海绵附生真菌Penicillium sp. G5A-11的次级代谢产物研究

梁学诚; 畅文军; 戴好富; 周丽华; 曾艳波

doi:10.11978/2024075

热带海洋学报 >

2025 , Vol. 44 >Issue 2: 73 - 83

DOI: https://doi.org/10.11978/2024075

海洋生物学

海绵附生真菌Penicillium sp. G5A-11的次级代谢产物研究

梁学诚 ^,¹^,² ,
畅文军 ² ,
戴好富 ² ,
周丽华 ^,¹ ,
曾艳波 ^,¹^,²

展开

1.湖南人文科技学院研究生教育教学部, 湖南娄底 417000
2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101

曾艳波。email: zengyanbo@itbb.org.cn;

周丽华。email: zhlihua2008@163.com

梁学诚(1997—), 男, 湖南省郴州市人, 硕士研究生。email: 835923919@qq.com

Copy editor: 殷波 , YIN Bo

收稿日期: 2024-04-03

修回日期: 2024-05-21

网络出版日期: 2024-05-27

基金资助

国家自然科学基金项目(41776093)

农业农村部财政专项(NFZX2021)

湖南省研究生教学平台项目(Xiang Jiao Tong [2019]370)

收起

Secondary metabolites from the sponge-derived fungus Penicillium sp. G5A-11

LIANG Xuecheng ^,¹^,² ,
CHANG Wenjun ² ,
DAI Haofu ² ,
ZHOU Lihua ^,¹ ,
ZENG Yanbo ^,¹^,²

Expand

1. Department of Graduate Education and Teaching, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China
2. Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China

ZENG Yanbo. email: zengyanbo@itbb.org.cn;

ZHOU Lihua. email: zhlihua2008@163.com

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2024-04-03

Revised date: 2024-05-21

Online published: 2024-05-27

Supported by

National Natural Science Foundation of China(41776093)

Financial Fund of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P. R. of China(NFZX2021)

Project of Postgraduate Teaching Platform in Hunan Province(Xiang Jiao Tong [2019]370)

Fold

摘要

文章对南海海绵共附生真菌Penicillium sp. G5A-11的化学成分及其细胞毒活性进行了研究。综合运用薄层色谱、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备型高效液相色谱等多种分离技术对海绵共附生真菌Penicillium sp. G5A-11的大米发酵产物进行分离纯化, 依据波谱数据和理化常数分析并结合相关的文献数据比对, 确定所分离化合物的结构, 并用四唑盐比色(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)法对所鉴定的化合物进行了细胞毒活性测定。结果显示: 从海绵共附生真菌Penicillium sp. G5A-11中共分离鉴定了17个化合物, 其结构分别鉴定为: N-乙酰酪胺 (1)、methyl 2-(6-hydroxybenzothiazol-4-yl) acetate (2)、R-甲羟内酯 (3)、烟酸 (4)、altechromone A (5)、2, 5-dimethy-7-hydroxychromone (6)、methyl 7-hydroxy-2-methylchromone-5-carboxylate (7)、stagonoculiepine [(2S, 5R)-1-formyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-5H-2, 5-epiminobenzo[b]azepin-5-yl acetates] (8)、(4R, 5S)-5-(hydroxymethyl)-5-methyl-4-(3-oxobutyl)dihydrofuran-2(3H)-one (9)、9α-hydroxy-1, 2, 3, 4, 5, 10, 19-heptanorergosta-7, 22-diene-6, 9-lact (10)、3β, 5α, 9α-trihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one (11)、过氧化麦角甾醇 (12)、(22E, 24R)-24-methylcholesta-2, 22-diene-3β, 5α, 6β-triol (13)、麦角甾醇(14)、豆甾醇/β-谷甾醇 (15)、3β, 5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one (16)和3β, 5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7, 22-diene (17)。其中, 化合物7和9为新天然产物。肿瘤细胞毒活性测试结果表明, 化合物10对肿瘤细胞K562 (人慢性髓原白血病细胞)和SGC-7901 (人胃癌细胞)显示出细胞毒活性, 其半数最大抑制浓度值分别为(12.07 ± 0.12)μmol·L^-1和(13.17 ± 0.02)μmol·L^-1。

关键词： 海洋真菌; Penicillium sp.; 化学成分; 细胞毒活性

本文引用格式

梁学诚 , 畅文军 , 戴好富 , 周丽华 , 曾艳波 . 海绵附生真菌Penicillium sp. G5A-11的次级代谢产物研究[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(2) : 73 -83 . DOI: 10.11978/2024075

Abstract

This paper investigated the chemical constituents of Penicillium sp. G5A-11, which was isolated from a sponge in the South China Sea, and their cytotoxicity. Various separation methods, including thin layer chromatography, silica gel column chromatography, gel column chromatography, and semi-preparative high-performance liquid chromatography, were used to isolate compounds from solid-rice culture of this marine derived fungus. Spectroscopic data, along with physical and chemical properties, were utilized to identify the structures of the isolated compounds, and compared with literature data. Their cytotoxic activities were tested by the MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) method. Seventeen compounds were identified from the marine fungus Penicillium jiangxiense, including N-acetyltryptamine (1), methyl 2-(6-hydroxybenzothiazol-4-yl) acetate (2), R-mevalonolactone (3), nicotinic acid (4), altechromone A (5), 2, 5-dimethy-7-hydroxychromone (6), methyl 7-hydroxy-2-methylchromone-5-carboxylate (7), stagonoculiepine [(2S, 5R)-1-formyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-5H-2, 5-epiminobenzo[b]azepin-5-yl acetates] (8), (4R, 5S)-5-(hydroxymethyl)-5-methyl-4-(3-oxobutyl) dihydrofuran-2(3H)-one (9), 9α-hydroxy-1, 2, 3, 4, 5, 10, 19-heptanorergosta-7, 22-diene-6, 9-lact (10), 3β, 5α, 9α-trihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one (11), ergosterol peroxide (5α, 8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6, 22-dien-3β-ol) (12), (22E, 24R)-24-methylcholesta-2, 22-diene-3β, 5α, 6β-triol (13), ergosterol (14), stigmasterol/β-sitosterol (15), 3β, 5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one (16), and 3β, 5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7, 22-diene (17). Among them, compounds 7 and 9 were new natural products. Cytotoxic activity tests showed that compound 10 was moderately cytotoxic to human chronic myeloid leukemia cells (K562) and human gastric cancer cells (SGC-7901) with IC₅₀ values of (12.07 ± 0.12) μmol·L^-1 and (13.17 ± 0.02) μmol·L^-1, respectively. However, the results of the anti-inflammatory activity test revealed that none of the compounds exhibited anti-inflammatory activity.

Key words： marine fungus; Penicillium sp.; chemical constituent; cytotoxicity

海洋来源真菌是海洋天然产物的重要来源。在2016年至2020年期间, 超过33%的新海洋天然产物(约2500种)来源于海洋真菌(Carroll et al, 2022)。由于海洋真菌来源天然产物呈现出结构独特、生物活性良好的特点, 因此人们对该领域的研究越来越深入(Xing et al, 2021; Julianti et al, 2022; Al-Saleem et al, 2022)。尤其在某些情况下, 海洋真菌通过线粒体内含子向海洋生物的水平基因转移与海洋生物形成共生关系, 因此海洋生物共附生真菌的天然产物也表现出共生生物中代谢物的特征(Ding et al, 2011; Pang et al, 2016; Liu et al, 2019)。

Penicillium属真菌是海洋源真菌的重要组成部分, 主要来源于深海沉积物、海绵、红树林和藻类等, 其具有复杂的遗传背景和丰富的次生代谢产物。迄今为止, 已经从海洋源Penicillium 属真菌中鉴定出超过580种新的天然产物, 结构类型涉及哌嗪类(azaphilones)、生物碱类(alkaloids)、萜类(terpenoids)和大环内酯类(macrolides)等, 他们表现出对炎症、细菌、病毒和肿瘤等拮抗活性, 也可为新药研发提供先导化合物(Ma et al, 2016; Yang et al, 2021; Wang et al, 2021; 杨静雨等, 2022)。

本次研究选取南海海绵共附生真菌Penicillium sp. G5A-11为研究对象, 综合运用凝胶色谱、硅胶色谱和半制备高效液相色谱等分离方法, 对海绵共附生真菌Penicillium sp. G5A-11大米发酵产物的乙酸乙酯提取物进行分离与鉴定, 共得到了17个化合物(见图1), 并对这些化合物进行抗肿瘤和抗炎活性测试。测试结果显示, 化合物10对肿瘤细胞K562 (人慢性髓原白血病细胞)和SGC-7901 (人胃癌细胞)显示出细胞毒性, 化合物1—17均无抗炎活性。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图1 化合物1—17的结构

Fig. 1 The chemical structures of compounds 1—17

1 材料与方法

1.1 试验材料

海洋真菌Penicillium sp. G5A-11分离自中国南海海域采集的海绵, 将该菌株送往上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序, 其ITS序列与青霉菌株P. jiangxiense 具有99.6%的同源性, 结合其形态特征将该真菌鉴定为Penicillium sp.。该真菌菌种保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所南海海洋真菌库, 编号为G5A-11。

肿瘤细胞K562、BEL-7402 (肝癌细胞)、SGC-7901、A549 (肺癌细胞)、Hela (宫颈癌细胞)以及RAW 264.7 (小鼠细胞)均采购自中国科学院生命科学研究院的细胞库。

1.2 主要仪器与试剂

仪器: EYELA旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社, 日本), 分析型高效液相色谱仪Agilent 1260 (Agilent, 美国), 半制备高效液相色谱仪(南京元宝峰医药科技公司, 中国), Autospec 300质谱仪(Bruker, 德国), 超净工作台(上海昕仪仪表有限公司, 中国), 超导核磁共振仪AV Ⅲ-500MHz (Bruker, 德国), 600MHz超导核磁共振仪(武汉中科牛津波谱技术有限公司, 中国), MCP 5100旋光仪(Anton Paar, 奥地利), Synergy HT全波长酶标仪(BIO-TEK, 美国), 分析型C₁₈色谱柱(5C₁₈-MS-Ⅱ, 250mm × 4.6mm, 5μm, Code 38020-41)和半制备型C₁₈色谱柱(5C₁₈-MS-Ⅱ, 250mm × 10mm, 5μm, Code 38023-11)(Nacalai Tesque, 日本)。

试剂: 色谱级甲醇(天津康科德科技有限公司, 中国), 三氯甲烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(工业级重蒸)(广东西陇科学有限公司, 中国), 丙酮(分析纯)(广东西陇科学有限公司, 中国), Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(Merck, 德国), 薄层色谱硅胶板GF254和60~80目、200~300目、300~400目柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司, 中国)。

培养基成分配方: 马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基由马铃薯 200.0g、葡萄糖 20.0g、人工海盐 33.0g、琼脂 20.0g和去离子水1000.0mL组成。使用直径150mm培养皿, 每皿加入30mL PDA培养液。马铃薯葡萄糖水(potato dextrose broth, PDB)培养基由马铃薯 200.0g、葡萄糖 20.0g、人工海盐 33.0g和去离子水 1000.0mL组成。使用250mL培养瓶, 每瓶加入100mL PDB培养液。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离

在无菌操作台上切取大小约为1cm³的海绵置于500mL烧杯中, 并加入适量无菌水, 用镊子夹着海绵来回洗涮, 将沥干后的海绵转移至500mL烧杯中(内装有75%酒精), 充分搅拌彻底消毒后取出。将海绵沥干后放入无菌培养皿中。用无菌剪刀剪碎海绵后放入无菌研钵中研磨。将研磨好的样品置于50mL无菌离心管中, 加入1.5倍体积无菌水, 充分振荡混合。取1mL浸出液加入9mL无菌水中稀释, 得到10^-1梯度稀释液, 依次进行10^-2和10^-3的稀释, 在固体培养基中添加0.20~0.25mL浸出液与梯度相应稀释液, 每个浓度下至少3次重复涂布, 用保鲜膜封边, 28℃倒置培养, 定期观察、转接和纯化。

1.3.2 菌株的培养与发酵

从-80℃冰箱取出菌株, 置于室温。蘸取菌液用平板划线法在PDA培养基上涂抹菌液。28℃倒置培养2~3d。得到纯菌落, 配制3瓶250mL PDB培养基, 121℃高压灭菌25min, 冷却至室温后, 接种纯菌落于培养基中, 置于28℃、180r·min^-1环境中震荡培养3d, 最终获取种子液。

准备大米固体培养基(将大米 80g、人工海水120mL加入1L的三角瓶中, 将其封装后进行121℃、20min灭菌处理), 将摇匀的种子液2mL接种到灭菌后的大米固体培养基的三角瓶中, 接种100瓶, 28℃静置培养进行大规模发酵。

1.3.3 化合物的提取与分离

化合物的提取与分离方法如图2所示。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

**图2 海洋真菌Penicillium sp. G5A-11的化学成分提取与分离流程图**

Fig. 2 Flow chart of extraction and isolation of chemical constituents from Penicillium sp. G5A-11

发酵完成后, 在发酵产物中加入乙酸乙酯, 并用玻璃棒将其分成小块, 静置12h, 超声处理, 过滤得到滤液。上述步骤重复3次, 合并滤液, 用旋转蒸发仪减压浓缩, 得到乙酸乙酯提取物(40.9g)。将粗提物与水混合并摇匀, 使粗提物完全分散。依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次。用旋转蒸发仪进行减压浓缩。最终得到石油醚萃取物(27.0g)、乙酸乙酯萃取物(6.9g)和正丁醇萃取物(2.2g)。

将乙酸乙酯萃取物进行减压柱层析, 使用石油醚-乙酸乙酯(100/0 ~ 0/100, V/V)进行梯度洗脱, 共得到10个馏分Fr.1~Fr.10。Fr.3 (737.1mg)以石油醚-氯仿-甲醇(2/1/1, V/V)作为流动相, 经Sephadex LH-20凝胶柱层析, 获得4个馏分(Fr.3.1~Fr.3.4)。Fr.3.2 (404.2mg)以石油醚-乙酸乙酯(20/1 ~ 1/1, V/V)为流动相, 经正向硅胶柱梯度洗脱得到4个馏分(Fr.3.2.1~Fr.3.2.4)。Fr.3.2.2 (127.3mg)以石油醚-乙酸乙酯(50/1, V/V)为流动相, 通过正向硅胶柱洗脱, 获得了馏分Fr.3.2.2.1和化合物14 (8.6mg)。Fr.3.2.2.1 (6.6mg)以石油醚-丙酮(45/1, V/V)为流动相, 通过正向硅胶柱洗脱得到化合物15的混合物(15a和15b, 6.8mg)。Fr.3.2.3 (250.6mg)以二氯甲烷-丙酮(200/1 ~ 10/1, V/V)为流动相, 通过正向硅胶柱梯度洗脱获得Fr.3.2.3.1~Fr.3.2.3.5。Fr.3.2.3.4 (109.5mg)经半制备高效液相色谱(色谱柱: COSMOSIL, 5C₁₈-MS-Ⅱ, 10ID × 250mm), 以88%甲醇-水(V/V)为流动相, 进一步纯化得到化合物17 (4.8mg, 出峰时间22.0min, 流速3mL·min^-1)和化合物16 (2.2mg, 出峰时间15.0min, 流速3mL·min^-1)。Fr.4 (206.1mg)用Sephadex LH-20凝胶柱层析, 以石油醚-氯仿-甲醇(2/1/1, V/V)为流动相, 获得Fr.4.1~Fr.4.4。Fr.4.2 (65.2mg)以石油醚-乙酸乙酯(8/1 ~ 2/1, V/V)为流动相, 经正向硅胶柱梯度洗脱获得Fr.4.2.1~Fr.4.2.7。Fr.4.2.3 (16.5mg)经正向硅胶柱以二氯甲烷-丙酮(400/1, V/V)洗脱得到化合物12 (5.9mg)。Fr.4.2.2 (6.9mg)经半制备高效液相色谱以78%甲醇-水(V/V)为流动相, 制备获得化合物10 (2.3mg, 出峰时间26.5min, 流速3mL·min^-1)。Fr.4.3 (98.1mg)以石油醚-乙酸乙酯(8/1, V/V)为流动相, 经正向硅胶柱洗脱获得Fr.4.3.1~Fr.4.3.4。将Fr.4.3.4 (65.3mg)经半制备高效液相色谱以40%甲醇-水(V/V)为流动相, 制备获得化合物5 (2.2mg, 出峰时间16.5min, 流速3mL·min^-1)。

Fr.5 (63.0mg)用Sephadex LH-20凝胶柱层析以石油醚-氯仿-甲醇(2/1/1, V/V)为流动相, 获得Fr.5.1~ Fr5.5。Fr.5.3 (20.8mg)以二氯甲烷-甲醇(100/1, V/V)作为的流动相经正向硅胶柱洗脱获得Fr.5.3.1~ Fr.5.3.3。Fr.5.3.1 (8.2mg)使用半制备高效液相色谱法, 以20%乙腈-水(V/V)为流动相制备得到化合物6 (1.8mg, 出峰时间12.5min, 流速3mL·min^-1)。Fr.5.3.2 (5.9mg)以石油醚-乙酸乙酯(2/1, V/V)作为流动相, 经正向硅胶柱洗脱得到化合物9 (3.9mg)。

Fr.6 (680.8mg)用Sephadex LH-20凝胶柱层析以氯仿-甲醇(1/1, V/V)作为的流动相, 得到6个馏分(Fr.6.1~Fr.6.6)。 Fr.6.3 (393.0mg)以石油醚-二氯甲烷(1/1, V/V)和石油醚-乙酸乙酯(1/1, V/V)作为流动相经正向硅胶柱梯度洗脱获得Fr.6.3.1~Fr.6.3.10。Fr.6.3.6 (73.9mg)进一步纯化得到Fr.6.3.6.1~Fr.6.3.6.4。Fr.6.3.6.1 (39.4mg)以38%甲醇-水(V/V)作为流动相, 使用半制备高效液相色谱法制备得化合物7 (3.8mg, 出峰时间9.5min, 流速3mL·min^-1)。Fr.6.3.6.3 (6.5mg)以38%甲醇-水(V/V)为流动相, 使用半制备高效液相色谱法制备得到化合物11 (1.9mg, 出峰时间13.5min, 流速3mL·min^-1)。Fr.6.5 (51.0mg)以二氯甲烷-甲醇(80/1, V/V)为流动相, 经正向硅胶柱洗脱得到Fr.6.5.1~Fr.6.5.5。Fr.6.5.5 (19.3mg)进一步纯化得到Fr.6.5.5.1~Fr.6.5.5.4。Fr.6.5.5.2 (10.0mg)以29%甲醇-酸水(酸水相为0.01%三氟乙酸水溶液)(V/V)为流动相经半制备高效液相色谱获得化合物4 (2.5mg, 出峰时间4.5min, 流速3mL·min^-1)和化合物2 (1.3mg, 出峰时间10.5min, 流速3mL·min^-1)。

Fr.7 (1251.2mg)用Sephadex LH-20凝胶柱层析以(2/1/1, V/V)的石油醚-氯仿-甲醇为流动相, 得到Fr.7.1~Fr.7.12。Fr.7.8以二氯甲烷-甲醇(150/1, V/V)为流动相经正向硅胶柱洗脱获得化合物1 (18.2mg)。Fr.7.3 (91.7mg)经正向硅胶柱层析, 以二氯甲烷-甲醇(40/1, V/V)为流动相洗脱得到化合物13 (26.1mg)。Fr.7.6 (213.6mg)以二氯甲烷-甲醇(100/1, V/V)为流动相, 经正向硅胶柱洗脱获得Fr.7.6.1~Fr.7.6.5。Fr7.6.2 (53.7mg)经半制备高效液相色谱, 以15%甲醇-水(V/V)为流动相制备获得化合物3 (14.7mg, 出峰时间6.5min, 流速3mL·min^-1)。

Fr.8 (710.7mg)用Sephadex LH-20凝胶柱层析以100%甲醇为流动相, 得到Fr.8.1~Fr.8.8。Fr.8.1 (422.3mg)用正向硅胶柱层析, 以二氯甲烷-甲醇(60/1 ~ 30/1, V/V)为流动相梯度洗脱, 得到Fr.8.1.1~Fr.8.1.7。Fr.8.1.3 (23.3mg)通过半制备高效液相色谱法, 以25%甲醇-水(V/V)作为流动相制备, 获得化合物8 (2.5mg, 出峰时间16.5min, 流速3mL·min^-1)。

1.3.4 肿瘤细胞毒活性测试方法

通过四唑盐(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 比色法(吴旭东等, 2011), 测试了化合物1~17对肿瘤细胞K562、BEL-7402、SGC-7901、A549和Hela的体外细胞毒活性。试验设置包括阴性对照组[二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶剂]、阳性对照组(顺铂)和6个不同质量浓度的待测样品(0.2、0.6、1.8、5.4、16.2、48.6μg·mL^-1), 每个浓度设有3个平行试验。

首先, 制作浓度约5×10⁴个·mL^-1的肿瘤细胞单细胞悬液, 接着, 将96孔板(内装有100μL细胞悬液)放在37℃、5% CO₂、湿度大于90%的恒定环境下, 培育24h。向培养后的96孔板每个孔中加入10μL待测样品溶液, 并继续在相同的条件下培养72h。制备浓度为5mg·mL^-1的MTT溶液并在每个孔中加入15μL, 恒温环境下孵育4h。之后, 将上层清液吸走, 每个孔中注入100μL DMSO溶液使沉淀完全溶解。最后, 在490nm波长下使用酶标仪测量吸光度(A), 并计算出了肿瘤细胞生长抑制率(单位: %)和半数最大抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀)。

肿瘤细胞生长抑制率计算公式:

(1)生长抑制率=(1-C₀/C₁)×100%

式中: C₀=A_平均 - Α_样品; C₁=A_平均 - Α_阴性。

1.3.5 抗炎活性测试方法

抗炎活性测试方法参考前期的文献报道的方法(胡梦君, 2017)进行测试, 具体方法如下。

使用MTT法对化合物进行初筛, 选择小鼠细胞RAW 264.7进行试验, 方法与做细胞毒活性的方法相同, 使用盐酸阿霉素作为阳性对照。最后, 在490nm波长处对每个孔的光密度(optical density, OD)进行测量。

细胞生长抑制率(单位: %)计算公式:

(2)抑制率= (1-OD / OD₀)×100%

式中: OD₀表示测得的空白组在490nm波长下的吸光值, OD表示试验组在同一波长下的吸光值。

将待测化合物进行倍比梯度稀释后, 按照上述步骤测定各浓度下的细胞生长抑制率。通过GraphPad Prism软件进行数据处理, 可以获取化合物的IC₅₀值。初筛确保在对细胞增殖无抑制作用的情况下进行下一步检测。检测过程中, 使用小鼠细胞RAW 264.7, 空白组使用含有脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的培养基, 对照组使用槲皮素, 阴性对照组使用DMSO。试验组则加入了单体化合物。通过酶标仪在540nm波长对每组进行3次平行测定, 计算一氧化氮(nitric oxide, NO)抑制率。对初筛活性良好的化合物进行5次倍比梯度稀释, 并分别计算其抑制率(单位: %)和IC₅₀值(单位: μmol·L^-1), 即抑制率为50%时对应的化合物的浓度。

(3)抑制率= (B₂-B₁) / (B₂-B₀)×100%

式中: B₀、B₁、B₂分别代表在540nm波长下空白组的吸光度(不含LPS)、试验组的吸光度、阴性组的吸光度(含LPS)。

2 试验结果

2.1 结构鉴定

化合物1: 黄色油状, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈橙黄色; 分子式为C₁₂H₁₄N₂O, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 225.0994 [M+Na]⁺ (计算值为225.0998)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 1.91 (3H, s, H-14), 2.96 (2H, t, J=6.8Hz, H-10), 3.58 (2H, q, J=6.5Hz, H-11), 5.72 (1H, br s, H-12), 7.00 (1H, d, J=2.3Hz, H-2), 7.12 (1H, m, H-5), 7.20 (1H, m, H-6), 7.37 (1H, d, J=8.1Hz, H-7), 7.59 (1H, d, J=7.8Hz, H-4), 8.51 (1H, br s, H-1); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 23.4 (C-14), 25.3 (C-10), 40.0 (C-11), 111.5 (C-7), 112.9 (C-3), 118.7 (C-4), 119.5 (C-5), 122.2 (C-2), 122.3 (C-6), 127.5 (C-9), 136.6 (C-8), 170.4 (C-13)。以上波谱数据与文献(Li et al, 2003)报道基本一致, 故鉴定化合物1为N-acetyltryptamine (N-乙酰酪胺)。

化合物2: 无色油状, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)无颜色; 分子式为C₁₀H₉NO₃S, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 246.0195 [M+Na]⁺ (计算值为246.0195)。¹H NMR (600MHz, CD₃OD) δ_H: 3.69 (3H, s, H-10), 4.09 (2H, s, H-1), 6.95 (1H, d, J=2.3Hz, H-5), 7.28 (1H, d, J=2.1Hz, H-7), 8.92 (1H, s, H-2); ¹³C NMR (150MHz, CD₃OD) δ_C: 38.4 (C-1), 52.5 (C-10), 106.4 (C-7), 118.2 (C-5), 131.5 (C-4), 136.6 (C-8), 147.4 (C-3), 152.5 (C-2), 157.2 (C-6), 172.3 (C-9)。以上波谱数据与文献(Chen et al, 2018)报道基本一致, 故鉴定化合物2为methyl 2-(6-hydroxybenzothiazol-4-yl) acetate。

化合物3: 无色油状, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈粉红色; 分子式为C₆H₁₀O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 283.1150 [2M+Na]⁺ (计算值为283.1152);

[α] D 25

-17.5° (c 0.1, 乙醇)。¹H NMR (500MHz, CD₃OD) δ_H: 1.33 (3H, s, H-6), 1.84 (1H, m, H-4a), 1.98 (1H, m, H-4b), 2.54 (1H, d, J=17.4Hz, H-2a), 2.60 (1H, d, J= 17.2Hz, H-2b), 4.37 (1H, dt, J=10.3, 4.5Hz, H-5a), 4.55 (1H, td, J=10.9, 4.1Hz, H-5b); ¹³C NMR (125MHz, CD₃OD) δ_C: 29.4 (C-6), 36.4 (C-4), 45.0 (C-2), 67.6 (C-5), 68.5 (C-3), 173.7 (C-1)。以上波谱数据与文献(Amagata et al, 1998)报道基本一致, 故鉴定化合物3为R-mevalonolactone (R-甲羟内酯)。

化合物4: 白色粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)无颜色; 分子式为C₆H₅NO₂, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 124.0393 [M+H]⁺ (计算值为124.0393)。¹H NMR (500MHz, CD₃OD) δ_H: 7.57 (1H, dd, J=7.7, 5.0Hz, H-5), 8.41 (1H, d, J=7.9Hz, H-4), 8.74 (1H, br d, J=3.0Hz, H-6), 9.13 (1H, br s, H-2); ¹³C NMR (125MHz, CD₃OD) δ_C: 125.2 (C-5), 128.8 (C-3), 139.2 (C-4), 151.3 (C-2), 153.6 (C-6), 167.8 (C-7)。以上波谱数据与文献(马宏宇等, 2010)报道基本一致, 故鉴定化合物4为nicotinic acid (烟酸)。

化合物5: 白色粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)无颜色; 分子式为C₁₁H₁₀O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 213.0522 [M+Na]⁺ (计算值为213.0522)。¹H NMR (500MHz, CD₃OD) δ_H: 2.31 (3H, s, H-9), 2.70 (3H, s, H-10), 5.99 (1H, s, H-3), 6.62 (1H, d, J=2.0Hz, H-8), 6.63 (1H, d, J=2.0Hz, H-6); ¹³C NMR (125MHz, CD₃OD) δ_C: 19.8 (C-9), 23.1 (C-10), 101.7 (C-8), 111.4 (C-4a), 115.6 (C-3), 118.0 (C-6), 143.6 (C-7), 161.5 (C-8a), 163.1 (C-5), 166.6 (C-2), 182.0 (C-4)。以上波谱数据与文献(张莎等, 2022)报道基本一致, 故鉴定化合物5为altechromone A。

化合物6: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)无颜色; 分子式为C₁₁H₁₀O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 213.0516 [M+Na]⁺ (计算值为213.0522)。¹H NMR (600MHz, CD₃OD) δ_H: 2.32 (3H, s, H-9), 2.72 (3H, s, H-10), 6.01 (1H, s, H-3), 6.63 (1H, br s, H-6), 6.64 (1H, br s, H-8); ¹³C NMR (150MHz, CD₃OD) δ_C: 19.8 (C-9), 23.1 (C-10), 101.6 (C-8), 111.4 (C-3), 115.6 (C-4a), 118.0 (C-6), 143.7 (C-5), 161.5 (C-8a), 163.1 (C-7), 166.6 (C-2), 182.0 (C-4)。以上波谱数据与文献(Phaopongthai et al, 2013)报道基本一致, 故鉴定化合物6为2, 5-dimethy-7-hydroxychromone。

化合物7: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)无颜色; 分子式为C₁₂H₁₀O₅, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 491.0961 [2M+Na]⁺ (计算值为491.0949)。¹H NMR (500MHz, CD₃OD) δ_H: 2.38 (3H, s, H-10), 3.90 (3H, s, H-12), 6.09 (3H, s, H-2), 6.77 (1H, d, J=2.2Hz, H-6), 6.87 (1H, t, J=2.5Hz, H-8); ¹³C NMR (125MHz, CD₃OD) δ_C: 20.2 (C-10), 53.3 (C-12), 104.6 (C-8), 110.4 (C-2), 113.7 (C-4), 114.9 (C-6), 135.9 (C-5), 159.9 (C-9), 164.5 (C-7), 168.5 (C-1), 171.5 (C-11), 178.5 (C-3)。HMBC谱中H-2与C-10、C-4、C-1、C-5 (弱)和C-3 (弱)之间存在相关信号, H-8与C-6、C-9、C-7和C-3 (弱)之间存在相关信号, H-6与C-11、C-7 (弱)、C-4、C-8之间存在相关信号, H-12与C-11和C-5 (弱)之间存在相关信号, H-10与C-2、C-1之间存在相关信号, 结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT (distortionless enhancement by polarization transfer, 无畸变极化转移增益)及HSQC (heteronuclear single quantum connectivity, 异核单量子相关)等核磁谱图数据得到其分子式和结构式, 通过文献检索发现此化合物结构只在Mody等(1951)的报道中合成过, 但未见其核磁数据, 本文首次对其核磁数据进行报道, 且为新的天然产物, 故鉴定化合物7为methyl 7-hydroxy-2-methylchromone-5-carboxylate。

化合物8: 白色粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈灰色; 分子式为C₁₃H₁₄N₂O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 269.0893 [M+Na]⁺ (计算值为269.0897);

[α] D 25

-34.9° (c 0.1, CH₃OH)。¹H NMR (500MHz, CD₃OD) δ_H: 2.09 (3H, s, H-14), 2.53 (2H, m, H-3), 3.12 (1H, dt, J=11.4, 6.3Hz, H-4a), 3.88 (1H, ddd, J=11.0, 7.8, 1.6Hz, H-4b), 5.83 (1H, br s, H-2), 7.25 (1H, t, J= 7.5Hz, H-7), 7.39 (1H, td, J=8.0, 1.1Hz, H-8), 7.52 (1H, d, J=7.2Hz, H-6), 7.96 (1H, d, J=8.0Hz, H-9), 8.97 (1H, br s, H-12); ¹³C NMR (125MHz, CD₃OD) δ_C: 22.1 (C-14), 37.7 (C-3), 48.1 (C-4), 81.6 (C-2), 86.5 (C-5), 118.1 (C-9), 125.3 (C-6), 126.8 (C-7), 131.3 (C-8), 134.7 (C-10), 142.5 (C-11), 164.7 (C-12), 173.4 (C-13)。以上波谱数据与文献(Yu et al, 2017)报道基本一致, 故鉴定化合物8为stagonoculiepine [(2S, 5R)-1-formyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-5H-2, 5-epiminobenzo[b] azepin-5-yl acetates], 该化合物首次从青霉属真菌分离到。

化合物9: 无色油状, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈棕色; 分子式为C₁₀H₁₆O₄, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 423.1980 [2M+Na]⁺ (计算值为423.1989);

[α] D 25

+22.0° (c 0.1, CHCl₃)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 1.35 (3H, s, H-1°°°), 1.85 (2H, m, H-1°), 2.17 (3H, s, H-4°), 2.27 (1H, m, H-4), 2.48 (2H, m, H-2°), 2.55 (2H, m, H-3), 3.70 (1H, d, J=12.3Hz, H-1°°b), 3.76 (1H, d, J= 12.3Hz, H-1°°a); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 22.6 (C-1°°°), 22.9 (C-1°), 30.2 (C-4°), 36.0 (C-3), 42.2 (C-2°), 44.7 (C-4), 66.5 (C-1°°), 88.0 (C-5), 176.5 (C-2), 207.6 (C-3°)。以上波谱数据与文献(Rodilla et al, 2016)报道基本一致, 再结合NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy, 核欧佛豪瑟效应频谱)谱图确定其相对构型, 故鉴定化合物9为(4R, 5S)-5-(hydroxymethyl)-5-methyl-4-(3-oxobutyl) dihydrofuran-2(3H)-one, 为新天然产物。

化合物10: 无色油状, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈紫色; 分子式为C₂₁H₃₂O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 355.2242 [M+Na]⁺ (计算值为355.2244);

[α] D 25

+102.9° (c 0.1, CH₃Cl₃)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.61 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=6.9Hz, H-26), 0.84 (3H, d, J=6.9Hz, H-27), 0.92 (3H, d, J=6.8Hz, H-28), 1.04 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 1.63 (1H, dt, J= 13.5, 4.2Hz, H-12a), 1.87 (1H, m, H-12b), 1.98 (1H, ddd, J=13.3, 4.7, 2.4Hz, H-11a), 2.28 (1H, ddd, J=14.2, 4.2, 2.4Hz, H-11b), 2.65 (1H, ddd, J=11.9, 6.8, 1.9Hz, H-14), 5.17 (1H, dd, J=15.3, 8.4Hz, H-22), 5.26 (1H, dd, J= 15.3, 7.7Hz, H-23), 5.64 (1H, d, J=1.8Hz, H-7); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 11.9 (C-18), 17.8 (C-28), 19.8 (C-27), 20.1 (C-26), 21.2 (C-21), 21.5 (C-15), 29.0 (C-16), 33.2 (C-25), 35.2 (C-11), 35.4 (C-12), 40.3 (C-20), 43.0 (C-24), 49.0 (C-13), 50.5 (C-14), 55.5 (C-17), 104.9 (C-9), 112.4 (C-7), 133.0 (C-23), 134.8 (C-22), 170.7 (C-6), 171.0 (C-8)。以上波谱数据与文献(Ohta et al, 1996)报道基本一致, 故鉴定化合物10为9α-hydroxy-1, 2, 3, 4, 5, 10, 19-heptanorergosta-7, 22-diene-6, 9-lact。

化合物11: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈红色; 分子式为C₂₈H₄₄O₄, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 467.3114 [M+Na]⁺ (计算值为467.3132);

[α] D 25

-13.5° (c 0.1, CH₃OH)。¹H NMR (600MHz, CD₃OD) δ_H: 0.67 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, d, J=6.7Hz, H-26), 0.87 (3H, d, J=6.8Hz, H-27), 0.95 (3H, d, J=6.9Hz, H-28), 1.00 (3H, s, H-19), 1.06 (3H, d, J= 6.6Hz, H-21), 3.94 (1H, m, H-3), 5.22 (1H, dd, J=15.3, 8.1Hz, H-22), 5.27 (1H, dd, J=15.3, 7.5Hz, H-23), 5.59 (1H, d, J=2.1Hz, H-7); ¹³C NMR (150MHz, CD₃OD) δ_C: 12.6 (C-18), 18.2 (C-28), 20.1 (C-27), 20.4 (C-26), 20.6 (C-19), 21.6 (C-21), 23.4 (C-15), 26.6 (C-1), 29.1 (C-16), 29.3 (C-11), 31.0 (C-2), 34.4 (C-25), 36.2 (C-12), 37.2 (C-4), 41.7 (C-20), 42.8 (C-10), 44.4 (C-24), 46.2 (C-13), 52.8 (C-14), 57.4 (C-17), 67.8 (C-3), 76.2 (C-9), 80.2 (C-5), 120.9 (C-7), 133.6 (C-23), 136.7 (C-22), 165.0 (C-8), 200.1 (C-6)。以上波谱数据与文献(韩秀丽等, 2009)报道基本一致, 故鉴定化合物11是3β, 5α, 9α-trihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one。

化合物12: 白色粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈蓝色; 分子式为C₂₈H₄₄O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 451.3182 [M+Na]⁺ (计算值为451.3183);

[α] D 25

-27.9° (c 0.1, CHCl₃)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.81 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=7.0Hz, H-26), 0.83 (3H, d, J=7.0Hz, H-27), 0.88 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, d, J=6.8Hz, H-28), 0.99 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 3.97 (1H, m, H-3), 5.14 (1H, dd, J=15.3, 8.3Hz, H-23), 5.22 (1H, dd, J=15.3, 7.6Hz, H-22), 6.24 (1H, d, J=8.5Hz, H-6), 6.50 (1H, d, J=8.5Hz, H-7); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 13.0 (C-18), 17.7 (C-28), 18.3 (C-19), 19.8 (C-21), 20.1 (C-26), 20.8 (C-11), 21.0 (C-27), 23.6 (C-15), 28.8 (C-4), 29.9 (C-16), 30.3 (C-2), 33.2 (C-25), 34.8 (C-1), 37.1 (C-10), 39.5 (C-12), 39.9 (C-20), 42.9 (C-24), 44.7 (C-13), 51.2 (C-9), 51.8 (C-14), 56.4 (C-17), 66.6 (C-3), 79.6 (C-8), 82.3 (C-5), 130.9 (C-7), 132.5 (C-23), 135.3 (C-22), 135.6 (C-6)。以上波谱数据与文献(Nam et al, 2001)报道基本一致, 故鉴定化合物12为ergosterol peroxide (5α, 8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6, 22-dien-3β-ol) (过氧化麦角甾醇)。

化合物13: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈蓝色; 分子式为C₂₈H₄₆O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 453.3323 [M+Na]⁺ (计算值为453.3339);

[α] D 25

-69.5° (c 0.1, pyridine)。¹H NMR (500MHz, DMSO-d₆) δ_H: 0.55 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, d, J=6.9Hz, H-27), 0.83 (3H, d, J=6.9Hz, H-26), 0.89 (3H, d, J=6.5Hz, H-28), 0.90 (3H, s, H-19), 0.99 (3H, d, J= 6.5Hz, H-21), 3.61 (1H, br s, H-6), 3.77 (1H, m, H-3), 5.17 (1H, dd, J=16.0, 8.0Hz, H-22), 5.22 (1H, dd, J= 15.2, 7.1Hz, H-23); ¹³C NMR (125MHz, DMSO-d₆) δ_C: 12.1 (C-18), 17.3 (C-28), 17.7 (C-19), 19.5 (C-27), 19.8 (C-26), 21.0 (C-21), 21.4 (C-11), 22.6 (C-15), 27.8 (C-16), 31.2 (C-1), 32.5 (C-2), 32.5 (C-25), 36.7 (C-10), 40.0 (C-20), 40.2 (C-4), 42.1 (C-24), 42.3 (C-9), 43.0 (C-13), 54.2 (C-14), 55.4 (C-17), 66.0 (C-3), 72.2 (C-6), 74.5 (C-5), 119.5 (C-7), 131.4 (C-23), 135.4 (C-22), 139.7 (C-8)。以上波谱数据与文献(Piccialli et al, 1987)的报道基本一致, 故化合物13鉴定为(22E, 24R)-24-methylcholesta-2, 22-diene-3β, 5α, 6β-triol。

化合物14: 白色粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈灰色; 分子式为C₂₈H₄₄O, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 419.3278 [M+Na]⁺ (计算值为419.3284);

[α] D 25

-42.9° (c 0.1, CH₃Cl₃)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.63 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=7.1Hz, H-26), 0.84 (3H, d, J=8.6Hz, H-27), 0.91 (3H, d, J=6.9Hz, H-28), 0.94 (3H, s, H-19), 1.03 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 5.22 (1H, dd, J=15.2, 7.3Hz, H-23), 5.38 (1H, m, H-7), 5.57 (1H, d, J=5.1Hz, H-6); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 12.2 (C-18), 16.4 (C-19), 17.8 (C-28), 19.8 (C-26), 20.1 (C-27), 21.3 (C-11), 21.3 (C-21), 23.1 (C-15), 28.4 (C-16), 32.2 (C-2), 33.3 (C-25), 37.2 (C-10), 38.5 (C-1), 39.2 (C-12), 40.6 (C-20), 41.0 (C-4), 43.0 (C-24), 43.0 (C-13), 46.4 (C-9), 54.7 (C-14), 55.9 (C-17), 70.6 (C-3), 116.4 (C-7), 119.7 (C-6), 132.1 (C-23), 135.7 (C-22), 139.9 (C-5), 141.5 (C-8)。以上波谱数据与文献(安熙强等, 2011)报道基本一致, 故鉴定化合物14为ergosterol (麦角甾醇)。

化合物15: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈粉色; 分子式为C₂₉H₅₀O /C₂₉H₄₈O, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 437.3745/435.3535 [M+Na]⁺ (计算值为437.3754/435.3544)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.70 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, s, H-26), 1.03 (3H, s, H-21), 3.52 (1H, m, H-3), 5.02 (1H, dd, J=15.1, 8.7Hz, H-23), 5.15 (1H, dd, J=15.1, 8.7Hz, H-22), 5.35 (1H, m, H-6); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 12.0/12.2 (C-18), 12.4/12.2 (C-29), 19.1/19.2 (C-27), 19.6 (C-19), 21.3/18.9 (C-21), 21.4 (C-11), 21.5/20.0 (C-26), 24.5/24.4 (C-15), 25.6/23.2 (C-28), 29.0/28.4 (C-16), 31.8/31.6 (C-7), 32.0 (C-2), 32.0/29.3 (C-25), 32.0 (C-8), 36.6 (C-10), 37.4 (C-1), 39.8/39.9 (C-12), 40.6/36.3 (C-20), 42.3 (C-13), 42.4/42.5 (C-4), 50.3 (C-9), 51.4/46.0 (C-24), 56.1/56.2 (C-15), 56.9/57.0 (C-14), 72.0 (C-3), 121.9 (C-6), 129.4/26.3 (C-23), 138.5/34.1 (C-22), 140.9 (C-5)。以上波谱数据与文献(Govindan et al, 2019)报道基本一致, 故鉴定化合物15为stigmasterol/β-sitosterol (豆甾醇/β-谷甾醇)。

化合物16: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈棕黄色; 分子式为C₂₈H₄₄O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 451.3183 [M+Na]⁺ (计算值为451.3183);

[α] D 25

-9.0° (c 0.1, EtOH)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.60 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=6.8Hz, H-26), 0.84 (3H, d, J=6.7Hz, H-27), 0.91 (3H, d, J=6.9Hz, H-19), 1.03 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 2.52 (1H, m, H-6), 4.03 (1H, m, H-3), 5.16 (1H, dd, J=15.3, 8.3Hz, H-22), 5.24 (1H, dd, J=15.3, 7.6Hz, H-23), 5.65 (1H, br s, H-7); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 12.9 (C-18), 16.6 (C-28), 17.7 (C-19), 19.8 (C-27), 20.1 (C-26), 21.3 (C-21), 22.1 (C-15), 22.6 (C-11), 28.0 (C-16), 30.4 (C-1), 30.5 (C-2), 33.2 (C-25), 36.7 (C-10), 39.0 (C-4), 40.4 (C-12), 40.6 (C-20), 43.0 (C-24), 44.0 (C-13), 45.0 (C-9), 56.0 (C-14), 56.2 (C-17), 67.6 (C-3), 78.0 (C-5), 119.9 (C-7), 132.7 (C-23), 135.2 (C-22), 165.4 (C-8), 198.4 (C-6)。以上波谱数据与文献(Fangkrathok et al, 2013)报道基本一致, 故鉴定化合物16是3β, 5α-dihydroxy-(22E, 24R)-ergosta-7, 22-dien-6-one。

化合物17: 白色无定型粉末, 薄层层析(显色剂为10%硫酸-乙醇, V/V)呈蓝色; 分子式为C₂₉H₄₈O₃, 经HR-ESI-MS分析得 m/z 467.3496 [M+Na]⁺ (计算值为467.3496);

[α] D 25

-73.9° (c 0.1, CHCl₃)。¹H NMR (500MHz, CDCl₃) δ_H: 0.59 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, d, J=7.2Hz, H-27), 0.84 (3H, d, J=7.3Hz, H-26), 1.00 (3H, s, H-19), 1.02 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 3.17 (1H, d, J=4.9Hz, H-6), 3.39 (3H, s, H-OMe), 4.05 (1H, m, H-3), 5.16 (1H, dd, J=15.3, 8.0Hz, H-22), 5.22 (1H, dd, J=15.3, 7.3Hz, H-23), 5.40 (1H, m, H-7), 1.24~1.28 (1H, m, H-17),1.27~1.36 (2H, m, H-12), 1.27~1.31 (1H, m, H-16a), 1.40~1.50 (1H, m, H-2a), 1.44~1.50 (1H, m, H-25), 1.51~1.61 (2H, m, H-11), 1.51~1.62 (2H, m, H-1), 1.67~1.80 (1H, m, H-16b), 1.68~1.79 (2H, m, H-4), 1.81~1.89 (1H, m, H-24), 1.81~1.89 (1H, m, H-2b), 1.86~1.93 (1H, m, H-9), 1.89~1.93 (1H, m, H-14), 1.98~2.08 (1H, m, H-20); ¹³C NMR (125MHz, CDCl₃) δ_C: 12.5 (C-18), 17.8 (C-28), 18.5 (C-19), 19.8 (C-27), 20.1 (C-26), 21.3 (C-21), 22.3 (C-11), 23.0 (C-15), 28.1 (C-16), 31.0 (C-2), 32.9 (C-1), 33.2 (C-25), 37.4 (C-10), 39.5 (C-12), 39.8 (C-4), 40.6 (C-20), 43.0 (C-24), 44.0 (C-13), 44.0 (C-9), 55.1 (C-14), 56.1 (C-17), 58.5 (C-OMe), 68.0 (C-3), 76.5 (C-5), 82.6 (C-6), 115.1 (C-7), 132.3 (C-23), 135.6 (C-22), 143.8 (C-8)。以上波谱数据与文献(Kawagishi et al, 1988)报道基本一致, 故鉴定化合物17是3β, 5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7, 22-diene。

2.2 活性测试结果

本研究对化合物1—17进行了肿瘤细胞毒性和炎症抗性检测。使用MTT法评估它们对肿瘤细胞K562、BEL-7402、SGC-7901、A549和Hela的细胞毒活性。研究结果显示, 针对这5种细胞, 化合物10和14具有不同程度的毒性, 其IC₅₀值如表1所示。其中, 化合物10的对K562细胞和SGC-7901细胞表现出中等水平的细胞毒活性, IC₅₀值分别为(12.07 ± 0.12)μmol·L^-1和(13.17 ± 0.02)μmol·L^-1, 阳性对照顺铂的IC₅₀分别为(3.08 ± 0.05)μmol·L^-1和(4.11 ± 0.02)μmol·L^-1, 其他化合物均未显示出细胞毒活性。

表1 化合物10和14对于5种肿瘤细胞的细胞毒活性测试结果

Tab. 1 The cytotoxic activities of compounds 10 and 14 on five tumor cells

化合物	(IC₅₀ ± SD)/(μmol·L^-1)^a
化合物	K562	BEL-7402	SGC-7901	A549	Hela
10	12.07 ± 0.12	15.81 ± 0.26	13.17 ± 0.02	14.59 ± 0.03	20.92 ± 0.06
14	23.77 ± 0.22	23.20 ± 0.16	22.71 ± 0.11	44.01 ± 0.18	42.72 ± 0.52
顺铂^b	3.08 ± 0.05	4.02 ± 0.06	4.11 ± 0.02	1.93 ± 0.02	11.29 ± 0.15

注: ^a: 3次平行试验的平均值; ^b: 阳性对照

抗炎活性结果显示, 化合物1—17均无抗炎活性。

3 讨论

本文对从我国南海海域采集的海绵分离出的真菌Penicillium sp. G5A-11发酵产物进行了研究, 从中共鉴定了17个化合物, 其中, 化合物7和9为新的天然产物, 化合物8首次从Penicillium属真菌中分离得到。肿瘤细胞毒活性测试结果显示, 化合物10对肿瘤细胞K562和SGC-7901显示细胞毒活性, 其IC₅₀值分别为(12.07 ± 0.12)μmol·L^-1和(13.17 ± 0.02)μmol·L^-1。

根据文献报道, 化合物1对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、螺旋大肠杆菌(Escherichia coil)、丁香假单胞菌(Pseuomonas syringae pv)均有显著的抑菌活性(Zhang et al, 2013); 在25μg·mL条件下, 化合物10对卤虫Artemia salina表现出了强烈的致死效应, 致死率为88.4% (周静等, 2012); 化合物13对人体黑色素瘤肿瘤SK-MEL、人口腔表皮样癌肿瘤KB、人体乳腺管癌肿瘤BT-549和人卵巢癌肿瘤SKOV-3有显著的细胞毒活性, IC₅₀分别为1.7、1.9、1.4和1.1μmol·L^-1 (Ibrahim et al, 2016); 通过监测纤溶酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator, uPA)降解产物的增强作用, 测定了化合物14的纤溶活性, 与真菌纤溶活性化合物1 (fungi fibrinolytic compound 1, FGFC1)(EC₅₀ = 47.00μmol·L^-1)作为参考药物相比, 化合物14具有中等纤溶活性, 半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC₅₀)为156.30μmol·L^-1 (Guo et al, 2016); 化合物16对烟粉虱具有显著的杀虫活性, 用饲喂性杀虫试验和接触性杀虫试验测得的LC₅₀分别为5.65μg·mL^-1和26.59μg·mL^-1 (An et al, 2021); 化合物17对人体肺癌A549、人卵巢癌SKOV-3、人体黑色素瘤SK-MEL-2、中枢神经系统肿瘤XF498和人结直肠腺癌HCT15具有非特异性中等细胞毒活性, 其EC₅₀分别为12.26、12.30、12.46、13.41和12.33μmol·L^-1 (Kwon et al, 2002)。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

[1]	安熙强, 李宗主, 沈连刚, 等, 2011. 阳春砂仁的化学成分研究[J]. 天然产物研究与开发, 23(6): 1021-1024. AN XIQIANG, LI ZONGZHU, SHEN LIANGANG, et al, 2011. Chemical constituents of Amomum villosum lour[J]. Natural Product Research and Development, 23(6): 1021-1024 (in Chinese with English abstract).

[2]

韩秀丽, 林贞健, 陶洪文, 等, 2009. 红海榄共生真菌Penicillium sp. HK13-8细胞毒活性成分研究[J]. 中国海洋药物, 28(5): 11-16.

HAN

XIULI

, LIN

ZHENJIAN

, TAO

HONGWEN

, et al, 2009. Cytotoxic metabolites from symbiotic fungus Penicillium sp. HK13-8 with Rhizophora stylosa[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 28(5): 11-16 (in Chinese with English abstract).

[3]	胡梦君, 2017. 化橘红黄酮对LPS诱导的RAW 264.7细胞的抗炎作用及其机制探究[D]. 武汉: 华中农业大学: 45-49. HU MENGJUN, 2017. The anti-inflammatory effect and mechanism of flavonoids in Exocarpiun citri grandis on LPS-induced RAW264.7 cell[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University: 45-49 (in Chinese with English abstract).

[4]	马宏宇, 孙奕, 吕阿丽, 等, 2010. 茵陈蒿化学成分的分离与鉴定[J]. 中国药物化学杂志, 20(1): 61-63, 69. MA HONGYU, SUN YI, LYU A’LI, et al, 2010. Isolation and identification of chemical constituents from Artemisia capillaries Thunb[J]. Chinese Journal of Medicinal Chemistry, 20(1): 61-63, 69 (in Chinese with English abstract).

[5]

吴旭东, 梅文莉, 邵长伦, 等, 2011. 中国南海蜂海绵Haliclona cymae formis的化学成分研究[J]. 中国海洋药物, 30(5): 12-17.

XUDONG

, MEI

WENLI

, SHAO

CHANGLUN

, et al, 2011. Studies on the chemical constituents of sponge Haliclona cymae formis from the South China Sea[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 30(5): 12-17 (in Chinese with English abstract).

[6]

杨静雨, 唐敏敏, 陈丽, 等, 2022. 海南红树红榄李内生真菌Penicillium sclerotiorum HLL113次级代谢产物研究[J]. 有机化学, 42(3): 896-900.

DOI

YANG

JINGYU

, TANG

MINMIN

, CHEN

, et al, 2022. Study on the secondary metabolites of endophytic Penicillium sclerotiorum HLL113[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 42(3): 896-900 (in Chinese with English abstract).

[7]

张莎, 旷敏, 彭伟伟, 等, 2022. 美丽薄子木内生真菌Rhytidhysteron sp. BZM-9化学成分研究[J]. 中南药学, 20(9): 1969-1974.

ZHANG

SHA

, KUANG

MIN

, PENG

WEIWEI

, et al, 2022. Chemical constituents of endomycete fungus Rhytidhysteron sp. BZM-9 from Leptospermum brachyandrum[J]. Central South Pharmacy, 20(9): 1969-1974 (in Chinese with English abstract).

[8]

周静, 陈敏, 李筠, 等, 2012. 一株枝网刺柳珊瑚共附生真菌Peniophora sp.次级代谢产物研究[J]. 中国海洋药物, 31(4): 8-13.

ZHOU

JING