海洋生物学

红树无瓣海桑果实中糖苷鉴定及其延缓线虫衰老活性研究

  • 刘建雲 , 1, 2 ,
  • 夏家朗 1, 2 ,
  • 白猛 1, 2 ,
  • 李玥瑶 1, 2 ,
  • 韦金花 1, 2 ,
  • 刘锴 1, 2 ,
  • 高程海 , 1, 2 ,
  • 易湘茜 , 1, 2
展开
  • 1.广西中医药大学药学院/海洋药物研究院, 广西 南宁 530200
  • 2.广西海洋药物重点实验室, 广西 南宁 530200
易湘茜。email: ; 高程海。email:

刘建雲(1999—)女, 广西南宁市人, 硕士研究生。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2024-08-02

  修回日期: 2024-10-25

  网络出版日期: 2024-10-31

基金资助

国家自然科学基金项目(42466005)

广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目资助(202404)

广西中医药大学“桂派中医药传承创新团队”项目(2022A007)

广西中医药大学“桂派中医药传承创新团队”项目(2022B005)

广西中医药大学桂派杏林拔尖人才资助项目(2022C008)

广西中医药大学广西一流学科建设开放课题一般项目(2018XK044)

The identification of glycosides from the fruit of mangrove Sonneratia apetala and investigation of their anti-aging activity in Caenorhabditis elegans

  • LIU Jianyun , 1, 2 ,
  • XIA Jialang 1, 2 ,
  • BAI Meng 1, 2 ,
  • LI Yueyao 1, 2 ,
  • WEI Jinhua 1, 2 ,
  • LIU Kai 1, 2 ,
  • GAO Chenghai , 1, 2 ,
  • YI Xiangxi , 1, 2
Expand
  • 1. Faculty of Pharmacy/Institute of Marine Drugs, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China
  • 2. Guangxi Key Laboratory of Marine Drugs, Nanning 530200, China
YI Xiangxi. email: ; GAO Chenghai. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2024-08-02

  Revised date: 2024-10-25

  Online published: 2024-10-31

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42466005)

The Development Program of High-level Talent Team under the Qihuang Project of Guangxi University of Chinese Medicine(202404)

Guangxi University of Chinese Medicine “Guipai Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation Team” Project(2022A007)

Guangxi University of Chinese Medicine “Guipai Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation Team” Project(2022B005)

High-level Talent of Guangxi Traditional Chinese Medicine(2022C008)

General Project of Guangxi University of Chinese Medicine for the Construction of First-Class Disciplines in Guangxi(2018XK044)

摘要

为获得无瓣海桑果实中具有延缓衰老活性的化合物, 对其正丁醇部位开展成分分离及活性研究。运用反相硅胶色谱、凝胶色谱、高压液相色谱手段对其进行分离纯化, 通过波谱分析及文献对照鉴定结构。以寿命、热应激、咽泵频率、弯曲能力、脂褐素为指标, 考察化合物延缓秀丽隐杆线虫衰老活性, 并通过分子对接预测化合物与DAF-16蛋白的作用方式。从正丁醇部位首次分离得到5个化合物, 鉴定为1, 2, 3, 6-四-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(1)、hovetrichoside C (2)、(6R, 9S)-3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷(3)、山柰酚-3-O-β-D葡萄糖苷(4)、3-甲基丁基β-D-吡喃葡萄糖(5)。化合物245在100μmol·L-1浓度下具有显著的延缓衰老活性, 分别使秀丽隐杆线虫寿命延长15.9%、15.0%、22.1%, 极显著延长热应激条件下线虫寿命的36.3%、50.6%、46.3%; 并可提升线虫的咽泵频次、身体弯曲能力以及降低脂褐素的累积。分子对接表明, 化合物245能与DAF-16蛋白氨基酸稳定结合, 结合能分别为-6.6、-6.0、-4.6kcal·moL-1。本研究丰富了无瓣海桑果实中延缓衰老的活性物质研究, 为无瓣海桑果实的开发利用提供理论依据。

本文引用格式

刘建雲 , 夏家朗 , 白猛 , 李玥瑶 , 韦金花 , 刘锴 , 高程海 , 易湘茜 . 红树无瓣海桑果实中糖苷鉴定及其延缓线虫衰老活性研究[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(3) : 148 -156 . DOI: 10.11978/2024150

Abstract

In order to obtain compounds with anti-aging activity in the fruit of Sonneratia apetala, the chemical constituents of n-butanol alcohol extract were separated and their bioactivities were studied. Compounds were isolated and purified by reverse silica column, gel chromatography and high pressure liquid chromatography. The structure of compounds was identified by modern spectral analysis and literature comparison. The anti-aging activity of compounds in Caenorhabditis elegans was investigated using the lifespan, heat stress, pharyngeal pumping capacity, body bending ability and lipofuscin as the indicators. Molecular docking was used in predicting the interaction mode of compounds with protein DAF-16. Five compounds were isolated from the n-butanol alcohol extract for the first time, identified as 1, 2, 3, 6-tetra-O-galloyl -β-D-glucopyranose (1), hovetrichoside C (2), (6R, 9S)-3-oxo-α-ionol-β-D-glucoside (3), kaempferol-3-O-β-D glucoside (4), and 3-methylbutyl β-D-glucopyranoside (5). Compounds 2, 4 and 5 showed an anti-aging activity at 100 μmol·L-1 concentration significantly, extended the lifespan of C. elegans in normal culture by 15.9%, 15.0% and 22.1% respectively, and significantly prolonged the lifespan under heat stress by 36.3%, 50.6% and 46.3% respectively. They improved the frequency of pharyngeal pumping and the ability of body bending, and reduced the lipofuscin accumulated. Molecular docking showed that compounds 2, 4 and 5 could stably bind to the amino acids of protein DAF-16. The binding energy was -6.6, -6.0 and -4.6 kcal·moL-1, respectively. This study enriched the material basis of anti-aging activity and provided a basis for the development and utilization of the Sonneratia apetala fruit.

无瓣海桑(Sonneratia apetala)为海桑属植物, 原产南亚。无瓣海桑果实又称亥槐桑, 可食用, 在壮医用药中主通龙路、消肿痛, 主治林得叮相(跌打损伤)等 (朱华 等, 2017)。无瓣海桑含酚酸类、氨基酸类、黄酮苷类、甾醇类以及萜类等多种成分(曹雷雷 等, 2015), 具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗病毒等药理活性(Shefa et al, 2014)。前期研究发现, 无瓣海桑果实提取物可以提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力, 降低小鼠脑部一氧化氮含量和单胺氧化酶活力, 可改善因D-半乳糖致衰老而导致小鼠学习记忆能力的下降(易湘茜 等, 2019)。正丁醇部位是无瓣海桑果实延缓D-半乳糖致衰老小鼠改善记忆的主要活性部位(李家怡 等, 2019)。易湘茜项目组已对无瓣海桑果实正丁醇部位进行分离, 获得4个具有显著的延缓线虫衰老活性化合物sonneradons A—D, 并初步阐明其延缓衰老作用与线粒体和胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路(IIS)通路增强对氧化应激的抵抗有关(Yi et al, 2020; Jiang et al, 2022)。
为了进一步挖掘无瓣海桑延缓衰老活性成分, 本研究从无瓣海桑果实正丁醇部位分离鉴定了5个糖苷类化合物(图1), 均为首次从无瓣海桑中分离得到, 其中3个可显著延缓线虫衰老, 本研究丰富了无瓣海桑果实的抗衰老活性化合物库, 为其开发利用提供了参考。
图1 化合物1—5结构图

Fig. 1 Structure of compounds 1-5

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(Waters公司, 美国); 步琦C-620中压制备色谱仪(上海沃珑仪器有限公司); Ultimate XB-C18[4.6×250mm, 5μm]分析柱、Ultimate XB-C18[10×250mm, 10μm]制备柱(上海月旭科技股份有限公司); VG-Auto-Spec-3000 HR-ESI-MS质谱仪(Bruker公司, 德国); Avance 500HZ500HZ核磁共振波谱仪(Bruker公司, 德国); IP-digi300/3 自动旋光仪(上海仪迈仪器科技有限公司); EYELAN1100V-W型旋转蒸发仪(东京理化株式会社, 日本); CT15RE台式高速离心机(Eppendorf公司, 德国); VICTOR NIVO多功能酶标仪(Perkin Elmer公司, 美国); S9i体视显微镜、DM i8荧光倒置显微镜(Leica公司, 德国); CP3102十万分之一天平(上海志荣电子科技有限公司); WFH-2038暗箱式紫外分析仪(杭州奇威仪器有限公司); LC-DCY-12G干式氮吹仪(上海力辰邦西仪器科技有限公司); 恒温培养箱(精宏仪器有限公司); IS-RDV3恒温振荡器(苏州捷美电子有限公司)。

1.2 实验材料

石油醚(沸程60~90℃)、正丁醇、乙酸乙酯(分析纯, 成都市科隆化学品有限公司); 氯仿、丙酮(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 柱层析正相硅胶(200~300目, 青岛海洋化工厂); 薄层硅胶板(烟台化学工业研究所); 雷帕霉素(上海麦克林生化科技有限公司); 二甲基亚砜细胞培养基(北京索莱宝科技有限公司); 琼脂粉(兰杰柯科技有限公司); 蛋白胨(北京奥博星生物技术有限公司); 氯化钠、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司); LB肉汤(广东环凯微生物科技有限公司); K2HPO4·3H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O、无水MgSO4、无水CaCl2、胆固醇(西陇科学股份有限公司); 5%次氯酸钠(朗索医用消毒剂有限公司)。
新鲜无瓣海桑果实样品于2020年9月采自广西钦州市茅尾海康熙岭红树林自然保护区(108°28′—108°45′E, 21°33′—21°54′N)。经广西中医药大学刘昕明副研究员鉴别为红树科(Rhizophoraceae)海桑属红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala)的果实, 标本保藏于广西中医药大学海洋药物研究院, 编号为2020-IMDGX-001。
本研究使用的秀丽隐杆线虫品系为N2野生型, 以尿嘧啶缺陷型大肠杆菌Escherichia coli OP50(简称OP50)为食物, 均由广西科学院汪斌博士惠赠, 在20℃培养箱培养。

2 方法

2.1 提取分离

无瓣海桑果实新鲜样品(湿重约106kg), 使用95%工业酒精浸泡提取3次, 每次7d, 合并滤液减压浓缩得到粗浸膏。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取, 浓缩得到石油醚部位(137.30g)、乙酸乙酯部位(850.60g)、正丁醇部位(1300.40g)和水部位(3500.80g)。

2.2 成分分离

正丁醇部位浸膏(1300.40g), 采用正相硅胶柱层析, 经氯仿-甲醇系统(体积比为10∶0、10∶1、5∶1、20∶7、0∶10)梯度洗脱, 共收集到200个流份。经薄层色谱分析, 合并得到12个组分(Fr.1-Fr.12)。组分Fr.6经硅胶色谱分离, 以氯仿-甲醇系统(体积比为10∶0、10∶1、10∶1.5、10∶3、10∶6、0∶10)进行梯度洗脱, 合并为6个组分(Fr.6.1—Fr.6.6)。Fr.6.3、Fr.6.4分别经高压液相色谱(甲醇∶水=20∶80, V/V)纯化获得化合物1 (7.3mg, tR=21.52min)、化合物4 (6.8mg, tR=23.68min)。Fr.8经凝胶色谱以甲醇洗脱得到6个组分Fr.8.1—Fr.8.6。Fr.8.2经高压液相色谱(甲醇∶水=70∶30, V/V)分离得到化合物2 (5.3mg, tR=19.70min)。Fr.3以石油醚-乙酸乙酯系统(体积比为10∶0, 10∶1.5, 10∶3, 10∶5, 10∶10, 0∶10)进行梯度洗脱, 合并为5个组分(Fr.3.1—Fr.3.5)。Fr.3.4经高压液相色谱(甲醇∶水=10∶90, V/V)纯化得化合物3 (4.9mg, tR=23.50min)。Fr.10使用硅胶色谱分离, 以氯仿∶甲醇(体积比为10∶0, 10∶1, 10∶1.5, 20∶7, 10∶5, 0∶10)进行梯度洗脱, 共收集到120个流份。TLC分析后合并为9个组分(Fr.10.1-Fr.10.9)。Fr.10.9经高压液相色谱(甲醇∶水=70∶30, V/V)制备得化合物5 (8.9mg, tR=18.30min)。

2.3 抗衰老活性测试

2.3.1 培养基及缓冲液配制

线虫生长培养基(nematode growth medium, NGM)配制, 线虫同步化步骤同韩敏敏 等(2020)所述。

2.3.2 药物配制及给药

化合物溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中, 保存于-80℃超低温冰箱, 采用OP50菌液稀释至终浓度为100μmol·L-1, 以浓度为0.1%的DMSO作为对照, 雷帕霉素作为阳性药。试验均从秀丽隐杆线虫孵化至L4 (larva 4)期开始给药, 药物以100μL每板添加于NGM板上。

2.3.3 寿命实验

每板60只, 给药当天记为第0d, 每天进行转板统计死亡及存活线虫数。当线虫无自主移动、吞咽动作, 轻触无反应时视为死亡。剔除钻入琼脂及虫卵体内孵化造成死亡的线虫, 实验重复三次。

2.3.4 37℃热应激实验

给药4d后, 将线虫转至新的NGM培养皿中, 转入37℃恒温培养箱中, 每隔2h检测一次死亡情况, 直至所有的线虫死亡。死亡判定标准同寿命试验。

2.3.5 咽泵、弯曲频率实验

在给药后的3、6、9、12d, 随机将线虫转移至新NGM板上, 让其自由活动5min, 观察统计1min内线虫咽部抽动次数。对于弯曲实验, 则转至含M9缓冲液的96孔板中, 统计1min内线虫身体弯曲次数, 整个虫体弯曲正弦改变一次为弯曲一次。

2.3.6 脂褐素实验

在给药后的3、6、9、12d, 采用1mmol·L-1盐酸左旋咪唑麻醉线虫后置于2%琼脂糖垫片上, 使用荧光倒置显微镜, 在紫外激发光波长为365~390nm下固定曝光时间、对比度、激发光强度后进行拍摄, 采用Image J软件进行荧光强度定量。

2.3.7 分子对接

从UNIPROT蛋白数据库(http://uniprot.org)得到DAF-16 (UniProKB-O16850)的氨基酸序列, 并通过同源建模网站(https://www.swissmodel.expasy.org/)模拟蛋白晶体结构, 晶体结构4LG0显示中间区域定义为活性口袋(可与DNA结合)。利用Autoduck vina分子对接工具将其与化合物245进行靶点对接, 基于蛋白结构, 假定小分子可能作用不同的位点, 寻找最佳结合位点及结合自由能。结合能小于-5kJ·mol-1认为化合物与靶点蛋白预测结合效果较好。

2.4 数据分析

寿命数据均采用SPSS 26.0软件进行Kaplan-Meier生存分析。其余采用单因素方差分析, 若方差齐性, 则采用LSD (least significant difference)进行事后两两检验, 若方差不齐, 则采用Games-Howell作事后检验。P< 0.05表示具有统计学意义, *表示P< 0.05, **表示P< 0.01, ***表示P< 0.001。

3 结果与分析

3.1 结构鉴定

化合物 1: 深黄色固体, ESI-MS m/z 789.06 [M + H]+, 分子式C34H28O221H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH 6.13 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-1), 5.27 (1H, t, J = 8.8 Hz, H-2), 5.53 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-3), 3.81 (1H, m, H-4), 4.09 (1H, m, H-5), 4.41 (1H, m, H-6α), 4.43 (1H, m, H-6β), 6.99 (2H, s, H-2'), 6.90 (2H, s, H-6'), 6.88 (2H, s, H-2, 6), 6.80 (2H, s, H-2, 6)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC 165.8, 165.2, 164.8, 164.01 (C-7), 145.7, 145.7, 145.5, 145.5 (C-3, 5), 139.6, 139.0, 138.7, 138.7 (C-4), 119.2, 119.1, 118.2, 117.6 (C-1), 109.0, 108.9, 108.8, 108.7 (C-2, 6), 92.0 (C-1'), 74.7 (C-5'), 74.4 (C-3'), 72.6 (C-2'), 70.8 (C-4'), 63.1 (C-6')。对糖苷部分进行酸水解, 与标准单品比较, 鉴定为D-葡萄糖。以上数据与文献(李军 等, 2021)比对结果基本一致, 故鉴定化合物1为1, 2, 3, 6-四-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖。
化合物 2: 黄色油状, [α]-96.143° (c 0.1, MeOH), ESI-MS m/z 451.13 [M + H]+, 分子式C21H22O111H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH 6.93 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2′, 6′), 6.54 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3', 5′), 6.03 (1H, s, H-5), 5.91 (1H, s, H-7), 4.90 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-1), 3.65 (1H, m, H-3), 3.48 (1H, m, H-4), 3.25 (4H, m, H-2, 5, 6), 2.95 (2H, m, H-b); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC 192.3 (C-3), 171.9 (C-7a), 168.9 (C-6), 156.8 (C-4), 156.7 (C-4′), 131.4 (C-2′, 6′), 124.2 (C-1′), 114.7 (C-3′, 5′), 105.6 (C-2), 101.6 (C-3a), 99.5 ( C-1), 95.5 (C-5), 91.6 (C-7), 77.2 (C-5), 76.9 (C-3), 73.0 (C-2), 69.3 (C-4), 60.5 (C-6), 40.5 (C-b)。以上数据与文献(刘希达 等, 2021)比对结果基本一致, 故鉴定化合物2为hovetrichoside C。
化合物 3: 为黄色油状, [α]-32.023° (c 0.1, MeOH), ESI-MS m/z 371.03 [M + H]+, 分子式C19H30O71H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH 1.19 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-10), 0.93 (3H, s, H-11), 0.93 (3H, s, H-12), 1.82 (3H, d, J = 1.3 Hz, H-13), 5.65 (1H, dd, J = 15.5 Hz, H-7), 5.76 (1H, s, H-10), 5.95 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-4), 2.05 (1H, d, J = 16.6 Hz, H-2a), 2.55 (1H, d, J = 16.7 Hz, H-2b), 2.94 (1H, m, H-6), 4.4 (1H, m, H-9), 4.09 (1H, d, H-1′), 2.9-3.0 (4H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC 18.6 (C-10), 23.1 (C-11), 24.1 (C-12), 22.1 (C-13), 41.0 (C-1), 49.4 (C-2), 197.4 (C-3), 125.6 (C-4), 164.2 (C-5), 69.8 (C-6), 131.5 (C-7), 131.6 (C-8), 77.0 (C-9), 100.0 (C-1′), 73.3 (C-2′), 77.9 (C-3′), 72.0 (C-4′), 77.2 (C-5′), 61.1 (C-6′)。以上数据与文献(时志春 等, 2021)比对结果基本一致, 故鉴定化合物3为(6R, 9S)-3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷。
化合物 4: 黄色油状, ESI-MS m/z 449.09 [M + H]+, 分子式C21H20O111H NMR (500 MHz, Methanol-d4) δH 8.06 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d, J = 8.6 Hz, H3′, 5′), 6.40 (1H, d, H-8), 6.21 (1H, H-6), 5.25 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1′′). 13C NMR (125 MHz, Methanol-d4) δC 179.55 (C-4), 165.99 (C-7), 163.07 (C-5), 161.6 (C-4′), 159.1 (C-9), 157.3 (C-2), 136.1 (C-3), 132.9 (C-2′, 6′), 122.0 (C-1′), 116.1 (C-3′, 5′), 106.4 (C-10), 104.1 (C-1′′), 99.9 (C-6), 94.8 (C-8), 78.4 (C-5′′), 77.5 (C-3′′), 75.2 (C-2′′), 71.4 (C-4′′), 62.6 (C-6′′)。以上数据与文献(叶磊 等, 2024)比对结果基本一致, 故鉴定4为山柰酚-3-O-β-D葡萄糖苷。
化合物 5: 为黄色油状, ESI-MS m/z 273.13 [M + Na]+, EI-MS m/z: 250.12, 分子式C11H22O61H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH 4.09 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 3.08 (m, 1H), 3.11 (m, 1H), 2.92 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 3.03 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 3.43 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 3.64 (t, 1H, J = 6.1 Hz), 0.88 (m, 3H), 0.86 (m, 3H), 3.42 (qd, 1H, J = 7.1, 3.1 Hz), 3.79 (dt, 1H, J = 9.6, 7.0 Hz), 4.54 (s, 2H), 1.41 (m, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC 102.9 (C-1), 76.8 (C-2), 76.8 (C-3), 73.5 (C-4), 70.1 (C-5), 61.1 (C-6), 22.6 (C-4'), 66.9 (C-1'), 58.2 (C-2'), 38.1 (C-3'), 22.5 (C-5')。对糖苷部分进行酸水解, 与标准单品比较, 鉴定为D-葡萄糖。由于糖端基团上有氢(J = 7.8Hz), 可知为β构型, 将该糖苷化合物的核磁共振数据与文献(Wang et al, 2018)比较, 基本一致, 鉴定化合物5为3-甲基丁基 β-D-吡喃葡萄糖。

3.2 化合物对线虫寿命的影响

与对照组的寿命(9.897±0.546)d比较, 化合物2和化合物4干预下的线虫寿命分别为(11.474±0.773)d和(11.383±0.676)d, 显著延长了15.9%和15.0%(P< 0.05)。化合物5干预下线虫寿命达(12.085±0.909)d, 显著延长了22.1%(P<0.01); 化合物3干预下线虫寿命平均延长8.0%, 但不具有显著差异(P>0.05); 化合物1不具有抗衰老活性, 具体结果见表1
表1 化合物对秀丽隐杆线虫寿命的影响(n=60)

Tab. 1 Lifespan-extending effects of compounds on C. elegans (n=60)

药物分组 药物浓度/(μmol·L-1) 寿命/d 延长比例/%
平均数 最大寿命 P
对照组 9.897±0.546 19
阳性药 100 12.246±0.632** 23 0.005 23.9
1 100 9.417±0.604 21 0.790
2 100 11.474±0.773* 25 0.016 15.9
3 100 10.689±0.668 22 0.154 8.0
4 100 11.383±0.676* 23 0.041 15.0
5 100 12.085±0.909** 26 0.004 22.1

注: *表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01), ***表示极其显著相关(P<0.001)。

3.3 化合物对热应激下线虫寿命的影响

热应激试验中, 与对照组比较, 在化合物245的作用下, 线虫的平均寿命分别显著延长了36.3%、50.6%、46.3%(P<0.001), 具体见表2
表2 化合物对37℃应激条件下秀丽隐杆线虫寿命的影响(n=60)

Tab. 2 Lifespan-extending effects of compounds on C. elegans under stress at 37℃ (n=60)

药物分组 药物浓度/(μmol·L-1) 寿命/h 延长比例/%
平均数 最大寿命 P
对照组 12.660±0.825 21
阳性药 100 21.140±0.732*** 29 <0.001 70.0
2 100 17.260±0.738*** 27 <0.001 36.3
4 100 19.071±0.799*** 28 <0.001 50.6
5 100 18.520±0.974*** 30 <0.001 46.3

注: *表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01), ***表示极其显著相关(P<0.001)。

3.4 化合物对线虫咽泵频率及身体弯曲次数的影响

在我们观察的4个时间点中, 与对照组相比, 化合物25均能增加线虫的咽泵次数(P<0.01), 化合物4在线虫给药6d后表现出增加线虫咽泵次数作用(P<0.05), 见图2。与对照组相比, 化合物245均能增加M9缓冲液中线虫身体扭动的弯曲次数(P<0.05), 见图3。这表明化合物能提高线虫咽部肌肉及身体健康的运动能力, 减缓其年龄依赖性的运动能力降低, 对线虫衰老相关的健康寿命指标有助益作用。
图2 化合物对线虫咽泵能力的影响(n=10)

*表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01), ***表示极其显著相关(P<0.001)

Fig. 2 Effects of compounds on pharyngeal pumping capacity in C. elegans (n=10)

图3 化合物对线虫弯曲能力的影响(n=10)

*表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01), ***表示极其显著相关(P<0.001)

Fig. 3 Effects of compounds on bending capacity in C. elegans (n=10)

3.5 化合物对线虫脂褐素累积的影响

随着线虫年龄的增长, 脂褐素累积逐步增加。与对照组相比, 给药组脂褐素平均水平显著降低, 结果如图4图5所示。如在给药12d后, 与对照组脂褐素平均荧光强度(11.059±1.330)%相比, 化合物245干预后脂褐素的平均荧光分别为(8.458±1.057)%、(9.173±0.901)%和(8.794±0.859)%, 线虫体内的脂褐素分别减少23.52%、17.06%和20.49%(P<0.01)。
图4 化合物对线虫脂褐素累积的影响(n=10)

*表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01), ***表示极其显著相关(P<0.001)

Fig. 4 Effects of compounds on lipofuscin accumulation in C. elegans (n=10)

图5 各组脂褐素荧光代表图(12d)

Fig. 5 Fluorescent representation of lipofuscin in each group (12d)

3.6 化合物与DAF-16靶蛋白的分子对接虚拟筛选

化合物245与DAF-16蛋白的分子对接如图6所示。化合物245与DAF-16蛋白氨基酸的结合能分别为-6.6、-6.0、-4.6kcal·mol-1。其中化合物2与DAF-16氨基酸的结合位点为GLU-193, 形成1个氢键。化合物4与DAF-16氨基酸的结合位点为SER-250、SER-223、ARG-240、LYS-248, 形成4个氢键。化合物5与DAF-16氨基酸的结合位点为GLU-193, 形成1个氢键。
图6 化合物与DAF-16蛋白的分子对接

Fig. 6 Molecular docking of the compounds with protein DAF-16

4 结论与讨论

4.1 从无瓣海桑果实中获得一类糖苷化合物

据报道无瓣海桑枝叶与果实主要含萜类、酚酸类(纪卿飞 等, 2005; 曹雷雷 等, 2015)、氨基酸、脂肪酸(林海生 等, 2009)、脂类、多糖类(刘晶晶, 2020)及苷类化合物(Jiang et al, 2022), 其枝叶具有降尿酸活性(江林芸, 2023), 果实则具有抗氧化、改善衰老小鼠记忆活性(易湘茜 等, 2017, 2019)。课题组前期研究发现其果实正丁醇部位可延缓秀丽隐杆线虫衰老(Yi et al, 2020), 本研究在此基础上从正丁醇活性部位分离得到5个糖苷类化合物, 丰富了无瓣海桑的化合物库类型。

4.2 糖苷类物质是无瓣海桑延缓衰老的活性成分之一

糖苷类具有良好的抗氧化作用(陆远 等, 2024), 而抗氧化成分与健康老龄化联系密切(Bassolino et al, 2022)。本研究通过秀丽隐杆线虫评价糖苷类化合物的体内抗衰老活性。结果表明化合物245可显著延长秀丽隐杆线虫的寿命, 极显著增加线虫的咽部泵送与身体弯曲能力, 降低衰老生物标志物脂褐素的积累。在衰老的过程中, 化合物5对线虫的咽泵和弯曲功能保护作用最显著, 其次是化合物2, 说明糖苷类化合物在延缓衰老方面有很大的应用潜力。转录因子DAF-16是长寿和氧化应激耐受性的中心调控因子, 由DAF-16靶基因编码的蛋白可保护细胞免受氧化应激影响(Rodriguez-Colman et al, 2024)。鉴于3种活性化合物可提高线虫的耐热性及延长寿命, 推测DAF-16可能参与调控活性化合物对线虫的保护。通过分子对接预测化合物与DAF-16靶蛋白的作用方式, 发现化合物24对接效果与活性结果相符, 而化合物5与其活性最佳的结果不符, 推测DAF-16可能是化合物24发挥延缓衰老作用的关键因子, 化合物5可能部分通过DAF-16依赖方式延缓线虫衰老。

4.3 结论与展望

本研究首次从无瓣海桑果实中分离得一类糖苷化合物, 并筛选出3个显著延缓线虫衰老的活性化合物, 为无瓣海桑果实的开发利用提供物质基础。后续将借助辅助药物设计明晰糖苷类化合物的构效关系, 研究其延缓衰老机制, 进一步挖掘无瓣海桑果实中延缓衰老的活性化合物。
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