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热带海洋学报 >

2024 , Vol. 43 >Issue 2: 128 - 134

DOI: https://doi.org/10.11978/2023080

海洋生物学

海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510次级代谢产物研究

  • 刘颖 , 1 ,
  • 肖阳 1 ,
  • 朱震鑫 2 ,
  • 刘洪存 1 ,
  • 姜明国 2 ,
  • 朱玉章 2 ,
  • 林坤 1 ,
  • 吴金城 1 ,
  • 卢晓梅 1 ,
  • 黄小宁 1 ,
  • 梁海娜 1 ,
  • 卢文森 1 ,
  • 杨立芳 , 1
展开
  • 1.广西民族大学化学化工学院, 林产化学与工程国家民委重点实验室, 广西林产化学与工程重点实验室, 广西林产化学与工程协同创新中心, 广西高校应用分析化学重点实验室, 广西 南宁 530006
  • 2.广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西多糖材料与改性重点实验室, 广西 南宁 530008
杨立芳。email:

刘颖(1997—), 女, 辽宁省凌源市人, 硕士研究生, 从事天然产物研究。email:

Copy editor: 殷波

收稿日期: 2023-06-14

  修回日期: 2023-07-28

  网络出版日期: 2023-08-15

基金资助

国家自然科学基金项目(81960164)

广西科技重大项目(AB21196020)

国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室开放课题项目(KFKT2022-7)

收起

Study on the Secondary Metabolites of Marine Streptomyces Sporoverrucosus 33510

  • LIU Ying , 1 ,
  • XIAO Yang 1 ,
  • ZHU Zhenxin 2 ,
  • LIU Hongcun 1 ,
  • JIANG Mingguo 2 ,
  • ZHU Yuzhang 2 ,
  • LIN Kun 1 ,
  • WU Jincheng 1 ,
  • LU Xiaomei 1 ,
  • HUANG Xiaoning 1 ,
  • LIANG Haina 1 ,
  • LU Wensen 1 ,
  • YANG Lifang , 1
Expand
  • 1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Minzu University, Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, State Ethnic Affairs Commission, Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products, Key Laboratory of Applied Analytical Chemistry (Guangxi Minzu University), Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530006, China
  • 2. Guangxi Key Laboratory of Polysaccharide Materials and Modification, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi Minzu University, Nanning 530008, China
YANG Lifang. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2023-06-14

  Revised date: 2023-07-28

  Online published: 2023-08-15

Supported by

National Natural Science Foundation of China(81960164)

Science and Technology Major Project of Guangxi(AB21196020)

NMPA Key Laboratory for Quality Monitoring and Evaluation of Traditional Chinese Medicine, Chinese Materia Medica(KFKT2022-7)

Fold

摘要

为获得具有较好抑制植物病原菌活性的化合物, 对一株海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510的化学成分及活性进行了研究。使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)、半制备液相色谱(semi-pre HPLC)、柱色谱(colume chromatography, CC)、薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)和重结晶等分析及分离技术对该菌株的发酵产物进行了分离纯化。采用核磁共振(nuclear megnetic resonance, NMR)、质谱(mass spectra, MS)、旋光(optical rotatory dispersion, ORD)等波谱学方法对得到的化合物进行结构鉴定。通过滤纸片法对化合物进行抑菌活性检测。从33510菌株的发酵产物中共分离得到10个化合物, 分别为: cyclo(D-Pro-D-Leu) (1)、bisphenol A (2)、methylp-hydroxyphenylacetate (3)、N-phenethylacetamide (4)、3-indole-methylethanoate (5)、dibutyl phthalate (6)、cyclo(D-Pro-L-Leu) (7)、cyclo(D-Pro-L-Ile) (8)、cyclo(L-Pro-L-Phe) (9)和cyclo(L-Leu-L-Val) (10)。除化合物5和9外, 其他8个化合物均为首次从该菌种中分离得到。抑菌结果表明, 抑菌摩尔浓度为0.19mmol·L-1时, 化合物2对板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的抑制效果为高敏(抑菌直径为20mm)。

关键词： 海洋链霉菌; 次级代谢产物; 抑菌活性

本文引用格式

刘颖 , 肖阳 , 朱震鑫 , 刘洪存 , 姜明国 , 朱玉章 , 林坤 , 吴金城 , 卢晓梅 , 黄小宁 , 梁海娜 , 卢文森 , 杨立芳 . 海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510次级代谢产物研究[J]. 热带海洋学报, 2024 , 43(2) : 128 -134 . DOI: 10.11978/2023080

Abstract

The secondary metabolites of marine actinomycete Streptomyces sporoverrucosus 33510 were studied in order to obtain bioactive compounds. The compounds were separated and purified by column chromatography, semi-preparative liquid chromatography and other chromatographic methods. Ten compounds were identified as cyclo(D-Pro-D-Leu) (1), bisphenol A (2), methylp-hydroxyphenylacetate (3), N-phenethylacetamide (4), 3-indole-methylethanoate (5), dibutyl phthalate (6), cyclo(D-Pro-L-Leu) (7), cyclo(D-Pro-L-Ile) (8), cyclo(L-Pro-L-Phe) (9), and cyclo(L-Leu-L-Val) (10). Eight compounds were isolated from Streptomyces sporoverrucosus for the first time. Compound 2 showed inhibitory activity against Cryphonectria parasitica.

Key words： Streptomyces sporoverrucosus 33510; secondary metabolites; antibacterial activity

链霉菌属放线菌是新化合物的主要来源, 2017年报道了137种代谢物, 其中一半以上来源于海洋链霉属代谢物, 其次是亲缘关系最近的芽孢杆菌、诺卡氏菌和假单胞菌, 分别有14、15和16个新化合物(Carroll et al, 2021)。目前临床应用的抗生素约2/3来源于链霉菌属(Bi et al, 2016)。缪莉等(2023)在一株海洋来源的放线菌达松维尔拟诺卡氏菌JS106的发酵液中分离到6个化合物, 并且证明了菌株JS106可产生丰富的吩嗪类化合物, 且在抗群体感应方面有出色的应用潜力。宋永相等(2023)对深海链霉菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802新型深渊霉素类化合物的生产潜力进行发掘, 得到一个结构新颖的深渊霉素硫醚二聚体化合物ncoabyssomicin H。此化合物对金黄色葡萄球菌和系列临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration, MIC)大于128μg·mL-1。
本研究对多种来源于广西茅尾海红树林根际土壤的放线菌进行抑菌活性的初步筛选, 发现链霉菌属放线菌Streptomyces sporoverrucosus 33510 对多种植物致病菌具有明显的抑制效果, 因此对其次级代谢产物进行分离纯化, 以期获得抑菌活性好的化合物。

1 仪器试剂与材料

1.1 仪器

低温冷却液循环泵(LC-LTC-10/20)(上海力辰邦西仪器科技有限公司); 旋转蒸发仪(N-1300)(上海爱朗仪器有限公司制造); 循环水真空泵(SHZ-Ⅲ)(上海亚荣生化仪器厂); 数显恒温水浴锅(HH-S6) (金坛市医疗仪器厂); 生化培养箱(ZXSD-B1160)(上海智城分析仪器制造有限公司); 超净工作(ZHJH-C1112B)(上海智城分析仪器制造有限公司); 大容量落地式振(MQZ-632)(上海旻泉仪器有限公司); 电子天平(ME204T)(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司); 半制备高效液相色谱仪(SCL-10AVP)(岛津企业管理有限公司); 高效液相色谱仪(LC-10AT)(岛津企业管理有限公司); 核磁共振波谱仪(400MHz Bruker)(布鲁克拜厄斯宾有限公司); 质谱仪(Agilent Infinity Lab LC/MSD) (Agilent公司); 自动旋光仪(WZZ-2SS)(上海申光仪器仪表有限公司); 显微熔点测定仪(X-5)(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试剂

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等有机试剂购自成都市科隆化学品有限公司。柱层析用有机试剂均为分析纯, 液相色谱用有机试剂均为色谱纯。

1.3 材料

正相色谱硅胶: 200~300目、300~400目(青岛海洋化工有限公司); ODS柱色谱填料: YMC Gel ODS-A (烟台正海电子网板股份有限公司); 分析色谱柱: YMC HPLC column, 250×4.6mm, S-5μm, 12nm, AA12S05-2510WT (YMC公司, 日本); 半制备色谱柱: YMC-Pack ODS-A, 250×10mm, S-5μm, 12nm, AA12S05-2510WT (YMC公司, 日本)。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。
种子液培养基: 葡萄糖4g, 酵母粉4g, 麦芽粉2.5g, 复合维生素0.005g, 水1L, pH 7.2。放线菌2号发酵培养基: 葡萄糖20g, 可溶性淀粉10g, 酵母浸膏10g, 蛋白胨10g, 牛肉膏3g, CaCO3 2g, KH2PO4 0.5g, MgSO4 0.5g, 海水1L, pH 7.5~8.0。
放线菌菌株(Streptomyces Sporoverrucosus)取自广西民族大学海洋与生物技术学院的菌种库, 病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、小麦平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica) 、假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum) 源自云南大学云南省微生物研究所及广西农业科学院。

2 方法

2.1 菌种鉴定

使用酶解法提取DNA。经EZbiocloud在线比对, 测序结果表明菌株33510与菌株Streptomyces sporoverrucosus同源性高达99.2%。建立系统发育树如图1。
图1 菌株33510的系统发育树

各分支部分内容依次为菌名、菌株编号和序列号

Fig. 1 Phylogenetic tree of strain 33510

2.2 粗提物的获得

培养基配方见1.3。种子液: 将经固体培养得到的33510菌株接到种子液体培养基中, 摇床培养3d, 28℃, 180r·min-1; 发酵液: 将上述种子液以10%的接种量接到放线菌2号培养基进行发酵, 摇床培养7d, 28℃, 180r·min-1。将批量发酵得到的180L发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次, 减压浓缩萃取液得到24.9g浸膏粗提物。

2.3 次级代谢产物的分离纯化

采取干法装柱、干法上样的方式, 经正相硅胶柱对粗提物进行洗脱分离。以石油醚:乙酸乙酯按照1:0、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、0:1 (v/v)的比例依次洗脱, 每个比例洗脱3份, 共得到27个粗组分。
通过重结晶对第10个粗组分(石油醚:乙酸乙酯=1:1)纯化得到化合物1 (11mg)。经液相分析后, 将物质成分相似的粗组分进行合并, 共得到11个组分Fr.1 ~ Fr.11, 对组分Fr.5、Fr.7、Fr.11进行分离。
组分Fr.5 (1.95g)的分离: 使用反相柱色谱(MeOH:H2O = 20:80 ~ 80:20 (v/v), 3.5mL·min-1)梯度洗脱, 共得到21个亚组分Fr.5.1 ~ Fr.5.21, 经液相分析后合并Fr.5.10与Fr.5.11, 通过半制备高效液相色谱(MeOH:H2O = 70:30 (v/v), 3.5mL·min-1)洗脱得到化合物2 (1.8mg, tR=7.5min, λ=227nm)。
组分Fr.7 (0.65g)的分离: 使用反相柱色谱(MeOH:H2O = 10:90 ~ 80:20 (v/v), 3.5mL·min-1)梯度洗脱, 共得到24个亚组分Fr.7.1 ~ Fr.7.1.24。其中Fr.7.8经液相分析后通过半制备高效液相色谱(MeOH:H2O = 30:70 (v/v), 3.5mL·min-1)洗脱得到化合物3 (4.6mg, tR=29.3min, λ=243nm)和化合物4 (18.7mg, tR=33.5min, λ=243nm)。亚组分Fr.7.11经半制备液相(MeOH:H2O = 50:50 (v/v), 3.5mL·min-1)洗脱制得化合物5 (2.2mg, tR=21.2min, λ=264nm), 亚组分Fr.7.20经半制备液相(MeOH:H2O = 45:55 (v/v), 3.5mL·min-1)制得化合物6 (11mg, tR=22.3min, λ=267nm)。
组分Fr.11 (0.79g)的分离: 通过半制备高效液相色谱(MeOH:H2O = 30:70 (v/v), 3.5mL·min-1)洗脱得到化合物7 (36.2mg, tR=10.2min, λ=190nm)、化合物8 (26.2mg, tR=12.2min, λ=190nm)、化合物9 (13.4mg, tR=12.6min, λ=190nm)和化合物10 (55.2mg, tR =23.4min, λ=190nm)。化合物结构见图2, 色谱填料见1.3部分, 高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)洗脱程序见表1。
图2 化合物1~10的结构

Fig. 2 Chemical structures of compounds 1 ~ 10

表1 HPLC洗脱程序

Tab. 1 HPLC elution procedures

时间/min 甲醇/% 水/%
0.01 10 90
5 10 90
15 100 0
20 100 0
25 10 90

2.4 抑菌活性检测

使用无菌的1mL枪头挑取带有指示菌的琼脂块于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中央, 用无菌竹签挑取试验菌株单菌落(葡萄腔座菌、小麦平脐蠕孢菌、芭蕉炭疽菌、尖刀镰孢菌、假禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、萝卜黑心病菌、板栗疫病菌)分别置于固体培养基表面距指示菌2cm的位置。
使用甲醇-二氯甲烷(体积比1:1)溶解分离得到的化合物, 分别制成浓度为0.19mmol·L-1的样品, 吸取10μL待测样品于直径为8mm的无菌滤纸片上, 将载样滤纸片贴于PDA固体培养基表面(距指示菌2cm位置)。28℃正置培养3d, 观察抑菌情况。阳性对照为酮康唑(0.19mmol·L-1), 空白对照为甲醇-二氯甲烷(体积比1:1)。

3 结果与讨论

3.1 Streptomyces sporoverrucosus 33510的抑菌结果

S. sporoverrucosus 33510的抑菌试验表明其对多种植物致病菌, 如葡萄座腔菌、小麦平脐蠕孢菌和芭蕉炭疽菌有明显的抑制效果(图3), 对尖刀镰孢菌、假禾谷镰刀菌、立枯丝核菌也有明显的抑制效果, 详细结果见表2。
图3 S. sporoverrucosus 33510的抑菌效果

Fig. 3 The antibacterial efficacy of S. sporoverrucosus 33510

表2 S. sporoverrucosus 33510菌株对不同致病菌的抑制结果

Tab. 2 Results of S. sporoverrucosus 33510 strains against different pathogenic bacteria

名称 直径/mm 抑菌效果
Fusarium oxysporum 10 √
Fusarium pseudograminearum 22 √
Colletotrichum musae 16 √
Rhizoctonia solani 18 √
Plectosphaerella cucumerina 0 ×
Cryphonectria parasitica 0 ×
Botryosphaeria dothidea 20 √
Bipolaris sorokiniana 20 √

注: “√”表示抗菌效果明显(d≥10mm), “×”表示无明显抗菌效果(d<10mm)

3.2 单体化合物的结构鉴定

化合物1: 透明片状晶体, 分子式为C11H18N2O2, ESI-MS m/z: 233.43 [M+Na]+, [ α ] D 20 = -141.1° (c 0.35, CH3OH), 熔点为156.8℃。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 4.30~4.22 (m, 1H, H-4), 4.16~4.09 (m, 1H, H-2), 3.56~3.45 (m, 2H, H-5), 2.35~2.25 (m, 1H, H-7a), 2.09~1.81 (m, 5H, H-6, 7b, 8), 1.57~1.45 (m, 1H, H-9), 0.97 (d, J=2.7Hz, 3H, H-10), 0.95 (d, J=2.4Hz, 3H, H-11)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 172.80 (C-1), 168.92 (C-3), 60.28(C-4), 54.62 (C-2), 46.44 (C-5), 39.39 (C-8), 29.07 (C-7), 25.76 (C-9), 23.66 (C-6), 23.30 (C-10), 22.20 (C-11)。经比对, 以上数据与文献(刘涛 等, 2012)报道一致, 确定其为cyclo-(D-Pro-D-Leu)。
化合物2: 深黄色油状物质, 分子式为C15H16O, ESI-MS m/z: 229.4 [M+H]+。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.02 (d, J=8.8Hz, 4H, H-3), 6.66 (d, J=8.8Hz, 4H, H-2), 1.58 (s, 6H, H-6)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 155.98 (C-1), 143.46 (C-4), 128.73 (C-3), 115.52 (C-2), 42.49 (C-5), 31.67 (C-6)。经比对, 以上数据与文献(徐祥彬 等, 2009)报道的bisphenol A一致, 确定其为bisphenol A。
化合物3: 浅黄色油状物质, 分子式为C9H10O3, ESI-MS m/z: 167.3 [M+H]+。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.07 (d, J=8.6Hz, 2H, H-4), 6.72 (d, J=8.7Hz, 2H, H-5), 3.66 (s, 3H, H-7), 3.52 (s, 2H, H-2)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 174.58 (C-1), 157.57 (C-6), 131.30 (C-3), 126.32 (C-4), 116.26 (C-5), 52.37 (C-7), 40.89 (C-2)。经比对, 以上数据与文献(Shin et al, 2003)报道一致, 为已知化合物, 确定其为methylp-hydroxyphenylacetate。
化合物4: 深黄色油状物质, 分子式为C10H13NO, ESI-MS m/z: 164.2 [M+H]+。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.31~7.24 (m, 2H, H-7), 7.23~7.16 (m, 3H, H-6, 8), 3.38 (t, J=7.4Hz, 2H, H-3), 2.78 (t, J=7.5Hz, 2H, H-4), 1.90 (s, 3H, H-1)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 173.24 (C-2), 140.50 (C-5), 129.77 (C-7), 129.48 (C-6), 127.34 (C-8), 42.10 (C-3), 36.48 (C-4), 22.50 (C-1)。经比对, 以上数据与文献(王航航 等, 2018)报道一致, 确定其为N-phenethylacetamide。
化合物5: 黄色油状物质, 分子式为C11H11NO2, ESI-MS m/z: 190.2 [M+H]+。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.51 (dt, J=7.8, 1.1Hz, 1H, H-4), 7.34 (dt, J=8.2, 1.0Hz, 1H, H-7), 7.16 (s, 1H, H-1), 7.10 (ddd, J=8.2, 7.0, 1.3Hz, 1H, H-6), 7.01 (ddd, J=7.9, 7.0, 1.1Hz, 1H, H-5), 3.77 (s, 2H, H-9), 3.68 (s, 3H, H-11)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 174.85 (H-10), 138.02 (H-8), 128.57 (H-3), 124.65 (H-1), 122.48 (H-6), 119.88 (H-5), 119.34 (H-4), 112.26 (H-7), 108.51 (H-2), 52.35 (H-11), 31.86 (H-9)。经比对, 以上数据与文献(吴洪波 等, 2019)报道一致, 确定其为3-indole-methylethanoate。
化合物6: 浅黄色油状物质, 分子式为C16H22O4, ESI-MS m/z: 317.32 [M+K]+。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.72 (dd, J=5.7, 3.3Hz, 2H, H-3), 7.61 (dd, J=5.7, 3.3Hz, 2H, H-4), 4.29 (t, J=6.5Hz, 4H, H-5), 1.75~1.67 (m, 4H, H-6), 1.51~1.40 (m, 4H, H-7), 0.98 (t, J=7.4Hz, 6H, H-8)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 169.30 (C-1), 133.58 (C-2), 132.34 (C-4), 129.87 (C-3), 66.65 (C-5), 31.72 (C-6), 20.25 (C-7), 14.04 (C-8)。经比对, 以上数据与文献(Liu et al, 2018)报道一致, 确定其为dibutyl phthalate。
化合物7: 黄色油状物质, 分子式为C11H18N2O2, ESI-MS m/z: 233.26 [M+Na]+。 [ α ] D 11.5 = -71.1° (c 0.35, CH3Cl)。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 4.26 (dd, J=9.6, 6.4Hz, 1H, H-4), 3.85 (dd, J=9.4, 5.4Hz, 1H, H-2), 3.62~3.45 (m, 2H, H-5), 2.41~2.27 (m, 1H, H-7a), 2.05~1.86 (m, 3H, H-7b), 1.83~1.73 (m, 1H, H-9), 1.71~1.63 (m, 1H, H-8a), 1.61~1.52 (m, 1H, H-8b), 0.98 (2d, J=6.5Hz, 6H, H-10, 11)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 171.63 (C-1), 169.07 (C-3), 59.33 (C-4), 57.09 (C-2), 46.71 (C-5), 43.63 (C-8), 29.91 (C-7), 25.52 (C-9), 23.33 (C-6), 23.06 (C-10), 21.93 (C-11)。经比对, 以上数据与文献(彭坤 等, 2015)报道一致, 确定其为cyclo(D-Pro-L-Leu)。
化合物8: 淡黄色针状晶体, 分子式为C11H18N2O2, ESI-MS m/z: 233.18 [M+Na]+, 熔点为147.8℃。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 4.24 (dd, J=10.1, 6.5Hz, 1H, H-4), 3.68 (d, J=6.3Hz, 1H, H-2), 3.64~3.56 (m, 1H, H-5a), 3.53~3.44 (m, 1H, H-5b), 2.40~2.29 (m, 1H, H-8), 2.05~1.83 (m, 4H, H-6, 7), 1.66~1.54 (m, 1H, H-9a), 1.27~1.16 (m, 1H, H-9b), 1.00 (d, J=6.8Hz, 3H, H-11), 0.95 (t, J=7.4Hz, 3H, H-10)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 171.58 (C-1), 167.91 (C-3), 63.44 (C-4), 59.73 (C-2), 46.75 (C-5), 40.95 (C-8), 30.29 (C-7), 26.03 (C-9), 22.87 (C-6), 15.65 (C-11), 11.60 (C-10)。经比对, 以上数据与文献(Hwang et al, 2017)报道一致, 确定其为cyclo(D-Pro-L-Ile)。
化合物9: 淡黄色油状物质, 分子式为C14H16N2O2, ESI-MS m/z: 267.26 [M+Na]+, [ α ] D 25 = -35.4° (c 0.15, CH3OH)。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 7.36~7.14 (m, 5H, Ar-H), 4.44 (dt, J=5.1, 2.5Hz, 1H, H-2), 4.06 (ddd, J=10.9, 6.4, 2.1Hz, 1H, H-4), 3.57~3.50 (m, 1H, H-5a), 3.40~3.33 (m, 1H, H-5b), 3.17 (dd, J=5.1, 1.9Hz, 2H, H-8), 2.14~2.04 (m, 1H, H-7a), 1.85~1.75 (m, 2H, H-7b, 6a), 1.26~1.14 (m, 1H, H-6b)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 170.92 (C-1), 166.90 (C-3), 137.28 (C-9), 131.05 (C-11), 129.46 (C-10), 128.09 (C-12), 60.06 (C-4), 57.68 (C-2), 45.96 (C-5), 38.24 (C-8), 29.37 (C-7), 22.74 (C-6)。经比对, 以上数据与文献(于鑫 等, 2019)报道一致, 确定其为cyclo(L-Pro-L-Phe)。
化合物10: 淡黄色针状晶体, 分子式为C11H20N2O2, ESI-MS m/z: 213.3 [M+H]+, 熔点为200.9℃。1H NMR (400MHz, Methanol-d4) δH 3.95 (ddd, J=9.0, 4.5, 1.3Hz, 1H, H-4), 3.78 (dd, J=4.4, 1.2Hz, 1H, H-1), 2.28~2.16 (m, 1H, H-9), 1.91~1.81 (m, 1H, H-6), 1.75 (ddd, J=13.4, 9.0, 4.5Hz, 1H, H-5a), 1.61 (ddd, J=13.7, 9.2, 5.1Hz, 1H, H-5b), 1.05 (d, J=7.1Hz, 3H, H-10), 1.00~0.91 (m, 9H, H-7, 8, 11)。13C NMR (101MHz, Methanol-d4) δC 171.28 (C-3), 169.67 (C-1), 61.54 (C-2), 54.37 (C-4), 46.00 (C-5), 33.67 (C-9), 25.29 (C-6), 23.62 (C-7), 21.84 (C-8), 19.31 (C-10), 17.79 (C-11)。经比对, 以上数据与文献报道一致(吴双凤 等, 2020), 确定其为cyclo(L-Leu-L-Val)。

3.3 单体化合物的抑菌活性

如表3所示, 当化合物浓度为0.19mmol·L-1时, 化合物3~6对立枯丝核菌的抑制效果均为耐药(抑菌直径均为0mm); 化合物2、7、9对板栗疫病菌的抑制效果分别为高敏、耐药和耐药(抑菌直径分别为20mm、0mm和0mm); 化合物3、7对假禾谷镰刀菌的抑制效果为耐药和耐药(抑菌直径为0 mm和0 mm)。抑菌圈直径的判定标准见表4 (卢仲铖 等, 2022), 部分结果见图4。
表3 化合物的抑菌结果

Tab. 3 Antibacterial results of the compounds

化合物 抑菌强度 直径/mm 病原菌
2 高敏 20 Cryphonectria parasitica
3 耐药 0 Rhizoctonia solani、Fusarium pseudograminearum
4 耐药 0 Rhizoctonia solani
5 耐药 0 Rhizoctonia solani
6 耐药 0 Rhizoctonia solani
7 耐药 0 Cryphonectria parasitica、Fusarium pseudograminearum
9 耐药 0 Cryphonectria parasitica
表4 抑菌圈直径的判定标准(卢仲铖 等, 2022)

Tab. 4 Evaluation criteria for the diameter of bacteriostatic circles

直径/mm 抑菌性
>20 极敏
15~20 高敏
10~14 中敏
<10 低敏
0 耐药
图4 单体化合物的抑菌活性

阳性对照为酮康唑(0.19mmol·L-1), 空白对照为甲醇-二氯甲烷(体积比1:1)

Fig. 4 The antibacterial activity of compounds. The positive drug was ketoconazole (unit: 0.19 mmol·L-1), the blank control was methanol/dichloromethane

4 结论

本研究对海洋链霉菌Streptomyces sporoverrucosus 33510进行抑菌活性检测, 发现此菌株对葡萄座腔菌、小麦平脐蠕孢菌和芭蕉炭疽菌等多种植物致病菌的菌丝生长有明显的抑制效果。在菌株Streptomyces sporoverrucosus 33510的次级代谢产物中共分离得到10个化合物, 其中8个化合物为首次从该菌中分离得到。抑菌活性试验证明当化合物浓度为0.19mmol·L-1时, 化合物2对板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的抑制效果为高敏(抑菌直径为20mm)。

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