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热带海洋学报 >

2022 , Vol. 41 >Issue 3: 186 - 190

DOI: https://doi.org/10.11978/2021089

海洋生物学

南海礁栖海藻共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41 403次级代谢产物研究

  • 叶禹秀 , 1, 2 ,
  • 罗小卫 1 ,
  • 杨斌 2, 3 ,
  • 林秀萍 2 ,
  • 刘永宏 2 ,
  • 周雪峰 , 2, 3
展开
  • 1.广西中医药大学海洋药物研究院, 广西 南宁 530200
  • 2.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省海洋药物重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
  • 3.海南省热带海洋生物技术重点实验室, 三亚中科海洋研究院, 海南 三亚 572024
周雪峰。email:

叶禹秀 (1996—), 女, 广西壮族自治区贵港市人, 硕士研究生, 从事海洋微生物天然产物研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2021-07-12

  修回日期: 2021-09-05

  网络出版日期: 2021-09-06

基金资助

海南省重大科技计划项目(ZDKJ202018)

国家自然科学基金项目(U20A20101)

国家自然科学基金项目(81973235)

收起

Study on the secondary metabolites of reef habitat algae-derived fungus Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403 from the South China Sea

  • YE Yuxiu , 1, 2 ,
  • LUO Xiaowei 1 ,
  • YANG Bin 2, 3 ,
  • LIN Xiuping 2 ,
  • LIU Yonghong 2 ,
  • ZHOU Xuefeng , 2, 3
Expand
  • 1. Institute of Marine Drugs, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China
  • 2. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 3. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Marine Biology Technology, Sanya Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Sanya 572024, China
ZHOU Xuefeng. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2021-07-12

  Revised date: 2021-09-05

  Online published: 2021-09-06

Supported by

Finance Science and Technology Project of Hainan Province(ZDKJ202018)

National Natural Science Foundation of China(U20A20101)

National Natural Science Foundation of China(81973235)

Fold

摘要

研究南海礁栖腔节藻Coelarthrum sp.共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403的次级代谢产物。采用中压正相柱层析色谱法和半制备高效液相色谱法, 对真菌发酵产物进行分离纯化, 制备获得6个次级代谢产物单体化合物, 使用核磁共振、质谱等波谱学方法, 结合其理化性质以及文献数据对比, 分别鉴定为: gamahorin (1)、microsporaline C (2)、7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (3)、demethyl nectriapyrone A (4)、4-hydroxybenzaldehyde (5)和4-hydroxyphenethyl acetate (6)。这6个化合物均为首次从该菌株发现, 其中化合物1、2、5和6是首次从海洋动植物共附生真菌中发现。抗菌活性筛选显示其中化合物3对白色念珠菌有明显抑制活性。

关键词： 海藻共附生真菌; Pestalotiopsis neglecta; 次级代谢产物; 抗菌活性

本文引用格式

叶禹秀 , 罗小卫 , 杨斌 , 林秀萍 , 刘永宏 , 周雪峰 . 南海礁栖海藻共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41 403次级代谢产物研究[J]. 热带海洋学报, 2022 , 41(3) : 186 -190 . DOI: 10.11978/2021089

Abstract

We research on the secondary metabolites from the fungus Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403, derived from the coral reefs habitat algae Coelarthrum sp. in the South China Sea. Six pure secondary metabolites were isolated and purified by medium pressure normal phase column chromatography and semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC) in the fungal culture broth. The compounds were identified and elucidated as gamahorin (1), microsporaline C (2), 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (3), demethyl nectriapyrone A (4), 4-hydroxybenzaldehyde (5), 4-hydroxyphenethyl acetate (6) by nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), mass spectrum (MS), and literature analysis. All compounds were obtained from this strain for the first time, and compounds 1, 2, 5, and 6 were discovered from marine-derived fungus for the first time. In the antibacterial tests, compound 3 was revealed to have significant inhibitory activity against Candida albicans.

Key words： Algae-derived fungus; Pestalotiopsis neglecta; secondary metabolites; antibacterial activity; South China Sea

为适应复杂的海洋生态环境, 海藻共附生微生物可产生独特的次生代谢产物参与宿主的防御体系, 帮助宿主抵抗外界致病菌和病毒的侵害, 以及其他海洋生物的攻击。这些独特的次生代谢产物往往骨架新颖、活性显著, 为新型海洋药物的研发提供宝贵资源(杨曦亮 等, 2020)。拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)作为一类分布较为广泛的内生真菌, 其产生的次级代谢产物具有结构新颖性、生物活性丰富的特点, 很多具有较强的抗肿瘤、抗真菌、抗病毒活性(陈霈雯 等, 2019; 马丽丽 等, 2021)。对陆地植物和沿海红树植物共附生来源拟盘多毛孢属真菌的代谢产物研究相对较多, 如冼嘉韵 等(2017)从南海红树林植物桐花树来源的内生杂色拟盘多毛孢属真菌中分离得到具有良好抗肿瘤活性化合物pestalachlorides C和抗炎活性的 pestalachlorides B。对海洋动植物来源的该属真菌代谢产物研究相对较少。本课题组前期从南海永兴岛海域采集的礁栖腔节藻属海藻(Coelarthrum sp.)中分离得到一株拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403, 已经从中分离鉴定6个具有较弱细胞毒性的天然产物, 2个具有较明显的COX-2抑制活性的二苯酮衍生物和1个可作为肝脏X受体α调节剂的天然产物(Wang et al, 2020a, b; Liang et al, 2021)。然而, 该礁栖海藻共附生真菌代谢产物非常丰富, 仍有不少代谢产物尚未分离鉴定。因此, 本研究在HPLC导向下对重新发酵的该菌株提取物进行化学成分研究, 定向分离纯化该菌株中尚未鉴定的代谢产物, 以期发现更多结构新颖或活性显著的天然产物, 为海藻来源拟盘多毛孢属真菌的药用活性成分挖掘提供重要依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超导核磁共振仪(瑞士Bruker公司AVANCE- 500 MHz); 质谱仪(Waters公司XEVO TQD); 高效液相色谱仪(日本岛津公司LC10AVP); 中压制备色谱(瑞士步琪LC3000); 旋转蒸发仪(东京理化N-1100D-WD); 电子天平(德国塞多利斯股份公司BS110S); 数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限公司KQ-250DB); 三层多功能摇床(北京博宇宝威实验设备有限公司HYG-CXI型); 自动蒸汽灭菌锅(合肥华泰医疗器械有限公司LX-B100L型); 半制备色谱柱: YMC-Pack, ODS-A, 250×10mm, S-5μM,12nm(YMC公司); 薄层层析硅胶GF-254和柱层析硅胶200-300目(烟台江友硅胶有限公司); HPLC色谱纯试剂: 甲醇、乙腈(瑞典Oceanpark公司); 实验分析纯试剂: 石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等(天津大茂化学试剂厂)。

1.2 菌种来源

菌株分离自采集于南海永兴岛附近海域珊瑚礁的腔节藻属海藻(Coelarthrum sp.), 鉴定为拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403(Wang et al, 2020a)。海藻和真菌菌株分别由中国科学院南海海洋研究所连喜平博士和林秀萍博士鉴定, 菌种样本保存在中国科学院南海海洋研究所海洋微生物研究中心(编号SCSIO41403)。

1.3 提取分离

菌株发酵过程见前期报道的方法(Wang et al, 2020a)。获得的乙酸乙酯浸膏采用中压色谱柱进行分离, 用100~200目硅胶拌样, 经中压制备色谱分离(石油醚:CH2Cl2 100:0~1:1)梯度洗脱后得到41个馏分(Fr.1~Fr.41)。在高效液相分析导向下, 定向分离之前尚未发现的代谢产物。Fr.4经半制备高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分离纯化得到化合物1(3.9mg), Fr.26经半制备高效液相(CH3CN:H2O 34:66)分离纯化得到化合物2(13.5mg)、化合物5(5.9mg)和化合物6(3.5mg); Fr.7经半制备高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分离纯化得到化合物3(10.7mg); Fr.24经半制备高效液相(CH3CN:H2O 70:30)纯化得到化合物4(9.1mg)。化合物1~6结构如图1所示。
图1 化合物1—6的化学结构

Fig. 1 The chemical structures of compounds 1-6

1.4 抗菌活性实验

供抗菌活性筛选的菌株为白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)。采用K-B法(Kirby-Bauer test)测定分离得到的6个化合物对白色念珠菌的抑制活性(谭才邓 等, 2016)。
供试菌的准备: 将白色念珠菌菌种接种到LB琼脂培养基上活化24~48h, 然后接种于30mL LB液体培养基中, 置于恒温震荡摇床中(28℃, 180r·min-1), 培养24h。
试验平板的准备: 先往已冷却至50℃左右的LB半固体培养基中注入3mL菌液, 混合均匀, 倾注平板约30mL, 静置待用。
抗菌活性测定: 将无菌干燥的空白滤纸片(直径6mm)分别用移液枪滴加药物原液和对照溶液, 每张滤纸片含待测待测化合物分别为5µg, 阴性对照为甲醇, 阳性对照为制霉菌素(nystatin)。将各含药纸片贴加于试验平板, 37℃恒温培养18~24h, 测定其纸片周围抑菌圈直径的大小。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1: 白色粉末, 3.9mg, 分子式C12H14O3; $\left[ \text{ }\!\!\alpha\!\!\text{ } \right]_{\text{D}}^{25}$+1.20°(c 1.0, MeOH)。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 11.40 (1H, s, 8-OH), 7.32 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 6.67 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 4.47 (1H, dq, J = 6.6,7.0 Hz, H-3), 2.85 (1H, dq, J = 7.0,7.1 Hz, H-4), 2.25 (3H, s, H-11), 1.47 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-9), 1.34 (3H, d, J = 7.1 Hz, H-10); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 169.6 (C, C-1), 160.4 (C, C-8), 141.1 (C, C-4a), 137.0 (CH, C-6), 125.1 (C, C-7), 115.7 (CH, C-5), 105.1 (C, C-8a), 81.0 (CH, C-3), 37.1 (CH, C-4), 19.6 (CH3, C-9), 17.1 (CH3, C-10), 15.4 (CH3, C-11)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴定该化合物为gamahorin(Liao et al, 2021)。
化合物2: 紫色粉末, 13.5mg, 分子式C12H14O4; $\left[ \text{ }\!\!\alpha\!\!\text{ } \right]_{\text{D}}^{25}$+11.83°(c 1.0, MeOH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 11.55 (1H, s, 8-OH), 7.49 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 6.78 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 4.73 (2H, s, H-11), 4.50 (1H, dq, J = 6.5,6.9 Hz, H-3), 2.88 (1H, dq, J = 6.9,7.0 Hz, H-4), 1.47 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-9), 1.35 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-10); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 169.5 (C, C-1), 160.2 (C, C-8), 143.4 (C, C-4a), 135.4 (CH, C-6), 127.8 (C, C-7), 116.5 (CH, C-5), 107.5 (C, C-8a), 81.3 (CH, C-3), 60.7 (CH2, C-11), 37.4 (CH, C-4), 19.8 (CH3, C-9), 17.5 (CH3, C-10)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴定该化合物为microsporaline C(Liao et al, 2021)。
化合物3: 白色粉末, 10.7mg, 分子式C11H12O4; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 5.20 (2H, s, H-2), 3.76 (3H, s, 5-OMe), 2.19 (3H, s, 6-Me), 2.14 (3H, s, 4-Me); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 173.2 (C, C-1), 163.9 (C, C-5), 153.9 (C, C-7), 143.6 (C, C-3), 118.6 (C, C-6), 116.7 (C, C-4), 106.2 (C, C-8), 70.2 (CH2, C-2), 60.4 (O-CH3, 5-OMe), 11.5 (CH3, 4-Me), 8.7 (CH3, 6-Me)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴定该化合物为7-hydroxy-5-methoxy-4,6- dimethylphthalidc (Jia et al, 2015)。
化合物4: 白色粉末, 9.1mg, 分子式C10H12O3; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 6.70 (1H, q, J = 6.5 Hz, H-2'), 5.89 (1H, s, H-5), 5.44 (1H, s, H-3), 3.80 (3H, s, 4-OMe), 1.82 (3H, d, J = 7.0 Hz, 2′-Me) 1.80 (3H, s, 1′-Me); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 171.6 (C, C-4), 164.5 (C, C-2), 161.4 (C, C-6), 130.4 (CH, C-2′), 126.7 (C, C-1′), 97.3 (CH, C-5), 88.1 (CH, C-3), 56.0 (CH3, 4-OMe), 14.4 (CH3, 2′-Me), 12.2 (CH3, 1′-Me)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴定该化合物为pestalotiopyrones G (张宏岐 等, 2018)。
化合物5: 黄色粉末, 5.9mg, 分子式C7H6O2; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 9.88 (1H, s, H-7), 7.82 (2H, dd, J = 8.1,1.0 Hz, H-2,6), 6.96 (2H, dd, J = 8.1,1.0 Hz, H-3,5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 191.1 (CH, C-7), 161.3 (C, C-4), 132.5 (CH, C-2), 132.5 (CH, C-6), 130.2 (C,C-1), 116.1 (CH, C-3), 116.1 (CH, C-5)。以上数据与文献基本一致, 故鉴定该化合物为4-hydroxybenzaldehyde (田倩倩 等, 2010)。
化合物6: 淡黄色粉末, 5.9 mg, 分子式C10H12O3; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH ppm: 7.27 (1H, s, 4-OH), 7.09 (2H, dd, J = 8.0,1.0 Hz, H-2,6), 6.77 (2H, dd, J = 8.0,1.0 Hz, H-3,5), 4.24 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-8), 2.87 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-7), 2.05 (3H, s, H-10);13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 171.3 (C, C-9), 154.3 (C, C-4), 130.1 (CH, C-2), 130.1 (CH, C-6), 120.5(C, C-1),115.4 (CH, C-3), 115.4 (CH, C-5), 65.3 (CH2, C-8), 34.2 (CH2, C-7), 21.1 (CH3, C-10)。以上数据与文献基本一致, 故鉴定该化合物为4-羟基苯乙基乙酸酯 (韦玮 等, 2018)。

2.2 抗菌活性

通过观察试验平板发现化合物3(1mg·mL-1)对白色念珠菌有明显抑制活性, 其抑菌圈直径为25mm, 其他化合物无明显活性。阳性药nystatin (25mg·mL-1)抑菌圈直径为30mm。

3 讨论

本文对腔节藻海藻来源拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403的次级代谢产物进行了分离鉴定, 共分离出6个单体化合物, 为首次从该菌株发现, 其中化合物1、2、5和6是首次从海洋动植物(不含红树植物)共附生微生物中发现。根据文献报道, 化合物6对子宫颈癌细胞有显著抑制活性(关永强 等, 2014)。化合物3对Cox-B3和RSV有明显的抗病毒活性, 其IC50分别为39.0和78.0µmol·L-1(Jia et al, 2015)。本研究首次发现化合物3对白色念珠菌有明显抑制活性。
根据文献报道, 海藻共附生真菌代谢产物的生物活性主要集中在抗菌和抗肿瘤领域, 其次为抗氧化、抗炎等其他活性。这些活性天然产物的产生与特殊的生存环境及宿主的生长调节、化学防御等生命活动密切相关(杨曦亮 等, 2020)。海藻共附生真菌活性次级代谢产物研究虽已取得一定进展, 但其具体的代谢意义和特殊性, 以及与藻类宿主的微妙关系仍有待深入探究。对于拟盘多毛孢属真菌, 文献中陆地植物和沿海红树植物来源的代谢产物研究相对较多, 而对海洋来源比如海藻共附生来源的, 其代谢产物和活性化合物研究相对较少。本研究为海藻共附生拟盘多毛孢属真菌的代谢产物研究及其药用活性挖掘提供了参考。

参考文献

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