海洋生物学

基于形态和环境DNA宏条形码技术的广西涠洲岛马尾藻场浮游动物群落结构及其粪便碳通量

  • 黎洁丽 ,
  • 邹立功 ,
  • 杨宇峰 ,
  • 王庆
展开
  • 暨南大学生态学系, 人与自然生命共同体重点实验室, 广东 广州 510632
王庆。email:

黎洁丽(1999—), 女, 广西壮族自治区玉林市人, 硕士研究生, 从事浮游动物生态研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2024-11-15

  修回日期: 2024-11-26

  网络出版日期: 2024-11-27

基金资助

国家自然科学基金(32271684)

Zooplankton community structure and fecal carbon flux in the seaweed Sargassum beds of Weizhou Island, Guangxi, based on morphological and environmental DNA metabarcoding

  • LI Jieli ,
  • ZOU Ligong ,
  • YANG Yufeng ,
  • WANG Qing
Expand
  • Department of Ecology, Key Laboratory of Philosophy and Social Science in Guangdong Province, Jinan University, Guangzhou 510632, China
WANG Qing. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2024-11-15

  Revised date: 2024-11-26

  Online published: 2024-11-27

Supported by

National Natural Science Foundation of China(32271684)

摘要

为分析大型海藻对浮游动物群落结构及其粪便碳通量的影响, 于2024年3月、5月和6月在广西涠洲岛马尾藻海藻场及其邻近对照海域进行了浮游动物群落结构调查, 估算了浮游动物粪便碳通量, 并于2024年5月马尾藻茂盛期利用环境 DNA宏条形码对浮游动物群落进行了检测。调查期间基于形态分类学共鉴定浮游动物45种, 其中桡足类38种, 浮游动物丰度变化范围为1160~3960ind.·m-3, 马尾藻海藻场的浮游动物种类及其丰度均高于对照海域(P<0.05)。通过形态学、18S rDNA和COI基因鉴定出的浮游动物种类组成有较大差异, 其中形态学鉴定出较多的桡足类, 18S rDNA检测出较多的纤毛虫, 而 COI基因检测出较多的水母类, 综合三种方法共同检测到的种类为锥形宽水蚤(Temora turbinata)。浮游动物粪便碳通量的变化范围为0.215~0.574mg C·m−2·d−1, 马尾藻海藻场浮游动物的粪便碳通量高于对照海域。调查结果表明, 大型海藻马尾藻场的生态环境能够提高浮游动物的多样性和丰度, 增加浮游动物粪便碳通量。

本文引用格式

黎洁丽 , 邹立功 , 杨宇峰 , 王庆 . 基于形态和环境DNA宏条形码技术的广西涠洲岛马尾藻场浮游动物群落结构及其粪便碳通量[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(3) : 104 -120 . DOI: 10.11978/2024207

Abstract

In order to analyze the effect of seaweed on zooplankton community structure and its fecal carbon flux, a survey of zooplankton community structure was carried out in the Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters, Guangxi, in March, May and June 2024, and zooplankton fecal carbon flux was also estimated. When Sargassum bloomed in May 2024, the zooplankton community structure was examined by two types of environmental DNA metabarcoding (18S rDNA and COI gene). A total of 45 zooplankton species, including 38 copepods, were identified by morphology during the survey period. The zooplankton abundance varied from 1160~3960 ind.·m-3, with the zooplankton species and abundance identified in the Sargassum beds being higher than that of its adjacent waters (P<0.05). There were marked differences in the composition of zooplankton species identified by morphology, 18S rDNA and COI gene, with more copepods identified by morphology, more ciliates detected by 18S rDNA, and more medusa species detected by COI gene. The only species detected by all three methods was Temora turbinata. Zooplankton fecal carbon flux varied from 0.215~0.574 mg C·m−2·d−1, and the zooplankton fecal carbon flux in the Sargassum beds were higher than that in its adjacent waters. The results showed that the growth of Sargassum can improve zooplankton diversity and increase zooplankton abundance and fecal carbon flux.

大型海藻是近海重要的初级生产者, 能促进海洋生态系统生源要素循环, 具有防治海水富营养化和固碳增汇作用(杨宇峰 等, 2021), 其所形成的海藻场为各种海洋生物提供栖息地、庇护所和索饵场, 对提高近岸海域生物多样性、优化海洋生态系统结构与功能、保持生态系统的稳定具有重要意义(章守宇 等, 2019)。浮游动物是海洋生态系统的重要组成, 将浮游植物通过光合作用所固定的太阳能向更高营养级传递, 在海洋食物网中起着承上启下的关键作用(Turner, 2015; Benedetti et al, 2021)。浮游动物的群落结构可作为海洋生态系统变化的重要指标, 为生态系统和健康状况评估提供参考(Garcia et al, 2021)。海洋浮游动物粪便对海洋碳循环起着至关重要的作用, 浮游动物产生的下沉粪便颗粒增强了生物泵作用, 将小的、缓慢下沉的浮游植物细胞重新包装并转化为更大、下沉更快的团聚体(黄邦钦 等, 2015)。这些颗粒能够有效地将表层海洋的碳转移到深海, 促进碳的长期封存, 是重要的碳汇途径, 粪便沉降加速有机碳从海洋表层向深海转移, 是海洋生物碳泵的关键部分(Turner, 2015; Steinberg et al, 2017)。
随着分子生物学技术的快速发展, 生物种类的检测鉴定技术也不断更新。环境DNA宏条形码技术是利用从环境样本中提取的DNA进行PCR扩增并通过高通量测序对环境样本中存在的物种进行鉴定(Wang et al, 2023; Blackman et al, 2024)。与传统的形态学鉴定方法相比, 环境DNA宏条形码技术具有更高的物种分辨率和灵敏度(Chen et al, 2023), 提高了物种监测效率, 节约了时间和成本(Mu et al, 2024)。为了准确快速地完成对目标物种的监测, 选择合适的DNA宏条形码非常重要(Stefanni et al, 2018)。浮游动物环境DNA宏条形码研究中使用较多的是线粒体细胞色素氧化酶亚基 I (cytochrome oxidase subunit I, COI)基因和真核生物核糖体小亚基基因(18S rDNA), 因其基因序列高度保守而被广泛应用于水生生物多样性鉴定和监测(Li et al, 2011; Bucklin et al, 2016)。
涠洲岛位于广西北部湾东北部, 是广西面积最大的海岛, 全岛陆地面积约24.74km2, 岛上生物资源丰富, 海湾众多。涠洲岛属于热带季风气候, 全年温差较小, 受东亚季风交替的影响, 海洋环境具有明显的季节性特征。在春季及夏季初, 涠洲岛沿岸礁石生长着大量的马尾藻, 形成了生物资源丰富的海藻场。为调查大型海藻对浮游动物群落结构的影响, 本研究以广西涠洲岛大型海藻马尾藻场为调查海域, 基于形态学和环境DNA宏条形码技术, 对马尾藻海藻场浮游动物群落结构进行了分析, 并估算了浮游动物粪便碳通量, 以评估马尾藻海藻场对浮游动物群落结构及其粪便碳通量的影响。

1 材料与方法

1.1 采样时间与采样点

于2024年3月、5月和6月在马尾藻生长和凋落的不同时期对涠洲岛马尾藻海藻场及其邻近海域进行了每月一次的浮游动物和环境因子采样调查, 共设置6个采样站点(图1), 分为马尾藻海藻场(S1、S2、S3)和邻近海域对照区(C1、C2、C3)。
图1 广西涠洲岛马尾藻场及其邻近海域浮游动物采样站位图

该地图基于自然资源部标准地图服务网站下载的审图号为GS(2024)0568号的标准地图制作

Fig. 1 Zooplankton sampling map of Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters

1.2 环境因子的测定

使用YSI便携式水质分析仪(YSI Plus)现场测定各站位水温、盐度、pH、溶解氧(dissolved oxygen, DO)等数据。采集表层1L水样, 按照《海洋调查规范》(GB/T 12763-2007)的方法测定叶绿素a浓度和总氮(total nitrogen, TN)、总磷(total phosphorus, TP)、活性磷酸盐(PO3–4 -P)、硝酸盐($\mathrm{NO}_{3}^{-}$-N)、亚硝酸盐($\mathrm{NO}_{2}^{-}$-N)等营养盐参数。

1.3 浮游动物形态学样品采集

马尾藻海藻场水域较浅(<5m), 且马尾藻较为密集, 不适用大型浮游生物网采集。浮游动物定性样品用64μm浮游生物网(网口直径20cm, 网衣长度52cm)水平拖网采集; 定量样品用5L采水器分表中底层采集50L水样经过64μm浮游动物网过滤浓缩获得。水下采集整株马尾藻样品, 放入网具中并缓慢提取出水面放入桶中, 用纯水多次清洗马尾藻样品, 经过64μm浮游生物网过滤, 收集藻体附着浮游动物样品。所有样品收集于50mL聚乙烯瓶中, 加福尔马林溶液固定(终浓度5%)。浮游动物定性定量样品带回实验室后, 在显微镜和解剖镜下对样品进行鉴定和计数(陈清潮 等, 1974a, 1974b; 连光山 等, 2018; 张武昌 等, 2019), 形态学鉴定的浮游动物尽可能鉴定到种的分类单位。

1.4 环境DNA样品的采集与高通量测序

1.4.1 环境DNA样品的采集和提取

于2024年5月马尾藻茂盛期采集水体环境DNA样品和藻体附着DNA样品。用5L采水器分表中底层采集海藻场及邻近海域海水样品, 混合均匀后采集2L水样用孔径0.22μm、直径50mm的滤膜过滤。使用同样方法采集整株马尾藻样品, 获得马尾藻藻体附着生物洗脱液, 用孔径0.22μm、直径50mm的滤膜过滤收集。将所有的滤膜用锡纸包裹于液氮中保存带回实验室, 将滤膜放在-80℃下冷冻保存, 直到提取DNA。用DNeasy Power Soil Kit (QIAGEN 12888, Germany)试剂盒提取环境DNA, DNA提取完成后用Nano Drop对DNA进行质量评价。

1.4.2 PCR扩增和高通量测序

选用真核生物通用引物528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′)和760R(5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′)用于18S rDNA基因V4区进行PCR扩增, 选用后生动物通用引物mlCOIintF(5′-GWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′)和jgHCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)用于COI基因PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃变性3min, 然后进行30个循环(94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1min), 最后72℃延伸5min。PCR反应在20μL(4μL 5×FastPfu缓冲液, 2μL 2.5mmol·L-1 dNTPs, 0.8μL每个引物, 0.4μL FastPfu聚合酶和10ng模板DNA)体系中进行。
从2%的琼脂糖凝胶中提取PCR产物, 利用DNA凝胶回收纯化试剂盒(PCR Clean-Up Kit)进行回收产物纯化, 并用Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit对纯化后的PCR产物进行建库, 利用Illumina平台进行测序, 测序服务由上海美吉生物医药科技有限公司提供。

1.5 浮游动物粪便颗粒样品采集与分析

浮游动物粪便颗粒样品使用海水浓缩的方法采集, 在每个采样点用采水器分表中底层采集混合水样, 取30L海水, 使用20μm的浮游生物网进行过滤, 过滤完成后将网滴管中的样品收集到50mL 收集瓶中, 加入福尔马林溶液(终浓度5%)进行固定保存。
样品带回实验室静置浓缩后在显微镜和解剖镜下根据颜色和形状大小特征判断是否为浮游动物粪便(Manno et al, 2015; Li et al, 2022), 计数并计算浮游动物粪便颗粒的丰度, 并测量每一个粪便颗粒的直径或转为等效圆柱、球形后的直径, 计算粪便颗粒的体积(Manno et al, 2015), 使用 0.036mg C·mm-3(Li et al, 2022)作为转换参数转化为碳量, 粪便碳通量(FPCf, mg C·m−2·d−1)按照如下公式计算(Liszka et al, 2019):
$\text{FP}{{\text{C}}_{\text{f}}}\text{ }=\frac{\sum{{{w}_{\text{s}}}\times C}}{V}$
${{w}_{\text{s}}}=\text{(1}\text{.21}\times \text{1}{{\text{0}}^{\text{3}}}\text{)}{{L}^{\text{2}}}{{\text{(}\frac{L}{W}\text{)}}^{\text{1}\text{.664}}}$
式中, ws (单位: m·d−1)为粪便沉降速率, 根据经验推导公式计算; C为粪便含碳量(mg C), V为样品体积(L), L为粪便长度(μm), W为粪便直径(μm)。

1.6 数据处理分析

使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp, version0.19.6)软件对双端原始测序序列进行质控, 使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2.11)软件进行拼接。使用Qiime2流程中的DADA2插件对质控拼接之后的优化序列进行降噪处理, 获得ASV(amplicon sequence variant)代表序列和丰度信息, 使用RDPclassifier 贝叶斯算法(https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)比对到美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的核酸序列数据库(fp://ftp.ncbi.nih.gov/blasv/db/)进行物种注释。通过R 4.3.1中的Vegan包计算浮游动物群落Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Pielou指数, 利用Vegan包基于Bary-Curtis距离对浮游动物群落进行非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)和冗余分析(redundancy analysis, RDA)。使用SPSS 27.0软件进行差异分析, 差异显著性分析使用单因素方差分析, 差异显著性水平设定为P<0.05。使用ArcGis 10.8绘制采样地图, 使用R语言工具以及Origin 2021完成其他图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 基于形态学的浮游动物群落结构时空变化

2.1.1 浮游动物种类组成

共鉴定浮游动物45种, 其中桡足类38种(表1图2); 马尾藻海藻场浮游动物出现44种, 对照区共鉴定出浮游动物38种, 马尾藻附着浮游动物6种。有6种浮游动物在海藻场、对照区以及马尾藻附着样品均有发现, 分别为丽隆水蚤(Oncaea venusta)、拟长腹剑水蚤(Oithona similis)、小毛猛水蚤(Microsetella norvegica)、红小毛猛水蚤(Microsetella rosea)、尖额谐猛水蚤(Euterpina acutifrons)和一种日角猛水蚤(Tisbe sp.), 有7种浮游动物只在马尾藻海藻场发现(表1)。5月调查海区的浮游动物种类数最多, 有39种; 3月浮游动物种类数最少, 只有29种。
表1 涠洲岛马尾藻海藻场及其邻近海域浮游动物种类组成

Tab. 1 Species composition of zooplankton in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters

种类 马尾藻海藻场 对照区 藻体附着 18S COI
3月 5月 6月 3月 5月 6月 3月 5月 6月
中华哲水蚤Calanus sinicus + +
微刺哲水蚤Canthocalanus pauper + + + + + +
小拟哲水蚤Paracalanus parvus + + + + + +
锯缘拟哲水蚤Paracalanus serrulus +
强额孔雀哲水蚤Parvocalanus crassirostris + + + + + +
瘦拟哲水蚤Paracalanus gracilis + + +
矮拟哲水蚤Paracalanus nanus + +
亚强次真哲水蚤Subeucalanus subcrassus + + + + + +
锥形宽水蚤Temora turbinata + + + + + + + +
异尾宽水蚤Temora discaudata + + +
瘦歪水蚤Tortanus gracilis + +
太平洋纺锤水蚤Acartia pacifica + + + + + +
红纺锤水蚤Acartia erythraea + +
瘦尾胸刺水蚤Centropages tenuiremis + + + +
奥氏胸刺水蚤Centropages orsinii + + + +
椭形长足水蚤Calanopia elliptica + + + + +
长刺小厚壳水蚤Scolecithricella ongispinosa + +
缘齿厚壳水蚤Scolecithrix nicobarica +
欧氏后哲水蚤Metacalanus aurivilli + + + +
精致真刺水蚤Euchaeta concinna +
丽隆水蚤Oncaea venusta + + + + + + +
中隆水蚤Oncaea media + + + + + +
拟长腹剑水蚤Oithona similis + + + + + + +
坚长腹剑水蚤Oithona rigida + + + + + +
伯氏平头水蚤Candacia bradyi +
小唇角水蚤Labidocera minuta + + +
圆唇角水蚤Labidocera rotunda + + + +
叉刺角水蚤Pontella chierchiae + +
瘦尾筒角水蚤Pontellopsis tenuicauda + + +
普通波水蚤Undinula vulgaris + +
右突新镖水蚤Neodiaptomus schmackeri + + + +
奥氏伪镖水蚤Pseudodiaptomus aurivilli + + + +
近缘大眼水蚤Corycaeus affinis + + + + + +
小毛猛水蚤Microsetella norvegica + + + + + + + + +
红小毛猛水蚤Microsetella rosea + + + + + + + +
硬鳞暴猛水蚤Clytemnestra scutellata + + + +
尖额谐猛水蚤Euterpina acutifrons + + + + + + + + +
Tisbe sp. + + + + + + + + +
疣毛轮虫Synchaeta sp. +
长尾类幼体Macrura larva + + +
端足类Amphipoda sp. + +
蔓足类幼体Cirripedia larva + + + + +
多毛类幼体Polychaeta larva +
住囊虫Oikopleura sp. +
箭虫Sagitta sp. +
种类合计 27 37 25 20 25 30 3 5 5
图2 涠洲岛马尾藻场及其邻近海区浮游动物的群落结构

a. 不同生境浮游动物种类数; b. 不同月份浮游动物种类数; c. 不同月份和生境的浮游动物丰度; 误差棒上不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)

Fig. 2 Community structure of zooplankton in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters. (a) Comparison of species number in different habitats; (b) comparison of species number in different months; (c) comparison of zooplankton abundance in different months and habitats. Different letters above the error bars indicate statistically significant differences (P<0.05)

2.1.2 浮游动物丰度

调查期间, 涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物丰度范围为2160~3960ind.·m-3, 平均(3069±642)ind.·m-3, 高于对照区浮游动物丰度[1160~3320ind.·m-3, (2267±787)ind.·m-3]。马尾藻海藻场5月和6月浮游动物丰度显著高于3月(P<0.05); 对照区5月浮游动物丰度显著高于3月。总体来看, 马尾藻海藻场浮游动物丰度均值显著高于对照区(P<0.05)(图2c)。
两个区域在不同月份之间的浮游动物组成均以体型较小的剑水蚤为主(图3)。在马尾藻海藻场锥形宽水蚤(9.98%)、拟长腹剑水蚤(8.62%)、强额拟哲水蚤(7.93%)、近缘大眼水蚤(6.95%)的相对丰度较高, 无节幼体的相对丰度达到了19.48%。对照区锥形宽水蚤(11.89%)、中隆水蚤(7.33%)、拟长腹剑水蚤(7.01%)、近缘大眼水蚤(6.19%)的相对丰度较高, 无节幼体的相对丰度达到了23.29%。
图3 基于形态学的涠洲岛马尾藻场及其邻近海区浮游动物相对丰度

Fig. 3 Relative abundance of zooplankton in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters based on morphology

2.1.3 浮游动物多样性指数

马尾藻海藻场Shannon-Wiener和Simpson指数显著高于对照区(P<0.05)(图4), 而Pielou指数没有显著差异。对涠洲岛不同调查区域和不同月份浮游动物群落结构进行NMDS分析, 结果表明, 马尾藻海藻场和对照区浮游动物群落结构组成没有显著差异; 不同月份之间, 3月浮游动物群落结构与5、6月有显著差异(P<0.05)(图5)。2024年3—6月浮游动物群落结构月份之间差异大于区域间差异。
图4 涠洲岛马尾藻场及其邻近海区浮游动物多样性指数

Fig. 4 Zooplankton diversity indices in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters

图5 涠洲岛马尾藻场及其邻近海区浮游动物群落非度量多维尺度分析

a. 采样区域; b. 采样月份

Fig. 5 Non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) of zooplankton communities in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters. (a) Sampling area; (b) sampling month

2.2 基于不同引物环境DNA的浮游动物群落结构

2.2.1 基于18S rDNA的浮游动物群落结构

2024年5月涠洲岛水体DNA样品18S rDNA基因测序共筛选出浮游动物73个ASV, 占比3.59%, 注释出浮游动物53种, 分属于3门6纲22目43科49属。其中马尾藻海藻场浮游动物共41个ASV, 注释出浮游动物33种, 分属于3门4纲13目27科32属; 对照区浮游动物共28个ASV, 注释出浮游动物22种, 分属于3门5纲11目18科19属; 藻体附着样品浮游动物共31个ASV, 注释出浮游动物22种, 分属于3门5纲13目19科22属(附表1)。
附表 1 基于形态学、18S rDNACOI基因的涠洲岛属水平浮游动物组成(S代表马尾藻海藻场, C代表对照区, F代表马尾藻附着样品, 表格统计数据不包括未分类的属)

Appendix Tab. 1 The genus composition of zooplankton off Weizhou Island based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses (S for Sargassum beds, C for its adjacent control waters, F for Sargassum attached samples ; unclassified genera are excluded from statistical calculations in this table)

类群 形态学 18S rDNA COI
S C F S C F S C F
桡足类 哲水蚤属Calanus + + +
刺哲水蚤属Canthocalanus + + + +
拟哲水蚤属Paracalanus + + + + +
隆哲水蚤属Acrocalanus +
基齿哲水蚤属Clausocalanus +
孔雀哲水蚤属Parvocalanus + + +
次真哲水蚤属Subeucalanus + + +
宽水蚤属Temora + + + + + + + +
歪水蚤属Tortanus +
桡足类 纺锤水蚤属Acartia + +
胸刺水蚤属Centropages + + +
长足水蚤属Calanopia + +
厚壳水蚤属Scolecithrix +
后哲水蚤属Metacalanus +
真刺水蚤属Euchaeta +
隆水蚤属Oncaea + +
Haplostoma +
Critomolgus + +
Scambicornus +
中剑水蚤属Mesocyclops +
长腹剑水蚤属Oithona + + + + + +
平头水蚤属Candacia +
唇角水蚤属Labidocera + +
筒角水蚤属Pontellopsis + +
波水蚤属Undinula + +
新镖水蚤属Neodiaptomus + +
伪镖水蚤属Pseudodiaptomus + + +
大眼水蚤属Corycaeus + +
小毛猛水蚤属Microsetella + + +
Andromastax + +
Filexilia
拟双倍猛水蚤属Paramphiascella +
盔头猛水蚤属Clytemnestra +
Sentiropsis + + +
谐猛水蚤属Euterpina + + +
日角猛水蚤属Tisbe + + +
盗鳋属Bomolochus +
Clausia +
Lichomolgus +
Pseudanthessius +
Asterocheres +
Ditrichocorycaeus + + +
疮痂鱼虱属Lepeophtheirus + +
轮虫 疣毛轮属Synchaeta +
晶囊轮属Asplanchna +
端足类 藻钩虾属Ampithoe + +
Echinogammarus +
Niphargus + +
Paraphronima +
Awacaris +
Scina +
Uristes +
水母类 Gyractis +
枝手水母属Cladonema +
Stauridiosarsia + +
感棒水母属Laodicea + + + +
深杯水母属Abylopsis + +
Sminthea +
棍螅属Coryne +
长管水母属Sarsia +
Slabberia +
拟面具水母属Pandeopsis + +
枝管水母属Proboscidactyla +
多管水母属Aequorea + +
指突水母属Blackfordia +
Bonneviella + +
钟螅属Campanularia +
直杯螅属Orthopyxis +
钩手水母属Gonionemus +
盛装水母属Agalma +
Marrus +
离翼水母属Apolemia +
双生水母属Diphyes +
海蜇属Rhopilema +
被囊类 住囊虫属Oikopleura +
毛颚类 箭虫属Sagitta + +
纤毛虫 Durchoniella +
Uronemella +
Aspidisca +
Hemigastrostyla +
Amphisiella +
拟铃虫属Tintinnopsis +
Coxliella +
Amphorellopsis +
Eutintinnus +
网纹虫属Favella + + +
Holosticha +
Apokeronopsis + +
Thigmokeronopsis +
Trichototaxis
Cyrtostrombidium +
Laboea + +
Parallelostrombidium + +
旋游虫属Spirostrombidium + +
急游虫属Strombidium +
旋曳尾虫属Spirotontonia + +
检测结果显示浮游动物群落中节肢动物门(Arthropoda)相对丰度最高, 其次是纤毛虫门(Ciliophora)(图6)。马尾藻海藻场浮游动物主要以节肢动物门为主, 平均相对丰度为80.82%, 纤毛虫门平均相对丰度为18.98%; 对照区浮游动物主要以纤毛虫门为主, 平均相对丰度为98.13%, 节肢动物门平均相对丰度为1.51%; 马尾藻附着浮游动物主要以节肢动物门为主, 平均相对丰度为77.39%, 其次是刺胞动物门(Cnidaria), 平均相对丰度为18.89%。在属水平, 马尾藻海藻场浮游动物主要以桡足类宽水蚤属(Temora)和纤毛虫门的网纹虫属(Favella)为主, 其相对丰度分别为16.65%和14.41%, 未分到属的桡足类高达61.74%; 对照区浮游动物主要以纤毛虫门的Apokeronopsis和全列虫属(Holosticha)为主, 其相对丰度分别为87.39%和8.08%; 马尾藻附着浮游动物主要以宽水蚤属(Temora)和深杯水母属(Abylopsis)为主, 其相对丰度分别为22.72%和18.84%, 未分到属的桡足类相对丰度高达50.15%。对照区浮游动物组成与马尾藻海藻场以及马尾藻附着浮游动物有较大的差别。
图6 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛浮游动物门水平和属水平相对丰度

Fig. 6 Relative abundance of zooplankton at phylum and genus levels off Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses

2.2.2 基于COI基因的浮游动物群落结构

2024年5月涠洲岛水体DNA样品COI基因测序共筛选出浮游动物113个ASV, 占比13.71%, 注释出浮游动物56种, 分属于4门6纲13目38科48属。其中马尾藻海藻场浮游动物共30个ASV, 注释出浮游动物18种, 分属于2门3纲7目15科15属; 对照区浮游动物共64个ASV, 注释出浮游动物34种, 分属于3门4纲11目26科31属; 藻体附着样品浮游动物共26个ASV, 注释出浮游动物21种, 分属于3门5纲9目18科20属。
COI基因检测结果显示马尾藻海藻场和对照区浮游动物均以节肢动物门和刺胞动物门为主(图6)。马尾藻海藻场节肢动物门的平均相对丰度为96.28%, 刺胞动物门的平均相对丰度为3.72%; 对照区节肢动物门平均相对丰度为97.08%, 刺胞动物门平均相对丰度为2.91%; 马尾藻附着浮游动物主要以节肢动物门和毛颚动物门(Chaetognatha)为主, 其平均相对丰度分别为99.48%和0.32%。在属水平, 马尾藻海藻场浮游动物主要以拟哲水蚤属(Paracalanus)、宽水蚤属(Temora)和Ditrichocorycaeus为主, 其相对丰度分别为41.40%、27.79%和21.89%; 对照区浮游动物主要以端足类为主, 未分到属的端足类相对丰度为91.58%, 藻钩虾属(Ampithoe)相对丰度为4.12%; 马尾藻附着浮游动物主要以宽水蚤属、Ceratosomicola和拟哲水蚤属为主, 其相对丰度分别为33.68%、28.10%和20.31%。

2.2.3 基于形态学和环境DNA浮游动物组成的比较

通过形态学、18S rDNA和COI基因鉴定的2024年5月涠洲岛浮游动物种类组成有较大差异, 通过环境DNA检测到的浮游动物种类更多, 三种方法都能鉴定出较多的宽水蚤属(图7)。通过形态学能鉴定出较多的桡足类, 通过18S rDNA能检测出较多的纤毛虫, 通过COI基因能检测到较多的水母类。通过18S rDNA和COI基因检测到的桡足类有较多的序列不能注释到具体种类。只有锥形宽水蚤能同时被三种方法鉴定出来。
图7 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛浮游动物种类组成韦恩图

a. 属水平; b. 物种水平

Fig. 7 Venn diagram of zooplankton species composition off Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses. (a) Genus level; (b) species level

环境DNA的鉴定结果与形态学鉴定结果互为补充。通过形态学可以鉴定出未被环境DNA鉴定出的歪水蚤属、纺锤水蚤属、大眼水蚤属、唇角水蚤属和平头水蚤属等。通过形态学鉴定出来的65.52%的浮游动物属没有被环境DNA检测到。通过18S rDNA可以鉴定出未被形态学和COI基因鉴定出来的隆哲水蚤属、拟双倍猛水蚤属等, 以及较多的端足类和纤毛虫。通过18S rDNA鉴定出来的85.71%的浮游动物属不能被形态学和COI基因检测到。通过COI基因可以鉴定出未被形态学和18S rDNA鉴定出来的基齿哲水蚤属和中剑水蚤属等, 以及较多的水母类。通过COI基因鉴定出来的79.17%的浮游动物属不能被形态学和18S rDNA检测到。

2.2.4 浮游动物群落结构多样性的比较

基于三种方法比较浮游动物群落结构多样性, 形态学鉴定结果显示2024年5月马尾藻海藻场和对照区浮游动物多样性指数没有显著差异, 马尾藻海藻场浮游动物群落多样性指数略高于对照区(图8)。18S rDNA结果显示对照区Shannon-Wiener指数和Pielou指数较高, 马尾藻附着浮游动物Simpson指数较高。马尾藻海藻场、对照区以及马尾藻附着浮游动物多样性指数没有显著差异。COI基因结果显示马尾藻附着浮游动物Shannon-Wiener指数和Pielou指数较高, 对照区Simpson指数较高。马尾藻海藻场、对照区以及马尾藻附着浮游动物多样性指数没有显著差异。
图8 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛海域浮游动物多样性指数

Fig. 8 Zooplankton diversity indices for the waters of Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses

对2024年5月涠洲岛不同区域的浮游动物群落进行NMDS分析, 形态学鉴定的结果显示, 马尾藻海藻场和对照区浮游动物群落结构差异不明显; 18S rDNA和COI基因结果都显示马尾藻海藻场浮游动物样本与马尾藻附着浮游动物样本重叠程度较高, 并且与对照区样本分离, 表明马尾藻海藻场浮游动物群落结构与马尾藻附着浮游动物群落结构比较相似, 并且与对照区有较大差异(图9)。
图9 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛浮游动物群落非度量多维尺度分析(NMDS)

Fig. 9 Non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) of the zooplankton community off Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses

2.2.5 浮游动物群落与环境因子的关系

对2024年5月涠洲岛浮游动物群落与环境因子进行RDA分析(图10), 形态学鉴定的结果表明盐度(salinity)是影响浮游动物群落的重要环境因子(P<0.05); 18S rDNA结果表明水深(P<0.01)、温度(P<0.05)和pH(P<0.05)是影响浮游动物群落的重要环境因子; COI基因检测结果表明温度和pH是影响浮游动物群落的重要环境因子(P<0.01)。
图10 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛浮游动物与环境因子的RDA分析

Fig. 10 RDA analysis of zooplankton and environmental factors off Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses

在门水平对浮游动物与环境因子进行Spearman相关性分析(图11)。形态学结果表明节肢动物门与亚硝酸盐浓度呈显著正相关(P<0.05); 轮虫动物门与总氮呈显著正相关(P<0.05), 与盐度呈显著负相关(P<0.05); 毛颚动物门与水深、叶绿素a浓度呈显著负相关(P<0.05)。18S rDNA结果表明节肢动物门与水温呈显著正相关(P<0.05), 与总磷浓度和铵盐浓度呈显著负相关(P<0.05); 纤毛虫门与水温呈显著负相关(P<0.05), 与总磷浓度和铵盐浓度呈显著正相关(P<0.05)。COI基因结果表明轮虫动物门与叶绿素a浓度呈显著正相关(P<0.05)。
图11 2024年5月基于形态学、18S rDNA和COI基因的涠洲岛浮游动物与环境因子的Spearman相关性分析

*表示显著正相关(P<0.05)

Fig. 11 Spearman correlation analysis of zooplankton with environmental factors off Weizhou Island in May 2024 based on morphology, 18S rDNA and COI gene analyses

2.3 浮游动物粪便碳通量

2.3.1 浮游动物粪便丰度

2024年3月到6月期间, 涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物粪便丰度高于对照区。马尾藻区和对照区浮游动物粪便丰度最高值都出现在3月, 最低值都出现在6月。不同海区和不同月份之间浮游动物粪便丰度没有显著差异(图12)。
图12 涠洲岛马尾藻场及其邻近海区浮游动物粪便丰度、粪便碳含量、粪便沉降速率以及粪便碳通量

Fig. 12 Zooplankton fecal pellet abundance, carbon content, sinking rate and carbon flux in Sargassum beds of Weizhou Island and its adjacent waters

2.3.2 浮游动物粪便碳含量浓度及其沉降速率

马尾藻海藻场浮游动物粪便碳含量浓度最高值出现在5月, 最低值出现在3月; 对照区浮游动物粪便碳含量浓度最高值出现在3月, 最低值出现在6月。马尾藻海藻场浮游动物粪便碳含量浓度平均值高于对照区, 但不同海区和不同月份之间浮游动物粪便碳含量浓度没有显著差异(图12)。
涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物粪便沉降速率均值为(5.17±4.11)m·d−1; 对照区浮游动物粪便沉降速率均值为(5.13±4.12)m·d−1。不同海区和不同月份之间浮游动物粪便沉降速率没有显著差异。

2.3.3 浮游动物粪便碳通量

马尾藻海藻场和对照区浮游动物粪便碳通量最高值都出现在5月, 最低值都出现在6月。马尾藻海藻场浮游动物粪便碳通量平均值高于对照区, 但不同海区和不同月份之间浮游动物粪便碳通量没有显著差异(图12)。

3 讨论

3.1 基于形态学的涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物群落结构特征

大型海藻能够优化海洋生态系统结构, 所形成的海藻场对波浪具有消减作用, 改变海流动力学, 使海藻场内形成较平稳的海域, 有利于海洋生物的栖息与繁殖(何培民 等, 2015)。海藻场能够为浮游动物提供栖息地和避难所, 为浮游动物提供高度异质化的微环境和食物来源(Wang et al, 2021)。海藻场的植株密度和生物量等生态特征决定海藻生境结构的复杂性, 显著影响浮游生物的群落结构(Metillo et al, 2019)。研究表明, 从海藻床到边缘海域, 浮游动物的总丰度下降, 海藻床中桡足类丰度及其幼体数量显著高于周边海域(Pakhomov et al, 2002)。
本次调查通过形态学鉴定的浮游动物种数, 与2021—2022年涠洲岛海域的研究相比稍有下降(郭键林 等, 2023), 但浮游动物丰度较高, 浮游动物的优势种也有所变化, 从体型较大的微刺哲水蚤变成了体型较小的锥形宽水蚤、拟长腹剑水蚤和中隆水蚤等。与前次调查结果具有差异, 所用网具相同, 可能是因为浮游动物多呈斑块分布, 采样点以及采样时间都会对其种类调查产生较大影响(李开枝 等, 2005)。涠洲岛海域的暖温带种中华哲水蚤(Calanus sinicus)可能由沿岸流携带而来, 丰度较低。中华哲水蚤是黄海和东海的优势种, 南海西北部陆架区是中华哲水蚤的季节分布区, 冬春季由广东沿岸流从东海沿岸携带而来, 夏季雷州半岛东部近海的冷涡和琼东沿岸上升流区成为中华哲水蚤度夏的避难所(尹健强 等, 2013; Li et al, 2016)。
在本研究中涠洲岛马尾藻海藻场及其邻近对照区浮游动物群落主要以体长小于1000μm的中小型浮游动物为主, 桡足类主要为个体较小的剑水蚤。5月是马尾藻生长旺盛的时期, 浮游动物的种类及其丰度最高, 到了6月马尾藻藻体开始凋落。马尾藻海藻场浮游动物的种类数和丰度均显著高于对照海域(P<0.05), 表明马尾藻能够为浮游动物的生长繁殖提供较好的生境, 同时马尾藻藻场也可能为浮游动物提供了更加多样化的食物来源。

3.2 基于形态学和环境DNA的涠洲岛浮游动物群落结构

本研究中形态学和环境DNA宏条形码技术鉴定出来的浮游动物种类组成差异较大, 可能是由于在浮游动物幼虫阶段难以对其进行形态鉴定以及缺乏一些浮游动物类群的特定分类学专业知识, 对特定群体(如刺胞动物)的保存不当也会限制形态学识别, 相比之下, 分子方法能够检测浮游动物早期生命阶段的序列(Keck et al, 2022)。浮游动物个体较小、种类繁多, 并且处于不同发育阶段的个体在形态上有较大差异, 浮游幼虫的鉴定缺乏关键的分类学特征(左涛 等, 2022), 导致浮游动物的形态学鉴定困难。使用环境DNA能够对浮游动物进行更详细的多样性评估, 有助于深入了解物种的生活史和生态作用(康子清 等, 2022)。目前已经报道了较多针对海洋浮游动物的形态学分析和环境DNA宏条形码的比较研究。例如, 通过18S rDNA和形态学对河口浮游生物群落进行了监测, 发现18S rDNA和形态学鉴定对浮游动物的监测具有相同的时间空间变化趋势, 18S rDNA提供了更广泛的生物类群(Abad et al, 2016)。在西英吉利海峡对浮游动物群落采用了DNA宏条形码和形态学鉴定研究结果显示, DNA宏条形码揭示了隐藏的生物多样性, 能更好地识别桡足类以及多毛类(Lindeque et al, 2013)。DNA宏条形码能更好地识别小型浮游动物, 并且检测出来的浮游动物物种丰富度更高(Schroeder et al, 2020)。在珠江口使用形态学和环境DNA对浮游动物进行鉴定调查, 发现通过环境DNA能够检测出浮游幼虫和原生动物等较难镜检鉴别的种类(尹天齐 等, 2022)。在本研究中通过18S rDNA也检测到了较多的原生动物。
本研究中通过形态学鉴定出来的浮游动物主要以桡足类为主, 通过18S rDNA鉴定出来的浮游动物主要以纤毛虫为主, 通过COI基因鉴定出来的浮游动物主要以水母类和端足类为主, 使用64μm浮游动物网进行浮游动物的采集可能不利于体型较大的水母类和端足类的收集, 也会过滤掉更小的微型浮游动物如纤毛虫, 可能会导致形态学和宏条形码鉴定结果有较大的差异。本研究中, 18S rDNA基因鉴定结果与COI基因鉴定结果存在较大差异, 这可能与引物扩增的偏好性相关, 由于DNA扩增偏好在所有分类群中都不相同, 可能会影响种类鉴定(Singh et al, 2021)。DNA宏条形码依赖于参考DNA序列数据库对数百万未知序列和分子操作分类单位进行分类, 目前海洋浮游动物分类群的数据库不足(Questel et al, 2021), 通过宏条形码鉴定的浮游动物有较多的序列不能注释到种, 对浮游动物物种鉴定结果造成较大影响。为了提高DNA宏条形码的有效性, 构建并扩展本土数据库, 开发适合研究区域类群检测的引物是非常必要的(Descôteaux et al, 2021)。通过形态学、18S rDNA和COI基因鉴定的浮游动物种类组成差异较大, 但三种方法都表明节肢动物在浮游动物群落中占主导地位, 宽水蚤属是本研究中丰度最高的属之一。同时使用形态学和环境DNA宏条形码进行鉴定分析, 与仅采用单一鉴定方法相比, 可以实现更多种类的物种检测。DNA宏条形码与形态学鉴定互补, 在开展近海浮游动物的全面调查时, 建议两种方法组合使用(Harvey et al, 2017; 尹天齐 等, 2022)。

3.3 涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物粪便碳通量

本研究中浮游动物粪便颗粒碳通量的变化范围为0.215~0.574mg C·m−2·d−1, 与先前的一些研究(Riser et al, 2001; Guo et al, 2019; Li et al, 2022)相比, 本研究中粪便碳通量的值偏低。在计数过程中, 一些小的、破碎的或被破坏的粪便颗粒难以将它们与碎屑区分开来, 因此可能低估了浮游动物粪便碳通量。总体来看, 马尾藻海藻场浮游动物粪便碳通量为(0.405±0.078)mg C·m−2·d−1), 高于对照海区的(0.353±0.069)mg C·m−2·d−1, 可能是由于海藻的生长为浮游动物提供了丰富的食物来源, 浮游动物的摄食量和粪便产量可能会相应增加。长江口的一项研究表明, 桡足类粪便颗粒在碳输出中起着重要作用, 在夏季由于桡足类的丰度较高, 粪便颗粒的潜在输出通量也较高(Guo et al, 2019)。对东海春季浮游植物和浮游动物粪便颗粒的总有机碳通量研究发现, 微藻形成的聚集体增强了沉降速率, 从而增加了总有机碳通量(Qiu et al, 2018)。浮游动物能够以大型海藻为食(蒋日进 等, 2015), 海藻的生长不仅直接促进了浮游动物的生长和繁衍, 还可能通过改善水体环境、稳定群落结构等间接方式促进浮游动物粪便碳通量的增加。
近海海域海水较浅, 浮游动物粪便颗粒比在大洋中更容易沉到海底。细菌可以降解粪便颗粒, 但一般认为停留时间小于一天时, 细菌不是海洋中新鲜排出的粪便颗粒的主要降解者(Patonai et al, 2011), 粪便颗粒的沉降速率较快, 大部分粪便颗粒会在微生物降解之前沉降到海水底层(Belcher et al, 2016)。本研究海域的水深小于5m, 粪便下沉距离较短, 粪便颗粒在水层中的停留时间较短, 可以忽略细菌等对粪便颗粒的分解。

4 结论

涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物优势类群主要以剑水蚤等中小型浮游动物类群为主, 马尾藻海藻场浮游动物丰度和多样性较高。形态学、18S rDNA和COI基因鉴定出的浮游动物种类组成有较大差异, 通过形态学能鉴定出较多的桡足类, 18S rDNA能检测出较多的纤毛虫, COI基因能检测到较多的水母类, 将形态学和环境DNA结合起来能够对浮游动物群落进行更加全面的监测和评估。初步估算了涠洲岛马尾藻海藻场浮游动物粪便碳通量, 马尾藻的生长可能有助于提高浮游动物粪便碳通量, 今后的研究可开发高精度、高灵敏度的监测技术, 以实现对浮游动物粪便碳通量实时监测和长期跟踪, 促进海洋碳汇和生物泵研究。
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