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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 6: 111 - 119

DOI: https://doi.org/10.11978/2023011

海洋生物学

海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物的影响

  • 孙婷婷 , 1, 2 ,
  • 郝雯瑾 , 3 ,
  • 徐鹏臻 1, 2 ,
  • 叶丽靖 1, 4 ,
  • 董志军 , 1
展开
  • 1.牟平海岸带环境综合试验站, 中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
  • 3.南通大学生命科学学院, 江苏 南通 226019
  • 4.烟台大学生命科学学院, 山东 烟台 264005
郝雯瑾, email: ;
董志军, email:

孙婷婷(1992—), 女, 山东省潍坊市人, 博士研究生, 从事海洋生物学研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2023-02-01

  修回日期: 2023-03-28

  网络出版日期: 2023-04-07

基金资助

国家自然科学基金(41876138)

国家自然科学基金(U2106208)

中国科学院战略性先导科技专项(XDA23050301)

收起

Effects of seawater acidification on microorganisms associated with Aurelia coerulea polyps

  • SUN Tingting , 1, 2 ,
  • HAO Wenjin , 3 ,
  • XU Pengzhen 1, 2 ,
  • YE Lijing 1, 4 ,
  • DONG Zhijun , 1
Expand
  • 1. Muping Coastal Environment Research Station, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. School of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226019, China
  • 4. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China
HAO Wenjin, email: ;
DONG Zhijun, email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2023-02-01

  Revised date: 2023-03-28

  Online published: 2023-04-07

Supported by

National Natural Science Foundation of China(41876138)

National Natural Science Foundation of China(U2106208)

Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences(XDA23050301)

Fold

摘要

海洋酸化是海洋生物面临的重要威胁, 研究海洋酸化对其共附生微生物群落的影响对于理解宿主和微生物应对环境压力的适应机制具有重要意义。海月水母(Aurelia coerulea)是我国灾害水母优势种, 在海洋生态系统中占有重要地位。本研究以海月水母螅状体为研究对象, 利用Biolog-ECO和宏基因组的方法, 探讨了未来海洋酸化环境(pH 7.8和7.6)对其共附生微生物群落结构和功能的影响。研究结果表明, 在不同程度海水酸化环境中, 海月水母螅状体的共附生微生物群落结构和功能具有保守性。Biolog-ECO研究结果发现, 海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物群落的微生物代谢活性、多样性指数和碳源利用影响较小。宏基因组研究结果显示, 海水酸化未影响海月水母螅状体共附生微生物的优势种和群落结构; 柔膜菌门(Tenericute)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是海月水母螅状体共附生微生物群落的优势类群。此外, 暴露于不同酸化条件下海月水母螅状体共附生微生物的功能无显著差异。因此, 我们推测未来海洋酸化不会通过改变共附生微生物的群落结构影响海月水母螅状体。

关键词： 气候变化; Biolog-ECO方法; 宏基因组; 群落结构; 代谢功能

本文引用格式

孙婷婷 , 郝雯瑾 , 徐鹏臻 , 叶丽靖 , 董志军 . 海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物的影响[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(6) : 111 -119 . DOI: 10.11978/2023011

Abstract

Ocean acidification (OA) poses strong threat to marine organisms, and studying the impact of OA on their associated microbial communities is important for understanding the adaptive mechanisms of host and microbial response to environmental stresses. Moon jellyfish (Aurelia coerulea) is the dominant species of disaster jellyfish in China and plays an important role in marine ecosystem. In this study, we investigated the effects of future OA (pH 7.8 and 7.6) on the structure and function of the A. coerulea polyp-associated microbial communities using Biolog-ECO and metagenomic approaches. The results showed that the structures and functions of the microbial community associated with A. coerulea polyps were conserved in different degrees of seawater acidification. Biolog-ECO results showed that seawater acidification had little effect on the microbial metabolic activity, diversity index and carbon source utilization of the associated microbial community of A. coerulea polyps. The metagenomic results showed that seawater acidification did not affect the dominant species and community structure of the microorganisms. Tenericute, Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes were the dominant groups of the community. Moreover, there was no significant difference in the function of associated microorganisms exposed to different acidification conditions. Therefore, we speculate that future OA will not affect the polyps by altering the community structures of their associated microorganisms.

Key words： climate change; Biolog-ECO method; metagenomics; structure of community; metabolic function

海洋作为地球上最大的碳汇之一, 自工业革命以来, 吸收了约30%的人类CO2排放量(Caldeira et al, 2005), 导致海水中CO2分压(pCO2)升高, 表层海水碱性下降, pH降低, 进而引发海洋酸化。国外研究显示, 目前海水pH的年均变化速率比工业时代前快数百倍, 预计本世纪末表层海水平均pH将降低0.3~0.5 (Teixidó et al, 2018)。而在近岸海域, pH的实际降低速率要比预测速率更快。海洋酸化会导致海水碳酸盐系统发生变化, 进而改变海水化学平衡, 并协同温度与海流等其他关键环境因子的作用共同影响整个海洋生态系统。
过去十几年间, 国内外研究者研究了海洋酸化对海洋生物种群结构、物种多样性、基因表达及群落功能潜力的影响(Fabricius et al, 2011; Ziveri et al, 2014; Kenkel et al, 2018; Teixidó et al, 2018; 袁翔城 等, 2023)。另外, 海洋酸化也可能改变某些海洋生物的共附生微生物群落组成(Morrow et al, 2015; Botté et al, 2019)。例如: 海洋酸化对珊瑚(Acropora eurystoma)共附生微生物群落的影响研究表明, 虽然 pH 的改变没有影响优势种群(γ-变形菌和蓝细菌), 但与正常海水环境(pH=8.2)相比, 酸化条件下(pH=7.3)的共附生微生物群落多样性更高, 部分微生物种群出现频率发生显著变化(α-变形菌显著增加, δ-变形菌和Bacteroidetes显著降低), 同时致病菌(vibronaceae和alteromonadaceae)数量和种类明显增加; 珊瑚周围海水的细菌多样性也发生变化, 低pH条件下海水中α-变形菌和疣微菌(Verruncomicrobiae)的含量明显降低(分别为9%和6%), γ-变形菌和蓝细菌的比例显著上升(9%和8%)(Meron et al, 2011)。此外, 在研究宿主-微生物相互作用介导的海洋酸化下珊瑚藻类Corallinales Rhodophyta的恢复力时发现, 死藻与活藻的微生物群落保持稳定, 但暴露于升高的pCO2后, 它们的微生物群落发生改变, 其中γ-变形菌的相对丰度显著降低(Cavalcanti et al, 2018)。因此, 维系微生物与宿主的共附生关系, 有助于宿主在应对环境压力时更好地恢复。
海洋生物拥有丰富多样的共附生微生物群落(Thomas et al, 2016), 这些微生物群落在宿主营养循环、维生素生产和天然产物生物合成中起着重要作用(Hentschel et al, 2012; Webster et al, 2016)。共生细菌和宿主海绵(Cymbastela concentrica)能够在维生素的产生、营养物质的运输和利用以及氧化还原反应等代谢过程中互作, 机体利用锚蛋白和四肽重复蛋白介导蛋白质间的相互作用来区分食物和共生细菌(Thomas et al, 2010)。水母共生微生物组是细菌的一个联合体, 该细菌群落偏好附着的生活方式, 能够降解复杂的有机化合物, 营附生、共生和寄生生活(Tinta et al, 2019)。Lee等(2018)研究发现钵水母(Chrysaora plocamia)和海月水母(Aurelia aurita)的共附生细菌群落不同于周围水体环境中的浮游细菌群落, 具有明显的种间特异性; 其中核心细菌群落在水母的不同生活史阶段均有出现, 是介导宿主体内碳、氮、磷和硫循环的关键驱动因素。
海月水母(Aurelia coerulea)属刺胞动物门(Cnidaria), 钵水母纲(Scyphozoa), 旗口水母目, 洋须水母科, 海月水母属(Aurelia), 广泛分布于全球温带近岸海域(高尚武 等, 2002)。海月水母的大规模暴发会给海岸带生产活动带来许多负面影响, 如堵塞滨海发电厂冷却系统, 严重影响用电供应; 摄食海洋动物的卵和经济鱼类的幼体, 影响渔业资源的恢复等, 已成为近岸海域的主要生态灾害水母物种之一(Lucas, 2001; Dong et al, 2010)。海月水母的生命历程极其复杂, 包括浮浪幼虫、螅状体、碟状体和成体四个生命阶段, 其中营底栖生活的螅状体被认为是造成水母种群暴发性增殖的关键阶段(Lucas et al, 2012)。本研究采用Biolog-ECO和宏基因组的方法研究了在未来海洋酸化条件下对海月水母螅状体共附生微生物群落结构和功能的影响, 以期了解海月水母微生物群落如何对环境变化做出反应, 明确气候变化情景下海月水母共附生微生物的迁移转变过程。

1 材料和方法

1.1 样本采集和培养

海月水母(A. coerulea)螅状体潜水采集于威海荣成的沿海湖泊, 当日转移至中国科学院烟台海岸带研究所实验室。挑选触须伸展良好的螅状体, 置于50mL的塑料培养瓶附着培养, 19℃预驯化约6个月。其间, 每周喂食2次刚孵化的卤虫无节幼体(Artemia salina nauplii), 3h后换水。
实验在水族箱(250L)内进行, 每个水族箱中安装水泵(DYH-8, HIGERY, 中国)、带显示屏浸没式加热器(E300, EHEIM, 德国)和箱壁带有圆孔(d=1mm)的丙烯酸隔离箱(40cm×35cm×30cm), 并在隔离箱内放置一块88孔丙烯酸培养板(22cm×16cm×2cm)。实验开始前, 挑取792只经长期驯化的螅状体, 随机放入9块88孔培养板中, 每孔一只, 在经砂滤处理的天然海水中附着适应2周(150L, pH为8.15, 温度为21.0℃, 盐度为30.00‰)。2周后, 拆除隔离箱。第1周是螅状体附着的关键期, 避免换水时水流扰动附着, 仅在第7d时喂食换水一次。同样, 避免体内食物残留对实验结果的影响, 在第6周(第38d)也仅喂食一次。在其他适应和实验暴露期间, 保持一周两次喂食换水频率。每天观察并剔除新生长的螅状体, 确保最终获得经过6周酸化的样本。

1.2 实验设计

本研究依据联合国政府间气候变化专门委员会(Intergovernmental Panel on Climate Change, IPCC)报告中对未来海洋酸化的预测设置3个pH处理组: 8.1(对照组)、7.8(中度酸化组)和7.6(重度酸化组)。暴露持续42d, 每个处理设置3个重复水族箱, 每个水族箱内养殖88只海月水母螅状体。暴露期间, 对照组中鼓泡空气, 酸化实验组中鼓泡CO2和空气的混合气体。通过气体流量调节系统将各处理组pH控制在设定值, 并保持海水溶解氧(dissolved oxygen, DO)浓度接近饱和。海水温度(21℃)由空调和300W浸没式加热器控制, 海水流速(100L·h-1)由8w水泵控制。实验期间除人为因素导致少量螅状体丢失外, 其他全部存活。
实时测量pH、温度和DO, 每天使用YSI水质分析仪(YSI-exo2, Ohio, USA)测量盐度。按《GB/T 12763.2—2007海洋调查规范第2部分: 海洋水文观测》(汤毓祥 等, 2007)每周测定水族箱内海水的总碱度(total alkalinity, TA)。根据温度、盐度、TA和pH实测数据, 利用CO2SYS计算pCO2和溶解有机碳浓度(dissolved inorganic carbon, DIC)等海水碳酸盐化学的相关参数(Millero et al, 2006)。试验海水化学参数如表1所示。
表1 暴露实验测量计算海水碳酸盐化学参数

Tab. 1 Measured and calculated carbonate chemistry parameters of seawater for the exposure experiment

处理组 pH 温度/℃ 盐度/‰ TA/(μmol·kg-1) pCO2/μatm DIC/(μmol·kg-1)
对照 8.14±0.02 21.0±0.0 28.6±0.9 2521.53±34.21 529.67±27.56 2307.44±29.02
中度酸化 7.80±0.00 21.0±0.0 28.6±0.8 2523.60±36.20 1252.19±15.65 2447.38±33.77
重度酸化 7.60±0.01 21.0±0.0 28.5±0.8 2494.88±31.88 2028.32±28.00 2485.80±30.12

1.3 Biolog-ECO检测海月水母螅状体共附生微生物代谢活性

本研究利用Biolog-ECO微孔板(Biolog Inc., Hayward, CA)分析酸化对海月水母螅状体共附生微生物群落组成和代谢特征的影响差异。6周暴露实验结束后, 每个处理组随机挑取20只螅状体, 迅速用0.2μm滤膜过滤的无菌海水冲洗体表3次以上。加入2mL0.85%的生理盐水进行冰浴研磨, 并将匀浆液定容至20mL。随后, 置于振荡培养箱中300r·min-1振荡30min。将摇匀的液体添加到Biolog-ECO微孔板中, 每孔150μL, 每样一板(3个重复)。将Biolog-ECO微孔板置于28℃恒温培养箱中, 4h后利用多功能酶标仪(Infinite M200, Switzerland)在590nm和750nm读数, 此次读数设为初始值, 之后每隔24h读数1次, 连续6d。
平均颜色变化率(average well color development, AWCD)表征海月水母螅状体共附生微生物群落在不同时间节点对31种碳源的综合利用能力, 反映不同微生物群落间的平均活性差异。计算公式为AWCD=Σ(Ci-R)/n (Garland et al, 1991), 其中Ci为除对照孔外的每个孔的吸光度值, R为对照孔的吸光度值, n为碳源量(n=31)。
利用各样本培养144h的数据, 分析海月水母螅状体共附生微生物群落的多样性指数, 包括Shannon's多样性指数H' =-ΣPi(lnPi); Pielou均匀度指数J=H'/lnS; Simpson优势度集中度指数D=1-∑(Pi)2; McIntosh多样性指数$U=\sqrt{\sum{n_{i}^{2}}}$。其中Pi表示第i个碳源孔的吸光值与所有碳源孔吸光值总和的比值, S为所使用的单个碳源总数, ni为第i孔的相对吸光度。
计算海月水母螅状体共附生微生物对6种碳源(糖、氨基酸、酯、醇、胺和酸)的利用率, 分析不同处理组对同一碳源利用的差异。

1.4 宏基因组

1.4.1 DNA提取、文库构建和测序

暴露结束后, 每个处理组随机挑取健康且生长状况良好的海月水母螅状体30只, 每个样本10只, 每组3个重复。使用70%乙醇和无菌无钙/镁海水(Ca/Mg free seawater, CMFSW)将待使用的仪器和设备彻底清洗后, 进行DNA提取。
DNA提取的具体前处理方法主要参考Keller-Costa等(2021)。CMFSW冲洗体表两次以上, 用无菌手术刀将螅状体解剖成小组织块。随后, 将组织块转移至500μg·mL-1胶原酶(Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA)溶液中, 吹打混匀室温孵育30min。样本由100μm无菌细胞过滤器(Corning, New York, USA)过滤至无菌离心管中, 滤液在4℃, 100×g离心15min。上清液利用5μm针筒微孔膜过滤器过滤2次。最终, 滤液4°C, 12000×g离心20min, 沉淀微生物细胞提取DNA。使用DNeasy PowerSoil试剂盒(QIAGEN)提取DNA。A260/A280比值为1.8~2.00, 平均浓度约为20ng·μL-1的DNA, 由美吉公司进行文库构建和测序。
文库构建和测序方法。首先, 利用Covaris M220(Gene Company Limited, China)对提取的DNA进行片段化, 片段大小约为400bp。随后, 使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq(Bioo Scientific, Austin, TX, USA)构建双端文库。将包含全部测序引物杂交位点的适配器连接到片段的平端。最后, 根据制造商说明书(www.illumina.com), 使用NovaSeq试剂盒对Illumina NovaSeq(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)进行双端测序。与本研究相关的序列数据已提交NCBI Short Read Archive数据库(登录号: PRJNA928487)。

1.4.2 基因组组装、序列质量控制和基因组装配

使用美吉生物云平台(cloud.majorbio.com)上的fastp对低质量reads (N个碱基, 最小长度阈值50bp, 最小质量阈值20) 进行裁剪和移除, 生成clean reads。使用BWA将其映射到海月水母参考基因组, 以识别和删除海月水母宿主的reads。利用MEGAHIT将这些高质量reads组装到contigs中, 使用简洁的de Bruijn图。选择长度≥300bp的contigs作为最终的装配结果。

1.4.3 基因预测、分类和功能注释

使用MetaGene识别contigs中的开放阅读框(open reading frames, ORF)。用NCBI翻译表检索长度大于100bp的预测ORF, 并将其翻译成氨基酸序列。利用CD-HIT构建非冗余基因目录, 序列同源性为90%, 覆盖率为90%。利用SOAPaligner将质控后的reads以95%的同源性映射到非冗余基因目录, 并评估每个样本的基因丰度。基因丰度采用Reads Per Kilobase Million(RPKM)方法计算。
在NCBI NR数据库上使用DIAMOND v0.9.19实现的blastp对非冗余基因目录的代表性序列进行分类注释, 使用DIAMOND进行分类注释, 其中e值截距为1e-5。使用DIAMOND在eggNOG数据库上对代表性序列进行了同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)注释, e值截距为1e-5。

1.5 统计分析

采用单因素方差分析(one-way variance, ANOVA)检验海洋酸化对海月水母螅状体共附生微生物群落结构和代谢活性的影响, 以HSD方法检测不同pH海水处理组的差异程度, 以P< 0.05为显著水平。数据分析之前进行方差齐性检验, 运用SPSS 19.0软件(IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。宏基因组数据在美吉生物云平台进行分析。本研究绘图使用R和Origin 18.0软件。

2 结果

2.1 海月水母螅状体共附生微生物代谢活性

随着培养时间的延长, AWCD不断升高, 并在144h逐渐维持稳定(图1a), 因此, 采用此时的数据表征海月水母螅状体共附生微生物的平均活性。结果显示, 重度酸化组的AWCD最低(图1a), 但不同处理组间AWCD没有显著差异(F2, 6=2.287, P=0.183, 表2), 表明酸化对海月水母螅状体共附生微生物AWCD影响较小。
图1 海月水母螅状体共附生微生物代谢活性

a. AWCD变化曲线; b—e. 微生物多样性指数; f—k. 微生物对6类碳源的利用

Fig. 1 Metabolic activity of symbiotic and epibiotic microorganism in A. coerulea polyps. (a) AWCD change curve; (b-e) microbial diversity index; (f-k) microbial utilization of class 6 carbon sources

表2 基于 Biolog-ECO 技术的海月水母螅状体共附生微生物AWCD、多样性指数和6类碳源利用的单因素方差分析结果

Tab. 2 One-way ANOVA results of AWCD, diversity index and utilization of 6-type carbon sources by microorganisms associated with A. coerulea polyps based on Biolog-ECO technique

测量指标 F P
AWCD 144h F2,6=2.287 P=0.183
多样性指数 Shannon's指数(H') F 2,6=4.008 P=0.078
Pielou指数(J) F 2,6=4.008 P=0.078
Simpson指数(D) F 2,6=4.426 P=0.066
Mclntosh指数(U) F 2,6=0.794 P=0.495
碳源 糖 F 2,6=4.356 P=0.068
氨基酸 F 2,6=0.839 P=0.477
酯 F 2,6=0.713 P=0.528
醇 F 2,6=1.828 P=0.240
胺 F 2,6=0.670 P=0.546
酸 F 2,6=0.837 P=0.478
利用H'、J、D和U分析海月水母螅状体共附生微生物群落功能多样性(图1b—e), 用以表征共附生微生物群落的丰富度、均匀度和优势度等(马克平 等, 1995)。与对照组相比, 重度酸化组4个指数均降低, 轻度酸化组除U外的其他指数略有下降, 但均无显著性差异(表2), 表明酸化对微生物群落结构影响较小。
海月水母螅状体共附生微生物对酯类和氨基酸类物质的利用程度较高, 其次为糖、醇、胺和酸(图f—k)。在不同程度酸化暴露下, 海月水母螅状体共附生微生物对除氨基酸外的其他5种碳源利用程度的变化趋势一致, 对糖类、醇类和酸类的利用程度降低, 对脂类和胺类的利用程度升高(图1f—k)。与对照组相比, 酸化对6种碳源的利用程度均无显著差异(P>0.05) (表2)。表明海水酸化不会显著改变海月水母螅状体共附生微生物的代谢活性。

2.2 宏基因组

2.2.1 海月水母螅状体共附生微生物的群落结构

在对海月水母螅状体共附生微生物的宏基因组测序分析中, 每个样本获得了1.78×105~2.35×105contigs(长度≥300bp)和8.7×104~1.2×105条ORF序列。结果显示, 对照组螅状体共附生微生物组由98.19%的细菌, 0.80%的真菌, 0.45%的古生菌和0.56%的病毒组成; 中度酸化组由97.58%的细菌, 1.33%的真菌, 0.42%的古生菌和0.67%的病毒组成; 重度酸化组由98.07%的细菌, 0.89%的真菌, 0.49%的古生菌和0.55%的病毒组成。
门水平上, 柔膜菌门(Tenericute)在海月水母螅状体共附生微生物组成中平均相对丰度最高(对照组46.95%, 中度酸化组38.25%, 重度酸化组44.66%) (图2a), 其次是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。属水平上, 螺原体属(Spiroplasma)、支原体属(Mycoplasma)和沃尔巴克氏体属(Wolbachia)平均相对丰度较高(图2b)。不同处理组top10属卡方检验的结果显示, 共附生微生物组成无显著性差异(P>0.05)。种水平上, γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria bacterium)、扁螺旋体(Spiroplasma platyhelix)、螺原体 WSS(Spiroplasma sp. WSS)、Microlunatus soli、Bathymodiolus brooksi thiotrophic gill symbiont、巴氏甲烷球菌(Methanosarcina barkeri)、梅毒螺旋体(Spiroplasma syrphidicola)、埃里奥氏螺旋体(Spiroplasma eriocheiris)、Solemya velum gill symbiont、螺旋原体(Spiroplasma apis)是海月水母螅状体共附生微生物的优势种(图2c)。这表明酸化不会显著改变共附生微生物的群落组成。
图2 不同处理组前10种海月水母螅状体共附生微生物在门(a)、属 (b)、种(c)水平的组成和丰度柱状图

Fig. 2 Bar graph of the composition and abundance of microorganisms associated with A. coerulea polyps at the phylum (a), genus (b), and species (c) levels in different treatment groups (top10)

对不同处理组海月水母螅状体共附生微生物的菌落组成在门、属和种水平进行PCoA分析(图3), 通过PERMANOVE分析发现共附生菌落在三个水平均无显著差异(P>0.05)。这表明酸化不会显著改变共附生微生物的群落结构。
图3 不同海水酸化下海月水母螅状体菌落在门(a)、属(b)和种水平(c)组成结构的PCoA分析

Fig. 3 PCoA analysis of the composition structure of colonies at phylum (a), genus (b) and species (c) levels under different seawater acidification

2.2.2 海月水母螅状体共附生微生物的功能特征

基于宏基因组测序获得COG功能基因类别的相对丰度(图4)。暴露于不同酸化条件下海月水母螅状体共附生微生物共富集到能量生产和转换、细胞周期控制、细胞分裂、染色体划分等20项功能基因类别。不同处理组海月水母螅状体共附生微生物均在翻译、核糖体结构和生物发生; 复制、重组和修复; 核苷酸的代谢和转运等功能基因类别的相对丰度较高, 分别为19.44%~26.48%、13.93%~16.45%和4.56%~6.05%。随后, 利用单因素方差分析方法进行物种与功能的差异分析, 选择FDR的多重检验校正方法, 并采用Tukey-Kramer的Post-hoc的检验方法, 对功能基因类别的相对丰度进行多组比较, 结果显示, 暴露于不同酸化条件下螅状体共附生微生物的功能均无显著差异(P>0.05)。表明海洋酸化不会显著影响海月水母共附生微生物的功能。
图4 不同pCO2下海月水母螅状体共附生微生物中COG功能基因类别的相对丰度

Fig. 4 Relative abundance of COG functional gene classes in microorganisms associated with A. coerulea polyp under different pCO2

3 讨论

近年来, Biolog-ECO技术凭借其操作简单、周期较短和能获得大量信息的特点, 在研究水母微生物群落功能多样性方面应用广泛(Basso et al, 2019; Stabili et al, 2020)。Basso等(2019)利用Biolog-ECO技术发现水母(Rhizostoma pulmo)的不同部位在细菌丰度、多样性和31种不同碳源的代谢利用方面存在明显差异, 与伞部和口部相比, 黏液分泌物的微生物丰度和代谢潜力值最高。Biolog-ECO技术虽不能确定微生物类群, 但能准确反映微生物群落结构和活性。而宏基因组已广泛应用在珊瑚(Yang et al, 2019; Keller-Costa et al, 2021)、海绵(Slaby et al, 2017; Botté et al, 2019)、藻类(Cavalcanti et al, 2018)等海洋生物的共附生微生物群落结构和功能研究中。随着对全球气候变化的关注, 人们开始利用宏基因组探讨海洋酸化对海洋生物共附生微生物的作用(Botté et al, 2019; Alma et al, 2020)。因此, 本研究利用Biolog-ECO技术和宏基因组方法, 探讨了酸化对海月水母螅状体共附生微生物的群落结构和代谢功能的影响。
Biolog-ECO结果显示, 微生物群落的4种多样性指数H'、J、D和U在酸化条件下差异较小(图1b—e), 说明海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物群落的优势度、均匀度以及多样性等影响较小。宏基因组检测发现, 在门、属、种水平上, 不同处理组的海月水母螅状体共附生微生物的群落组成和PCoA分析均无显著差异(P>0.05), 这表明酸化不会显著改变共附生微生物的群落结构。因此, 结合Biolog-ECO技术和宏基因组检测, 我们推测海洋酸化对海月水母共附生微生物群落产生的影响较小。这与Morrow等(2015)的研究结果一致, 海绵Stylissa massa的微生物群落结构在不同程度的酸化环境(均值pCO2=346μatm, 对照pCO2=624μatm)中基本保持不变, 除蓝藻门和拟杆菌门在高pCO2处有不显著的增加外, 其他门类(变形菌门等)的相对丰度值均降低且与对照组丰度相近。本研究认为, 海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物的群落组成和结构影响较小。
变形菌门(α和γ变形杆菌)、拟杆菌门、柔膜菌门和蓝藻门是在水母微生物组中最常检测到的门类(Tinta et al, 2019)。我们发现柔膜菌门、变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是海月水母螅状体共附生微生物的重要组成门类, 螺原体属、支原体属和沃尔巴克氏体属为主要优势属。基于16S rRNA基因测序发现, 海月水母(A. coerulea)成体的各部位共附生微生物的组成相似, 其中变形杆菌门的相对丰度达82.27%, 是占比最高的门类, 其次是厚壁菌门(Peng et al, 2021)。同样, 变形菌门和厚壁菌门的相对丰度在海月水母(A. aurita)螅状体的共附生微生物组成中占比最高(Weiland-Bräuer et al, 2015), 但这与本研究对照组的结果稍有不同。水母生存环境的差异, 可能是造成其共附生微生物群落结构不同的原因, 在北大西洋采集的海月水母(A. aurita)共附生微生物群落组成中仅含有少量的γ-变形菌门(包括Psychrobacter spp.), 而在北亚得里亚海收集的海月水母(A. aurita)则以γ-变形菌纲[弧菌科(Vibrionaceae)、假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)等]为主(Kos Kramar et al, 2019)。
在本研究中, 螅状体经过42d不同程度酸化胁迫后, 其共附生微生物对糖类、醇类、氨基酸和酸类的利用程度均无显著差异。同样的, 宏基因组测序获得的20项COG功能基因类别的相对丰度, 在不同处理组间均无显著差异。Biolog-ECO技术与宏基因组结果一致, 表明此技术可以应用于研究螅状体共附生微生物的功能。海月水母螅状体的共附生微生物在海洋酸化条件下能够维持相对较稳定的群落结构和功能途径。目前, 我们尚未发现海洋酸化不改变海洋生物共附生微生物群落功能的报道(Cavalcanti et al, 2018; Botté et al, 2019; Alma et al, 2020)。海月水母螅状体共附生微生物能够在酸化环境中维持功能稳定, 可能与宿主有关, 海月水母(A. labiata)作为宿主具有较强适应酸化的能力, 即使在低pH(7.2)环境中也能无性繁殖和存活(Winans et al, 2010)。由于物种对酸化耐受性的不同, 使得海洋生物应对pCO2升高时做出的反应也具有物种特异性(Morrow et al, 2015)。当比较高pCO2地和对照地之间采集的海绵Stylissa flabelliformis微生物功能差异时发现, 在高pCO2地, 微生物对外源碳水化合物和氨基酸的吸收以及对宿主来源的肌酸、肌酐和牛磺酸的降解潜力降低(Botté et al, 2019); 而海绵Coelocarteria singaporensis的微生物群落在高pCO2地表现出较低的碳水化合物吸收潜力, 但古菌和细菌的碳固定能力更强(Botté et al, 2019)。这些代谢特征的改变均可能有助于增强共附生体甚至宿主对海洋酸化的耐受性。因此, 海洋生物在抵抗或适应海洋酸化的过程中, 微生物与宿主关系的稳定性可能在塑造和促进宿主的适应性方面发挥重要作用(Morrow et al, 2015)。我们推测, 未来海洋酸化不会通过改变海月水母共附生微生物群落结构和功能, 来影响螅状体的生长发育。

4 结论

本文利用Biolog-ECO和宏基因组的方法, 探讨了未来海洋酸化(pH 7.8和7.6)对海月水母螅状体共附生微生物群落结构和功能的影响。本实验条件下, 不同程度海水酸化对海月水母螅状体共附生微生物群落结构和功能影响较小。在酸化环境中, 海月水母螅状体能够维持与微生物良好的共附生关系。推测未来海洋酸化可能不会通过改变共附生微生物的群落结构, 来影响海月水母螅状体的生长发育。本研究为深入理解灾害水母的环境适应机制和暴发原因提供了基础信息。

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