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热带海洋学报 >

2022 , Vol. 41 >Issue 1: 28 - 41

DOI: https://doi.org/10.11978/2021025

海洋生物学

比较基因组学分析弧菌属群体感应通路的分布与进化

  • 毛颖津 , 1, 2 ,
  • 高贝乐 , 1
展开
  • 1. 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省海洋药物重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州, 510301
  • 2. 中国科学院大学, 北京 100049
高贝乐。email:

毛颖津(1994—), 男, 广东省中山市人, 硕士研究生, 研究方向为微生物功能基因组学研究。email:

Copy editor: 姚衍桃

收稿日期: 2021-02-24

  修回日期: 2021-04-15

  网络出版日期: 2021-04-22

基金资助

广州市科技计划项目(201804010437)

收起

Comparative genomic analysis of the distribution and evolution of quorum sensing pathways in the Vibrio genus

  • MAO Yingjin , 1, 2 ,
  • GAO Beile , 1
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049
GAO Beile. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2021-02-24

  Revised date: 2021-04-15

  Online published: 2021-04-22

Supported by

Science and Technology Program of Guangzhou, China(201804010437)

Fold

摘要

群体感应是一种细菌细胞间的通讯过程, 细菌通过测量细胞外自诱导剂浓度从而感知群体细胞密度变化。群体感应使细菌能够在两种基因表达模式下转换: 在低细胞密度时有利于个体发展, 而在高细胞密度时则有利于群体发展。目前主要有7种群体感应通路, 分别以oligopeptides、AHL(Acylated Homoserine Lactones)、AI-2(Autoinducer-2)、CAI-1(Cholera Autoinducer-1)、PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)、AI-3(Autoinducer-3)以及DSF(Diffusible Signal Factor)作为各群体感应通路的信号分子; 其中oligopeptides存在于革兰氏阳性细菌中, 其余6种信号分子存在于革兰氏阴性细菌中。弧菌是导致人类感染和水产品污染的主要病原菌, 传统的抗生素治疗弧菌感染具有很强的选择压力, 导致越来越多耐药弧菌出现。面对愈发严峻的弧菌耐药性问题, 目前群体感应淬灭被认为是治疗弧菌感染的重要替代手段之一, 因而有必要调查弧菌属细菌不同群体感应通路的分布情况, 为针对弧菌的群体感应淬灭剂研发提供重要参考信息。通过比较基因组学分析, 发现全基因组测序的46株弧菌存在AHL、AI-2以及CAI-1这3种信号分子通路, 其中5株弧菌均含有上述3种信号分子通路, 共有30株弧菌只含有AI-2和CAI-1两种信号分子通路; 而46株弧菌都不存在PQS、AI-3以及DSF群体感应通路。此外, 弧菌群体感应通路的分布与物种进化有关, 含有同种群体感应信号分子通路的弧菌, 其亲缘关系较近, 说明该通路的基因进化自它们的共同祖先。本研究表明开发针对弧菌的群体感应淬灭剂应以AI-2和CAI-1两种信号分子介导的通路作为靶点。

关键词： 比较基因组学; 弧菌; 群体感应; 信号分子; 物种进化; 群体感应淬灭剂

本文引用格式

毛颖津 , 高贝乐 . 比较基因组学分析弧菌属群体感应通路的分布与进化[J]. 热带海洋学报, 2022 , 41(1) : 28 -41 . DOI: 10.11978/2021025

Abstract

Quorum sensing (QS) is a process of bacterial cell-cell communication in which bacteria can monitor their population density by detection of extracellular autoinducer. QS allows the bacteria to switch between two kinds of gene expression modes: The program is suitable for individual development at low cell density, while favoring community at high cell density. Presently, there are mainly seven kinds of QS signaling molecules, including oligopeptides, AHL (Acylated Homoserine Lactones), AI-2 (Autoinducer-2), CAI-1 (Cholera Autoinducer-1), PQS (Pseudomonas Quinolone Signal), AI-3 (Autoinducer-3), and DSF (Diffusible Signal Factor). Among them, oligopeptides mainly exist in gram-positive bacteria, and the others are commonly found in gram-negative bacteria. Species of the Vibrio genus are important pathogens for human and aquaculture. Since traditional antibiotic treatment has a strong selection pressure leading to increasing number of drug-resistant Vibrio and increasing serious problems, QS quenching is believed as one alternative strategy of the most potential to combat bacterial infection. Thus, it is necessary to investigate the distribution of QS pathways among the Vibrio genus. Among the 46 whole genome sequenced Vibrio species, we found that only three pathways exist in Vibrio species, including AHL, AI-2 and CAI-1 pathways. Specifically, five Vibrio species contain the above three pathways, and 30 strains contain both AI-2 and CAI-1 pathways. However, none of the 46 Vibrio species have the PQS, AI-3 and DSF pathways. In addition, the distribution of QS pathways in Vibrio is related to their phylogeny, suggesting that species with the same QS pathway(s) are close relatives, which indicates that the genes of this pathway evolved from their common ancestor. This study provides useful information for QS quenching against Vibrio pathogens by targeting the AI-2 and CAI-1 QS pathways.

Key words： comparative genomics; vibrio genera; quorum sensing; signaling molecules; species evolution; quorum quenching

群体感应是细菌细胞间化学通讯的一个过程, 依赖于细胞外信号分子的产生、检测以及响应(Mukherjee et al, 2019)。细菌群体通过本底表达产生一定量的信号分子并运出细胞外, 随着细菌细胞密度的增加, 信号分子浓度也会随之升高, 当周围环境中信号分子浓度达到阈值时便会引发群体感应, 在群体水平调控基因表达(图1)。这个过程可以使群体内大部分成员的行为同步化, 实现个体无法完成的生理功能或行为, 如生物发光、毒力因子表达、次级代谢产物合成以及生物膜形成等(De Kievit et al, 2000; Barnard et al, 2007; Scholz et al, 2017; Whiteley et al, 2017)。
图1 群体感应示意图

Fig. 1 Schematic diagram of quorum sensing

根据信号分子的不同, 目前主要划分为7种群体感应通路。在革兰氏阳性细菌中, 成熟的oligopeptides信号分子可以被细胞膜上的受体蛋白识别, 或通过转运系统进入细胞内并与细胞内受体蛋白结合, 调控受体蛋白的构象或活性引发细胞的生理反应(Monnet et al, 2016; Wu et al, 2020)。其余6种信号分子通路均分布于革兰氏阴性细菌中(表1), 分别为在弧菌中首次发现的AHL、AI-2和CAI-1信号分子通路(Eberhard et al, 1981; Chen et al, 2002; Higgins et al, 2007), 在假单胞菌中发现的PQS信号分子通路(Pesci et al, 1999), 在肠出血性大肠杆菌中发现的AI-3信号分子通路(Sperandio et al, 2003), 以及在黄单胞菌中发现的DSF信号分子通路(Barber et al, 1997)。不同信号分子的受体在细胞内的分布不同, 其中AI-2、CAI-1和AI-3与细胞膜上相应的受体结合而改变受体的活性(Ng et al, 2011; Moreira et al, 2016; Wang Yang et al, 2019), AHL和PQS被细胞内受体识别(Cao et al, 2001; Miller et al, 2001), 而DSF既可以被细胞膜上受体RpfCG识别, 也可以与细胞内受体RpfR结合(Wang Fangfang et al, 2019)。
表1 革兰氏阴性菌群体感应通路

Tab. 1 Quorum sensing pathway of gram-negative bacteria

合成酶 信号分子 受体蛋白 模式菌株 参考文献
LuxI AHL LuxR 费氏弧菌 Aliivibrio fischeri Eberhard et al, 1981
LuxS AI-2 LuxPQ/LsrB/RbsB 霍乱弧菌 Vibrio cholerae Bassler et al, 1993
CqsA CAI-1 CqsS 霍乱弧菌 Vibrio cholerae Miller et al, 2002
PqsA/B/C/D/E/H PQS PqsR 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa Pesci et al, 1999
LuxS AI-3 QseBC/QseEF 大肠杆菌 Escherichia coli O157:H7 Sperandio et al, 2003
RpfF DSF RpfCG/RpfR 野油菜黄单胞菌 Xanthomonas campestris Barber et al, 1997
群体感应通过调控细菌的毒性、产孢、运动、蛋白水解酶的产生、肽类抗生素的合成、生物膜形成以及荧光产生等过程, 提高细菌适应生境的能力(Lee et al, 2013)。此外, 细菌个体还可以通过产生并分泌公共产物从而利于群体发展(Rainey et al, 2003; West et al, 2006), 或通过合成并分泌毒素来抑制其他种属细菌的生长(Hibbing et al, 2010; Cornforth et al, 2013)。上述过程均需要细菌个体合成并分泌信号分子, 这对于个体而言是一个耗能的过程, 亲缘选择理论可以解释细菌细胞存在群体感应这种利他主义行为。具体来说, 只有当个体感知到环境中有充足的营养物质以及有足够多的细菌细胞数量才会引发群体感应, 通过使更多的微生物细胞聚集过来并利用营养物质生长繁殖, 从而间接地将个体基因传递下去(Whiteley et al, 2017)。
群体感应有许多应用价值, 主要体现在开发群体感应淬灭剂, 用于治疗细菌感染以及合成生物学中的基因回路设计。目前应对病原菌的感染, 主要通过抗生素治疗, 由于抗生素有很强的选择压力, 极易导致耐药菌的产生, 因此急需挖掘新的抗生素用于治疗耐药菌。但是在过去的50年里很少有新的抗生素被发现, 开发药物的途径也非常有限(Hancock, 2014)。许多重要的植物、动物和人类的病原体都是通过群体感应调节毒力因子的产生(Papenfort et al, 2016), 因此防止病原体产生毒力因子是控制细菌性疾病的一种重要替代策略。近年来一个重要的研究领域就是开发群体感应干扰剂, 通过抑制毒力因子的产生来阻断感染(Defoirdt, 2018)。群体感应干扰剂可以是天然产物或化学合成产物, 用来抑制信号分子合成酶、受体或信号转导蛋白的活性; 也可以是使信号分子失活的酶; 或者是用来隔离信号分子并诱导免疫反应的抗体。群体感应干扰的优势在于它不杀死病原体, 不会造成严酷的选择压力, 从而最大限度地降低耐药性产生的风险(von Bodman et al, 2008)。在合成生物学领域, 根据信号分子浓度达到阈值便会引发群体感应这一特征, 可以将群体感应调控元件设计成分子开关, 用于构建高产目的产物的工程菌株。例如最近的一项研究将AHL信号分子通路与糖酵解途径结合起来, 当细胞密度达到一定程度时引发AHL信号分子参与群体感应调控, 抑制糖酵解的主合成途径, 从而使能量代谢流往旁路转移, 提高了肌醇和葡萄糖酸的产量(Gupta et al, 2017; Stephens et al, 2020)。
弧菌属细菌是人和水产养殖中重要的病原菌, 由于耐药菌株的出现, 传统抗生素治疗效果愈发不显著。弧菌获得耐药基因后可以通过水平基因转移传递到其他细菌中, 而且水环境是发生水平基因传递的最佳场所, 因而治疗难度增大(郑林 等, 2019)。近年来, 靶向群体感应通路的抗毒力因子药物研发被认为是解决细菌耐药问题的一个潜在方向。虽然在个别弧菌菌株中发现了AHL、AI-2和CAI-1三种信号分子通路, 但目前还没有针对弧菌属的群体感应通路分布情况进行统计的相关报道, 因此有必要调查所有已知的革兰氏阴性菌的6种群体感应通路在这个属中分布的情况, 为后续针对弧菌的群体感应淬灭剂研发、药物靶点选择等提供信息。

1 实验方法

1.1 46株全测序弧菌的基因组信息整理

从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载弧菌属中已全基因组测序的菌株信息, 同一物种只选择一个代表菌株进行分析, 最终确定共有46株弧菌物种的基因组需要进行下载以及后续分析(表2)。
表2 菌株信息

Tab. 2 Strain information

物种名称 菌株 基因组编号 基因组大小/Mb 编码序列数目/个
Vibrio alfacsensis CAIM 1831 GCA_003544875.1 4.91 3830
Vibrio alginolyticus FA2 GCA_011801435.1 5.25 4598
Vibrio anguillarum VIB12 GCA_002310335.1 4.90 4091
Vibrio antiquarius EX25 GCA_000024825.1 5.09 4451
Vibrio aphrogenes CA-1004 GCA_002157735.2 3.38 2881
Vibrio astriarenae HN897 GCA_010587385.1 4.80 4176
Vibrio breoganii FF50 GCA_001677275.1 4.49 3978
Vibrio campbellii BoB-90 GCA_002906455.1 6.17 5407
Vibrio casei DSM 22364 GCA_002218025.2 4.14 3601
Vibrio chagasii ECSMB14107 GCA_004022545.1 5.55 4448
物种名称 菌株 基因组编号 基因组大小/Mb 编码序列数目/个
Vibrio cholerae 10432-62 GCA_000969265.1 4.08 3546
Vibrio cidicii 2756-81 GCA_009763805.1 4.75 3492
Vibrio cincinnatiensis 2070-81 GCA_009763705.1 3.81 3284
Vibrio coralliilyticus RE22 GCA_003391375.1 5.78 5064
Vibrio cyclitrophicus ECSMB14105 GCA_005144905.1 5.07 4283
Vibrio diabolicus FA3 GCA_011801455.1 5.11 4501
Vibrio europaeus NPI-1 GCA_013154935.1 5.45 4782
Vibrio fluvialis FDAARGOS_104 GCA_001558415.2 4.83 4338
Vibrio furnissii FDAARGOS_777 GCA_006364355.1 4.99 4466
Vibrio gazogenes ATCC 43942 GCA_002196515.1 4.79 4070
Vibrio harveyi ATCC 33843 GCA_000770115.2 5.88 5166
Vibrio hyugaensis 090810a GCA_002906655.1 5.61 4845
Vibrio jasicida 090810c GCA_002887615.1 5.99 5188
Vibrio mediterranei QT6D1 GCA_002214345.1 5.81 5146
Vibrio metoecus 08-2459 GCA_009665275.1 3.99 3518
Vibrio metschnikovii 9502-00 GCA_009763765.1 3.62 3118
Vibrio mimicus SCCF01 GCA_001767355.1 4.48 3925
Vibrio natriegens CCUG 16371 GCA_001680045.1 5.16 4451
Vibrio navarrensis 2462-79 GCA_009763725.1 4.78 4093
Vibrio nigripulchritudo SFn1 GCA_000801275.1 6.32 5545
Vibrio owensii XSBZ03 GCA_002021755.1 5.89 5112
Vibrio panuliri JCM 19500 GCA_009938205.1 4.86 4235
Vibrio ponticus DSM 16217 GCA_009938225.1 4.80 4098
Vibrio parahaemolyticus VPD14 GCA_004006515.1 5.17 4531
Vibrio qinghaiensis Q67 GCA_002257545.1 4.02 3373
Vibrio rotiferianus B64D1 GCA_002214395.1 5.28 4593
Vibrio rumoiensis FERM P-14531 GCA_002218045.2 4.21 3605
Vibrio scophthalmi VS-12 GCA_001685465.1 4.93 4206
Vibrio sp 2521-89 GCA_002216685.1 4.12 3539
Vibrio splendidus BST398 GCA_003345295.1 5.51 4582
Vibrio taketomensis C4III291 GCA_009938185.1 4.36 3526
Vibrio tapetis CECT4600 GCA_900233005.1 5.73 4800
Vibrio tasmaniensis LGP32 GCA_000091465.1 4.97 4169
Vibrio tritonius JCM 16456 GCA_001547935.1 5.22 4549
Vibrio tubiashii ATCC 19109 GCA_000772105.1 5.54 4946
Vibrio vulnificus 07-2444 GCA_009764115.1 5.23 4554

1.2 生物信息学分析

根据最初报道AHL、AI-2、CAI-1、PQS、AI-3和DSF群体感应通路模式菌株中的合成酶以及受体蛋白的一级结构序列信息(表1), 确定上述6种群体感应通路各自用来做比对(BLAST)搜索的查询序列(query)(表3)。本文通过BlastP 2.9.0进行同源蛋白比对分析(Altschul et al, 1997; Schäffer et al, 2001), 运用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和HHpred(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred)生物信息数据库进行蛋白二级结构预测(Letunic et al, 2018; Zimmermann et al, 2018), 分析和观察是否含有相应的合成酶以及受体蛋白。此外, 在模式菌株中编码合成酶以及受体蛋白的基因在基因组上位置相邻, 通常是上下游关系, 可以预测两个基因的功能相关性。因此对含有相应合成酶以及受体蛋白同源序列的菌株, 如果各自的编码基因在基因组上的位置相邻, 可认为该菌含有这种群体感应通路; 如果合成酶和受体的编码基因不相邻, 而且受体的底物识别结构域未鉴定或者不具备序列特异性, 则认为该菌只是存在潜在的编码基因, 但不能确定相应群体感应通路的存在。
表3 查询序列蛋白的结构域组成

Tab. 3 Domain composition of the query protein

注: Acetyltransf_5表示乙酰转移酶结构域(Acetyltransferase domain); Autoind_bind表示自诱导剂结合结构域(Autoinducer binding domain); HTH_LUXR表示Lux操纵子结构域(Helix_turn_helix, Lux Regulon domain); LuxS表示S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶结构域(S-ribosylhomocysteine lyase domain); Peripla_BP_4表示周质结合蛋白结构域(Periplasmic binding protein domain); LuxQ表示LuxQ周质空间结构域(LuxQ Periplasmic domain); HisKA表示组氨酸激酶结构域(Histidine kinases domain); HATPase_c表示组氨酸激酶样ATP酶的C端结构域(Histidine kinase-like ATPases C-terminal domain); REC表示CheY同源受体结构域(CheY-homologous receiver domain); AMP_binding表示AMP结合酶结构域(AMP_binding enzyme domain); AMP_binding_C表示AMP结合酶的C端结构域(AMP_binding enzyme C-terminal domain); ACP_syn_Ⅲ表示酰基载体蛋白合成酶Ⅲ结构域(Acyl carrier protein synthase III domain); ACP_syn_Ⅲ_C表示酰基载体蛋白合成酶Ⅲ的C端结构域(Acyl carrier protein synthase III C terminal domain); FAD_binding_3表示单加氧酶结构域(Monooxygenase domain); HTH_1表示螺旋转角螺旋结构域(Helix-turn-helix domain); LysR_substrate表示LysR底物结合结构域(LysR substrate binding domain); Aminotran_1_2表示转氨酶结构域(Aminotransferase domain); Trans_reg_C表示转录调节蛋白的C端结构域(Transcriptional regulatory protein C-terminal domain); 2CSK_N表示双组分系统中激酶的N端结构域(Two-component sensor kinase N-terminal domain); AAA表示与多种细胞活性相关的三磷酸腺苷酶结构域(ATPases associated with a variety of cellular activities domain); ECH_1表示烯醇式辅酶A水合酶/异构酶结构域(Enoyl-CoA hydratase/isomerase domain); HPT表示组氨酸磷酸转移酶结构域(Histidine Phosphotransfer domain); HDc表示金属依赖的磷酸水解酶结构域(Metal dependent phosphohydrolases domain); FI表示RpfF相互作用结构域(RpfF interaction domain); PAS表示PAS结构域(PAS domain); GGDEF表示双鸟苷酸环化酶结构域(Diguanylate cyclase domain); EAL表示双鸟苷酸磷酸二酯酶结构域(Diguanylate phosphodiesterase domain)

1.3 构建系统进化树

UBCG程序包共采用92个蛋白进行比对、串联、构建进化树, 这92个蛋白在Na等(2018)的研究中有列出。UBCG程序包选择这92个蛋白的标准是: 广泛存在、高度保守且在基因组中是单拷贝的。这些蛋白主要参与DNA复制、转录、翻译等重要的生化过程, 包括核糖体蛋白、DNA连接酶、DNA重组和修复蛋白、RNA聚合酶等。
基于上述92个保守蛋白, 用UBCG程序包获取并构建本文确定的46株弧菌的多保守蛋白串联序列, 同时以此作为物种进化的分子标记。选择与弧菌属亲缘关系相近的同一个纲中的另一个属Thiomicrospira作为外群, 利用MEGA7.0的Pairwise Distances计算进化距离, 选择泊松修正模型(Poisson correction model), 运用最大似然法(Maximum-likelihood)计算并构建系统进化树(Kumar et al, 2016)。除了氨基酸序列比对过程中的缺失位置采用全删除的方式以外, 其余所有分析均采用默认参数。

2 结果与分析

2.1 构建系统进化树

基于92个串联保守蛋白序列, 选择与弧菌属亲缘关系相近的同一个纲中的另一个属Thiomicrospira作为外群, 对46株已全基因组测序的弧菌构建系统发育进化树。从构建的系统进化树(图2)可以看出, 所有弧菌的分支长度相似, 进化距离较短。该进化树展示的不同物种的分支关系为下文的群体感应通路分析提供了一个系统发育框架, 可以用来推理每个通路的分布特点和进化过程。
图2 46株弧菌的系统进化树

线段0.05代表1/200进化距离单位; 分支上的数值为自举1000次的结果; 分支上数值的阈值设置为70, 低于70不显示; 左侧进化树上用红色字体标注表明在Vibrio cholerae中分别发现了AI-2和CAI-1两种信号分子通路; 进化树选择目前已全基因组测序的3株Thiomicrospira作为进化树的外枝。右侧表格中蓝色、红色和绿色方格分别表示目的菌株含有对应的AHL、AI-2或CAI-1信号分子通路, 黄色方格代表根据进化树上与目的菌株亲缘关系相近的其他弧菌含有AI-2或CAI-1信号分子通路而推测目的菌株可能也含有相应的信号通路, 但该通路的合成酶和受体编码基因在基因组上没有相邻分布; 白色方格表示不含该种信号通路的菌株

Fig. 2 Phylogenetic tree of 46 Vibrio species

2.2 46株全基因组测序弧菌各群体感应通路的统计情况

2.2.1 AHL信号分子群体感应通路

合成酶LuxI将信号分子前体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)乙酰化, 最终生成酰化高丝氨酸内酯(Acylated Homoserine Lactones, AHL)信号分子。受体蛋白LuxR是转录调控因子, 结合AHL信号分子后调控相关基因表达(Miller et al, 2001)。
根据是否含有LuxI和LuxR的同源蛋白以及编码这两种蛋白的基因在基因组上的位置是否相邻来进行比对分析, 发现共有5株弧菌含有AHL群体感应通路(表4)。结合图2的系统进化树, 发现其中Vibrio cincinnatiensis和Vibrio metschnikovii的亲缘关系相近, Vibrio fluvialis和Vibrio furnissii形成一个独立的分支, 而Vibrio mediterranei与前述4株弧菌的亲缘关系较远。整体来看, AHL通路在弧菌中属零星分布, 可能通过水平基因转移获得。将找到的同源蛋白通过在线BLAST比对, 发现最相似的同源蛋白中除了来自于上述5株弧菌外, 其余均来源于Aliivibrio属的物种, 因此推测这5株弧菌含有的AHL信号通路可能来源于Aliivibrio属, 该属与弧菌属的16S rRNA基因的序列相似性高达94.6%。此外, 基于gyrB、rpoA、recA、pyrH和编码16S rRNA这5个基因构建系统进化树, 发现Aliivibrio属与弧菌属聚类在一起的置信度达85, 表明两个属的亲缘关系相近(Urbanczyk et al, 2007)。但目前无法确定这两类菌的进化次序, 本次调查的46个弧菌属物种中只有5个物种有AHL通路, 而Aliivibrio属有超过一半的物种含有该通路。根据它们的分布情况, 推测弧菌属的AHL通路很有可能来自水平基因的转移而非祖先细胞的垂直传递。
表4 AHL信号分子群体感应通路统计

Tab. 4 Statistics of quorum sensing pathways directed by AHL signal

注: 表格中橙色和黄色箭头分别代表AHL信号通路的合成酶和受体蛋白的编码基因, 箭头上标注相应基因的locus tag编号

本文的比对分析还发现Vibrio anguillarum只含有LuxI同源蛋白, 而Vibrio coralliilyticus则只含有LuxR同源蛋白, 其余均不含两种同源蛋白。

2.2.2 AI-2信号分子群体感应通路

合成酶LuxS催化前体SRH(S-ribosylhomocysteine)生成AI-2信号分子。受体蛋白LuxPQ结合AI-2后调控相关基因的表达(Ng et al, 2009; Pereira et al, 2013), 或者受体蛋白LsrB/RbsB转运AI-2进入细胞内并引发群体感应相关基因的表达(Pereira et al, 2009; Novak et al, 2010)。
分析发现46株弧菌中只有3株弧菌没有AI-2群体感应通路, 分别为Vibrio alfacsensis、Vibrio aphrogenes和Vibrio taketomensis, 而其他弧菌均有该通路。结合图2的系统进化树, 发现与V. aphrogenes亲缘关系相近的物种都含有AI-2群体感应通路, 且本地BLASTp比对分析能够在该基因组找到相应的合成酶LuxS以及受体蛋白RbsB的同源蛋白的编码基因。由于rbsB不在rbs开放阅读框内, 因此推测V. aphrogenes基因组编码的RbsB可能是潜在的受体蛋白, 该菌株可能含有AI-2群体感应通路。另外两株弧菌没有相应的受体蛋白, 故推测没有AI-2群体感应通路(表5)。
表5 AI-2信号分子群体感应通路统计

Tab. 5 Statistics of quorum sensing pathways directed by AI-2 signal

注: 表格中的粉色箭头代表AI-2信号通路的合成酶编码基因; 蓝色、绿色和橙色箭头分别代表不同受体蛋白的编码基因, 其中蓝色箭头代表受体蛋白LuxP, 绿色箭头代表受体蛋白LuxQ, 橙色箭头代表受体蛋白RbsB, 箭头上标注的是相应基因的locus tag编号; 灰色箭头代表rbs开放阅读框的其他相关编码基因。双斜线(断开)表示基因间不连续, 双斜线两侧下方数字分别表示基因在基因组上的位置

2.2.3 CAI-1信号分子群体感应通路

合成酶CqsA催化前体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)生成CAI-1信号分子(Kelly et al, 2009), 受体蛋白CqsS与CAI-1结合后调控群体感应的相关基因表达(Wei et al, 2012)。
根据是否含有CqsA和CqsS的同源蛋白以及编码这两种蛋白的基因在基因组上位置是否相邻来进行统计, 发现有31株弧菌同时含有两种同源蛋白, 且两种同源蛋白的编码基因在基因组上位置相邻。此外, 有11株弧菌虽然含有相应的同源蛋白, 但是其编码基因在基因组上位置不相邻, 说明可能是潜在的受体。比如, 与Vibrio breoganii和Vibrio chagasii亲缘关系相近的物种都含有CAI-1群体感应通路, 与Vibrio astriarenae和Vibrio natriegens这两株弧菌亲缘关系相近的物种也都含有CAI-1信号分子通路, 由此推测这4株弧菌的CqsS同源蛋白虽然与CqsA同源蛋白在基因组上位置不相邻, 但是它们有可能组成一个完整的CAI-1信号转导通路。因此, 最终本文推测有35株弧菌存在CAI-1群体感应通路(表6)。
表6 CAI-1信号分子群体感应通路统计

Tab. 6 Statistics of quorum sensing pathways directed by CAI-1 signal

注: 表格中的橙色和绿色箭头分别代表CAI-1信号通路的合成酶和受体蛋白的编码基因, 箭头上标注相应基因的locus tag编号; 双斜线(断开)表示基因间不连续, 双斜线两侧下方数字分别表示基因在基因组上的位置

2.2.4 PQS、AI-3、DSF信号分子群体感应通路

合成酶PqsABCDH催化邻氨基苯甲酸生成PQS信号分子, 受体蛋白PqsR结合PQS后促进毒力因子等相关基因的表达。以模式菌株Pseudomonas aeruginosa的PqsA、PqsB、PqsC、PqsD作为查询序列, 对46株已全基因组测序的弧菌进行本地BLASTp比对分析, 结果发现仅能找到第一步反应的合成酶PqsA的同源蛋白, 缺失其他合成酶PqsBCD的同源蛋白。此外, 受体蛋白PqsR属于LysR家族调控因子, 该蛋白的特征是含有1个DNA结合结构域和1个LysR底物结合结构域, 在基因组中有非常多的拷贝, 故无法通过序列相似性判断是否能够结合PQS分子。而且, 在PqsA对应同源蛋白的编码基因的上、下游也没有发现LysR家族蛋白, 与模式菌株中pqsABCDR基因成簇存在的现象不符。基于以上发现, 本文推测这46株弧菌均没有PQS信号分子通路。
AI-3信号分子的合成酶也是LuxS, 两套双组分调控系统QseBC和QseEF结合AI-3后共同调控基因组上致病岛相关基因的表达。根据是否含有合成酶LuxS以及受体蛋白QseBC、QseEF对应的同源蛋白, 对46株弧菌进行分析, 发现基因组虽然都含有编码LuxS合成酶的相关基因, 但是不能同时找到编码两套完整的双组分调控系统的相关基因, 导致信号无法传递下去, 因此推测这46株弧菌均没有AI-3(Autoinducer-3)信号分子通路。
合成酶RpfF催化β-hydroxyl-acyl-ACP生成DSF信号分子, 随后DSF与受体蛋白RpfCG或RpfR结合并调控相关基因的表达。根据是否含有RpfF/RpfCG或者RpfF/RpfR相应的同源蛋白, 以及编码基因在基因组上位置是否相邻, 对46株弧菌进行分析。由于RpfF只含有ECH_1结构域, 与脂肪酸氧化复合物亚基FabH的结构域组成相似, 因此只有ECH_1结构域的蛋白无法区分是RpfF还是FabH。此外, 所有基因组都没有找到受体RpfC和RpfR的同源蛋白, 因此推测46株弧菌均没有DSF信号分子群体感应通路。

3 总结与讨论

弧菌是人和水产养殖中重要的病原菌, 面对愈发严峻的耐药弧菌问题, 急需寻找其他治疗病原菌的方法。近年来, 靶向群体感应通路的抗毒力因子药物研发被认为是解决弧菌耐药问题的一个重要策略。本文的分析结果发现, 弧菌属细菌普遍存在AI-2和CAI-1这两种信号分子通路, 表明开发针对弧菌的群体感应淬灭剂应以这两种信号分子介导的通路作为靶点。
此外, 本文研究结果表明仅有部分弧菌含有AHL信号通路, 而全部弧菌都没有PQS、AI-3以及DSF信号通路。对含有的3种信号通路进行比较, 发现AHL、CAI-1两种信号分子的前体SAM以及AI-2信号分子的前体SRH均为细胞甲基化循环通路中重要的中间体。由于甲基化循环途径在细胞中普遍存在, 因此这些信号分子的前体能够持续生成, 而且跟细胞的基础代谢水平相关。弧菌属没有的DSF信号分子的前体来源于脂肪酸合成途径的中间体。根据表3显示, 信号分子的受体蛋白有的是双组分调控系统的组成部分, 有的含有GGDEF和EAL结构域, 参与调控细胞内c-di-GMP水平。因此, 推测AHL、AI-2、CAI-1和DSF这4种信号分子最初可能仅是细胞代谢的中间产物, 后来进化出专门的受体蛋白识别该类分子, 进而演化为一种信号, 引发下游的细胞反应, 并调控相关基因的表达(Winzer et al, 2002a, b; Taga et al, 2003; Ng et al, 2009; Mitra et al, 2016)。
结合系统进化树, 本文发现弧菌群体感应通路的分布与物种进化有关, 含有同种信号分子通路的弧菌间亲缘关系相近。比如Vibrio fluvialis和Vibrio furnissii同时含有AHL、AI-2和CAI-1这3种信号分子通路, 在进化树中两株弧菌间的进化距离也相近。根据对弧菌中找到的3种群体感应通路的进一步分析, 推测AHL信号分子通路可能来源于Aliivibrio属, 它通过水平基因转移进入部分弧菌基因组中; 而AI-2和CAI-1两种信号分子通路可能进化自弧菌的祖先细胞, 通过垂直传递, 大部分弧菌都保留了该通路。
本文在分析过程中主要遇到以下两个难点: 其一, 对于CAI-1和DSF两种信号分子通路, 由于其合成酶CqsA和RpfF分别为氨基转移酶和酰基合成酶, 这两种酶在细菌细胞中普遍存在多拷贝, 因此分析过程中无法确定那些受体的编码基因不在基因相邻位置的弧菌是否存在上述两种信号分子通路。本研究已整理出这些弧菌信息, 为下一步的实验验证提供潜在的靶蛋白。比如, 在模式菌株Vibrio cholera N16961中存在3个大小相近且只含有Aminotran_1_2结构域的氨基转移酶, Miller等人(2002)通过Tn转座子文库筛选确定了模式菌株中的合成酶CqsA; 在模式菌株Xanthomonas campestris中存在5个大小相似且只含有ECH_1结构域的酰基合成酶, 通过敲除、回补实验证实rpfF基因是DSF信号分子合成所必需的, 从而确定了模式菌株中的合成酶RpfF(Tang et al, 1991; Barber et al, 1997); 至于其他同源蛋白是否能合成新的信号分子则仍有待实验验证。其二, 对于AI-3信号分子通路, 受体蛋白QseBC和QseEF是双组分调控系统, 目前关于受体蛋白与信号分子结合的结构域以及具体的结合位点的研究较少, 且细菌细胞中普遍存在很多拷贝的双组分调控系统(Groisman, 2016; Rajeev et al, 2020), 因此无法确定本地BLASTp比对分析发现的双组分系统是否真实参与细菌细胞群体感应调控过程。针对这些问题, 需要有更多实验证据支持, 最终获得准确的关于弧菌群体感应通路分布情况的统计结果, 为后续针对弧菌而开发群体感应淬灭剂以及药物靶点的选择提供信息。

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