0.6g)的方斑东风螺稚螺480颗, 随机分到12个养殖试验箱, 每个箱中放入螺苗40头, 随机挑取10只进行称重, 通气养殖。向水体中添加YZS02菌液, 以冰鲜鱿鱼为饵料, 日饲喂量为螺总重的5%, 每天16:00投喂。每5天换水一次, 换水量为40%, 换水前取水样检测水体氨氮、亚硝酸盐氮、COD, 同时取底沙样品检测总氮和有机碳, 水体氨氮、亚硝酸盐氮、COD检测方法分别为纳氏比色法、萘乙二胺分光光度法、重铬酸钾法, 底沙总氮、有机碳检测方法分别为凯氏定氮法、重铬酸钾氧化还原容量法。养殖周期为30d, 试验结束后统计方斑东风螺存活数量并称重。

1.3 统计方法

结果用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示, 利用SPSS18.0对试验结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA), p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶高产菌株的筛选

通过脱脂奶粉平板初筛获得6株高产蛋白酶候选菌株, 编号依次为YZS01、YZS02、HWC01、PWK01、P398、P401, 结果如表1所示。菌株YZS02蛋白酶活性为324.0U·mL-1, 高于另外5株候选菌, 因此选取菌株YZS02为目的菌株进行下一步试验。
表1 蛋白酶高产菌株复筛结果

Tab. 1 Re-screening results of high protease-producing strains

菌株编号 蛋白酶活性/(U∙mL-1)
YZS01 298.3
YZS02 324.0
PWK02 277.5
P398 199.0
P401 203.0

2.2 菌株YZS02鉴定

2.2.1 菌株YZS02的形态学观察

菌株YZS02在2216E平板上生长迅速, 菌落直径2~3mm, 边缘不规则, 表面无光泽, 淡黄色, 不透明, 菌体呈杆状, 革兰氏阳性(图1)。
图1 菌株YZS02的菌落形态(a)和菌体形态(b)

Fig. 1 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of strain YZS02

2.2.2 生理生化特征

菌株YZS02生理生化特征如表2。结果表明, 菌株YZS02可产生触酶和蛋白酶, 甲基红试验呈弱阳性, V-P试验呈阳性。pH 7~8时生长状态较好, NaCl浓度为3%~5%时菌株YZS02生长状况较好。
表2 菌株YZS02生理生化特征

Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain YZS02

指标 结果 最佳生长状态
酶试验 W
酪蛋白水解 +
pH 5~9 + 7~8
NaCl浓度0~10% + 3%~5%
温度10~45℃ + 30~37℃
明胶液化 -
荧光色素 W
甲基红试验 W
V-P试验 +
运动性 +
氧化酶 +
硝酸盐还原 -
吲哚产生 -
脲酶 -
精氨酸脱羧酶 -
H2S产生 -

注: +表示阳性; -表示阴性; W表示弱阳性

2.2.3 菌株YZS02 16S rDNA序列分析与鉴定

提取菌株YZS02的基因组DNA, 进行16S rDNA扩增, 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 菌株YZS02在1500bp附近有明显条带, 经过测序, 菌株YZS02的16S rDNA序列长度为1391bp。提交16S rDNA序列至EzBioCloud (www.ezbiocloud.net/eztaxon)数据库中进行比对, 菌株YZS02与Rossellomorea vietnamensis 15-1T (Noguchi et al, 2004; Gupta et al, 2020)同源性最高, 为99.3%。选择相似度高的模式菌株, 构建系统发育树如图2, 系统发育树形成3个大的分支, 菌株YZS02与Rossellomorea属聚在同一分支, 与Rossellomorea vietnamensis亲缘关系最近。结合菌体形态和生理生化特征, 鉴定菌株YZS02为越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis)。
图2 基于16S rDNA序列的菌株YZS02系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree of strain YZS02 and its closest neighbors based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株YZS02安全性评估

溶血性试验结果表明, 菌株YZS02未产生明显的透明溶血环, 无溶血现象。抗生素敏感性检测试验结果表明, 菌株对24种抗生素敏感(青霉素、庆大霉素、氨苄、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、多西环素、头孢曲松、头孢哌酮、新霉素、米诺环素、红霉素、麦迪霉素、氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素、丁胺卡那、多粘霉素、复方新诺明、痢特灵、氯霉素、克林霉素), 对卡那霉素和四环素不敏感(表3)。综上表明, 菌株YZS02具有较高的生物安全性。
表3 抗性检测试验

Tab. 3 Resistance test

抗性药物 纸片含药量 是否敏感
青霉素 10µg +
氨苄 10µg +
头孢氨苄 30µg +
头孢唑林 30µg +
头孢拉定 30µg +
头孢呋辛 30µg +
头孢他啶 30µg +
头孢曲松 30µg +
头孢哌酮 75µg +
多西环素 30µg +
丁胺卡那 30µg +
庆大霉素 10µg +
卡那霉素 30µg -
新霉素 30µg +
四环素 30µg -
米诺环素 30µg +
红霉素 15µg +
麦迪霉素 30µg +
氧氟沙星 5µg +
环丙沙星 5µg +
万古霉素 30µg +
多粘霉素 300IU +
复方新诺明 1.25µg +
痢特灵 300µg +
霉素 30µg +
克林霉素 2µg +

注: ＋表示敏感, －表示不敏感

2.4 菌株YZS02发酵培养基成分优化

2.4.1 碳源对菌株YZS02生长的影响

不同碳源对菌体密度的影响见图3。以可溶性淀粉为碳源时, 菌体密度最高, OD600达到2.75, 高于基础发酵培养基OD600值, 表明可溶性淀粉是最佳碳源。以不同浓度可溶性淀粉作为唯一碳源, 菌体密度结果如图4所示, 随着可溶性淀粉添加量的增加, 菌体密度呈现先升高后降低的趋势。当可溶性淀粉添加量为15g·L-1时, 菌体密度达到最高, OD600为3.395。
图3 不同碳源对菌株YZS02生长的影响

Fig. 3 Effect of carbon sources on strain YZS02 growth

图4 可溶性淀粉浓度对菌株YZS02生长的影响

Fig. 4 Effect of soluble starch concentration on the growth of strain YZS02

2.4.2 氮源对菌株YZS02生长的影响

不同氮源对菌体密度的影响如图5所示, NH4Cl、NH4NO3作为氮源时, 菌株YZS02不能正常生长, 而有机氮源能被菌株利用, 其中以酵母粉为氮源时菌体密度最高, OD600达到3.9, 表明酵母粉是最佳氮源。以不同浓度酵母粉作为唯一氮源, 菌体密度如图6所示, 当酵母粉添加量为5~20g·L-1时, 随着酵母粉含量增加, 菌体密度也呈现增加的趋势。当酵母粉添加量为20g·L-1时, 菌体密度达到最高, OD600为4.535。当酵母粉添加量继续增加时, 菌体密度下降。
图5 不同氮源对菌株YZS02生长的影响

Fig. 5 Effect of nitrogen sources on the growth of strain YZS02

图6 酵母粉浓度对菌株YZS02生长的影响

Fig. 6 Effect of yeast extract concentration on the growth of strain YZS02

2.4.3 金属离子对菌株YZS02生长的影响

不同金属离子对菌体密度的影响见图7。MgCl2和CaCl2能促进菌株YZS02生长, CuCl2、MnCl2和ZnCl2对菌株生长起抑制作用。当培养基中加入MgCl2时, 菌株生长优于基础发酵培养基, 菌株YZS02菌体密度最高, OD600值达到2.425。以Mg2+作为唯一金属离子时, MgCl2添加量对菌体密度的影响见图8。当MgCl2添加量为2~6g·L-1时, 随着MgCl2添加量增加, 菌体密度也呈现增加的趋势。当添加量为6g·L-1时, 菌体密度达到最高, OD600值为2.49, 当MgCl2继续增加时, 菌体密度呈下降趋势。
图7 不同金属离子对菌株YZS02生长的影响

Fig. 7 Effect of metal ions on the growth of strain YZS02

图8 氯化镁浓度对菌株YZS02生长的影响

Fig. 8 Effect of MgCl2 concentration on the growth of strain YZS02

2.4.4 正交试验设计

在以上优化结果的基础上, 以菌体密度为考察指标, 选取可溶性淀粉(A)、酵母粉(B)、MgCl2 (C) 3个因素进行正交试验, 试验结果见表4。
表4 菌株YZS02正交试验结果

Tab. 4 Orthogonal test results of strain YZS02

试验号 因子 OD600
可溶性淀粉浓度/(g·L-1) 酵母粉浓度/(g·L-1) MgCl2浓度/(g·L-1)
1 10 15 4 4.652
2 10 20 8 4.280
3 10 25 6 3.975
4 15 15 6 4.930
5 15 20 4 3.903
6 15 25 8 4.191
7 20 15 8 5.244
8 20 20 6 4.390
9 20 25 4 4.208
K1 12.907 14.826 12.763
K2 13.024 12.573 13.295
K3 13.842 12.374 13.715
R 0.935 2.452 0.952

注: K1、K2、K3为每个因素各水平下的指标之和, R为极差

通过正交试验结果可知, RB>RC>RA, 3个因素对试验结果的影响顺序为B>C>A, 即酵母粉(B)在这3个因素中影响最大, MgCl2 (C)次之, 可溶性淀粉(A)最小。由表4可以得出, 发酵培养基碳源、氮源以及金属盐的最优配方为可溶性淀粉 20g·L-1、酵母粉 15g·L-1、MgCl2 8g·L-1。

2.4.5 菌株YZS02的高密度发酵

在最优培养基和发酵条件下, 菌株YZS02的发酵曲线见图9。种子液接入培养基后0~6h为生长迟缓期; 6~12h为对数生长期, 菌体数量快速增多; 18h时开始进入平稳期; 24~48h时菌体量基本稳定, 略有增加。24h时菌体数量基本达到最大值, 此时菌液OD600为5.226; 菌体密度达7.19×109个·毫升-1, 经检测优化后发酵液蛋白酶活性达753.3U·mL-1。
图9 菌株YZS02发酵曲线

Fig. 9 Growth curve of strain YZS02

2.5 YZS02在方斑东风螺养殖中的应用效果评价

2.5.1 菌株YZS02对养殖水体氨氮的影响

在方斑东风螺养殖水体中添加YZS02菌剂, 考察YZS02菌剂对养殖水体氨氮的影响, 结果如图10。由图10可知, 对照组和试验组1氨氮水平呈均上升趋势, 但是试验组1上升速度较慢, 试验组2和试验组3氨氮水平先下降后上升, 上升速度十分缓慢, 在第30天时, 试验组2和试验组3水体中的氨氮均显著低于对照组和试验组1 (p<0.05), 试验组1在第30天时氨氮含量也显著低于对照组(p<0.05), 但二者在前15天没有差异显著性(p>0.05)。
图10 菌株YZS02对养殖水体氨氮的影响

Fig. 10 Effect of strain YZS02 on ammonia nitrogen in aquaculture water

2.5.2 菌株YZS02对水体亚硝酸盐氮的影响

YZS02菌剂对养殖水体亚硝酸盐氮的影响见图11。由图11可知, 对照组和试验组中亚硝酸盐含量始终处于较低水平, 对照组和试验组差异不显著性。
图11 菌株YZS02对养殖水体亚硝酸盐氮的影响

Fig. 11 Effect of strain YZS02 on nitrite nitrogen in aquaculture water

2.5.3 菌株YZS02对水体COD的影响

YZS02对养殖水体中的COD浓度变化产生了显著影响(p<0.05), 结果如图12所示。总体上看, 各处理组COD浓度均呈上升趋势, 试验组2和试验组3中水体COD浓度上升较为缓慢, 在前10天各处理组养殖水体中COD浓度无差异显著性(p>0.05), 从第15天开始, 对照组和试验组1中水体COD浓度迅速升高, 第30天时, 试验组2和试验组3中水体COD浓度显著低于对照组和试验组1 (p<0.05), 试验组2和试验组3之间没有差异显著性(p>0.05)。
图12 菌株YZS02对养殖水体化学需氧量(COD)的影响

Fig. 12 Effect of strain YZS02 on COD concentration in aquaculture water

2.5.4 菌株YZS02对底沙总氮的影响

菌株YZS02对养殖池底沙总氮的影响见图13。由图13可知, YZS02对养殖底沙中的总氮含量产生了显著影响(p<0.05), 对照组底沙总氮含量显著高于各试验组的底沙总氮含量(p<0.05), 试验组2和试验组3底沙总氮含量显著低于试验组1 (p<0.05), 而试验组2和试验组3之间底沙总氮含量没有差异显著性(p>0.05)。综上所述, 说明菌株YZS02在养殖系统中能够有效改善底沙氮残留。
图13 菌株YZS02对底沙总氮含量的影响

不同字母表示处理组间差异显著(p<0.05)

Fig. 13 Effect of strain YZS02 on total nitrogen in sediment. Different letters indicate significant difference in the survival rate among the treatment groups (p < 0.05)

2.5.5 菌株YZS02对底沙有机碳的影响

图14为菌株YZS02对底沙有机碳的影响。结果表明, YZS02对养殖底沙中的有机碳水平产生了显著影响(p<0.05), 各试验组底沙有机碳水平均低于对照组, 但试验组1和对照组底沙有机碳水平均没有差异显著性(p>0.05), 试验组2和试验组3底沙有机碳水平显著低于对照组和试验组1 (p<0.05), 但试验组2和试验组3之间没有差异显著性(p>0.05)。
图14 菌株YZS02对底沙有机碳含量的影响

不同字母表示处理组间差异显著(p<0.05)

Fig. 14 Effect of strain YZS02 on bottom sediment organic carbon. Different letters indicate significant difference in the survival rate among the treatment groups (p < 0.05)

2.5.6 方斑东风螺稚螺生长状况

YZS02对方斑东风螺稚螺生长的影响见表5。从表5中可以看出YZS02对方斑东风螺的体重、特定生长率、存活率均具有显著影响(p<0.05)。试验组3的特定生长率最高, 为10.11%, 显著优于另外3组(p<0.05); 对照组、试验组1和试验组2之间, 特定生长率差异不显著(p>0.05)。试验组3的存活率最高, 显著优于对照组和试验组1 (p<0.05), 但与试验组2之间差异并不显著(p>0.05); 试验组2存活率显著高于试验组1 (p<0.05), 但与对照组差异没有显著性(p<0.05); 试验组1和对照组之间没有差异显著性。
表5 方斑东风螺增重率和存活率统计

Tab. 5 Statistics of weight gain rate and survival rate of Babylonia areolate

项目 对照 试验组1 试验组2 试验组3
初始平均体重/g 0.62±0.02a 0.61±0.01a 0.62±0.01a 0.60±0.01a
终末平均体重/g 2.17±0.04b 2.24±0.09b 2.30±0.12b 2.53±0.11a
增重率/% 249.72±6.24b 264.34±14.64b 270.76±19.34b 319.40±18.98a
特定生
长率/%		 8.32±0.21b 8.81±0.49b 9.03±0.64b 10.65±0.63a
存活率/% 78.00±5.29bc 72.67±8.33c 87.33±4.16ab 93.33±3.06a

注: 同行不同字母表示各组间成活率差异显著(p<0.05)

3 讨论

在方斑东风螺养殖过程中, 底沙中滤积了大量的残饵、东风螺排泄物等有机物, 这些物质在兼性微生物的一系列生理生化作用下转变为有毒有害物质, 导致养殖环境恶化。早在20世纪初便有学者指出饵料残留可引起池水及底沙污染, 从而导致方斑东风螺稚螺的存活率低下和整体均匀度变差等一系列问题(梁飞龙 等, 2005)。随着方斑东风螺养殖密度的提高, 这一问题愈发严重。Dobson等(2020)指出高密度养殖所产生大量的残留饲料和增加的粪便等排泄物, 导致氨水平升高, 方斑东风螺的存活率也随之降低。Zhou等(2023)研究发现, 氨氮浓度达到5mg·L-1时会引起方斑东风螺组织损伤, 其生长性能、免疫力、存活率均会降低。为了改善方斑东风螺生长环境, Zhao等(2022)通过细基江蓠和海参与方斑东风螺混养可以净化水体中的氨态氮和亚硝酸盐氮, 并且养殖底沙中的总氮和有机碳的积累速度也会变慢。Dobson等(2020)发现金沙参和方斑东风螺混养能降低底沙中有机质的积累。有益微生物能分解水产动物环境中的有机物, 降低水体中氮和磷的浓度, 控制氨、亚硝酸盐等有害物质的含量。Verschuere等(2000)的研究表明益生菌在降低大分子有机物的积聚方面有显著效果。
芽孢杆菌是重要的产蛋白酶微生物, 目前关于产蛋白酶微生物的报道主要集中于枯草芽孢杆菌, 且其原始菌株蛋白酶活性一般低于100U·mL-1, 袁艳超(2017)筛到一株高产蛋白酶芽孢杆菌, 其蛋白酶活性为134.27U∙mL-1。本研究从方斑东风螺底沙中筛选出5株蛋白酶活性较高的菌株, 其中菌株YZS02与另外4株相比, 蛋白酶活性最高, 达到了324U∙mL-1, 其蛋白酶活性高于常见的枯草芽孢杆菌, 通过形态学观察、生理生化鉴定以及16S rDNA系统发育树构建的构建可确定菌株YZS02为越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis)。越南蔷薇菌最早分离于鱼露中, 在鱼露发酵中起重要作用(Lee et al, 2015)。宋俊男(2020)从对虾肠道也分离得到了越南蔷薇菌, 证明该菌株可作为潜在益生菌。何志伟等(2021)发现越南蔷薇菌存在于从白斑蛾蚺肠道中, 具有良好的蛋白酶和淀粉酶活性, 能够协助消化和分解食物。前人的研究为菌株YZS02的应用提供了一定的依据, 同时在菌株安全性方面也提供了保障, 本研究也用血平板法验证了其安全性, 试验结果显示YZS02不具有溶血活性, 养殖试验也表明其对方斑东风螺生长是安全的。在方斑东风螺养殖过程中添加YZS02的试验结果表明, 该菌株能够有效降低方斑东风螺养殖水体氨氮和COD水平, 对底沙中的总氮也有很好的去除效果, 能有效提高方斑东风螺的存活率及特定生长率。添加菌液使养殖水体YZS02浓度为1.38×107个·mL-1时效果最好。根据试验结果可合理的推断, YZS02通过分泌蛋白酶能够有效降解方斑东风螺养殖底沙中的残饵粪便, 从而减少养殖环境中的氮残留, 环境的改善促使东风存活率和特定生长率升高。
综上所述, 利用微生态制剂解决方斑东风螺底质中的蛋白污染确实具有一定的可行性, 菌株YZS02在方斑东风螺养殖中具有一定的应用前景。在后续试验中, 有必要深入研究探讨YZS02在东风螺养殖中的作用机制。

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