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热带海洋学报 >

2018 , Vol. 37 >Issue 3: 45 - 54

DOI: https://doi.org/10.11978/2017068

缢蛏多巴胺受体基因及其在损伤修复中的作用

  • 杜蕴超 , 1 ,
  • 谢淑媚 1 ,
  • 何圣耀 1 ,
  • 牛东红 , 1, 2 ,
  • 李家乐 1, 3
展开
  • 1. 上海海洋大学, 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306
  • 2. 上海海洋大学, 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
  • 3. 上海海洋大学, 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306
牛东红。E-mail: dhniu@shou.edu.cn

作者简介：杜蕴超(1993—), 女, 山东省威海市人, 硕士, 研究方向: 贝类种质资源与遗传育种。E-mail:

收稿日期: 2017-06-09

  要求修回日期: 2018-01-02

  网络出版日期: 2018-05-03

基金资助

国家自然科学基金项目(31472278)

国家高技术研究发展计划(2012AA10A400-3)

收起

Dopamine receptor genes of Sinonovacula constricta and its functions in damage healing of tissue

  • DU Yunchao , 1 ,
  • XIE Shumei 1 ,
  • HE Shengyao 1 ,
  • NIU Donghong , 1, 2 ,
  • LI Jiale 1, 3
Expand
  • 1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
  • 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
  • 3. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Corresponding author: NIU Donghong. E-mail:

Received date: 2017-06-09

  Request revised date: 2018-01-02

  Online published: 2018-05-03

Supported by

National Basic Research Program of China (31472278)

National High-tech R & D Program (“863” Program) of China (2012AA10A400-3)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

摘要

多巴胺受体(dopamine receptor)作为生物体中重要的神经递质受体, 在生物体的生长、发育、代谢等多个生理过程中都发挥着重要的功能。本研究从缢蛏Sinonovacula constricta转录组文库中筛选获得多巴胺受体基因的部分片段, 结合RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术和降落 PCR(polymerase chain reaction)技术, 克隆得到缢蛏两个多巴胺受体的选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)的变异体, 命名为ScDopR2a和 ScDopR2b, 长度分别为1824bp和2758bp。两个变异体均包含相同的5′非翻译区(untranslated regions, UTR)(24bp)和开放阅读框(open reading frame, ORF)(1440bp), 共编码479个氨基酸残基。但是两个变异体的3′UTR 长度不同, 分别为360bp和1294bp, 其中ScDopR2b在polyA尾前插入936bp。在同源的ORF区设计引物, 采用实时定量PCR分析多巴胺受体基因在不同组织中的表达特征, 结果表明多巴胺受体基因在水管、鳃、斧足的表达量显著高于其他组织。在该基因序列3′UTR插入片段区域设计特异引物检测ScDopR2b的组织表达情况, 结果表明在水管、鳃、斧足的表达量仍高于其他组织, 表达趋势与ORF区大致相同。进一步设计缢蛏组织损伤实验, 对进水管前端进行损伤处理, 在处理后的第4h、8h、12h、24h、48h、60h和72h取样, 荧光定量检测结果显示, 同源区表达量在12h和48h呈上调, 在8h、24h和72h下调, 且ScDopR2b表达趋势与同源区表达模式大致相同。研究结果表明, 缢蛏多巴胺受体参与了损伤修复过程, 其表达特征可能与多巴胺作为补偿性神经递质的作用有关。

关键词： 缢蛏; 多巴胺受体; 选择性多聚腺苷酸化; 损伤修复

本文引用格式

杜蕴超 , 谢淑媚 , 何圣耀 , 牛东红 , 李家乐 . 缢蛏多巴胺受体基因及其在损伤修复中的作用[J]. 热带海洋学报, 2018 , 37(3) : 45 -54 . DOI: 10.11978/2017068

Abstract

Dopamine receptor is an important neurotransmitter receptor, playing a key role in organism growth, development, metabolism, and other physiological processes. In this study, we obtained a fragment of dopamine receptor gene from transcriptome library of razor clam (Sinonovacula constricta), and cloned the full-length cDNA of dopamine receptor gene using RACE (rapid-amplification of cDNA ends) and Touchdown PCR (polymerase chain reaction). The full-length cDNA sequence contains two isoforms of alternative polyadenylation (APA), named as ScDopR2a and ScDopR2b, with a length of 1824 bp and 2758 bp, respectively. Both isoforms contain a 24 bp 5′untranslated region (UTR), and a 1440 bp open reading frame encoding 479 amino acid residues. However, the 3′UTR length is 360 bp and 1294 bp for ScDopR2a and ScDopR2b, respectively, with an insertion of 936 bp in front of the polyA tail for ScDopR2b. Primers were designed in open reading frame (ORF)to detect the expression level of dopamine receptor gene (ScDopR2) by quantitative real-time PCR. The results revealed the expression in waterpipe, gill and foot were higher than that in the other tissues. Then, primers were designed in 3′UTR to detect the expression level of ScDopR2b, showing similar expression pattern with ORF region. In the tissue damage experiment, the samples were selected at 4, 8, 12, 24, 48, 60, and 72 h after injuring waterpipe. The fluorescence quantitative results showed that a significant increase in 12 and 48 h, and a significant decrease in 8, 24 and 72 h. The trend of ScDopR2b gene’s expression level was similar to that of ORF. The results suggested that dopamine receptors are involved in the damage-healing process, and the expression pattern may be due to a role of dopamine as compensatory neurotransmitters.

Key words： Sinonovacula constricta; dopamine receptor; alternative polyadenylation (APA); damage healing

多巴胺是神经系统中重要的神经递质, 属于儿茶酚胺类, 在生物体的运动、感觉、学习记忆、情感等多个生理过程中, 都扮演着重要的角色(Pine et al, 2010; Williams et al, 2006; Dandekar et al, 2017)。其与血压调节(Jose et al, 2002) 等系统具有复杂的交互关系, 其交互作用的复杂性也表现在配体受体间的复杂交互(Devroye et al, 2017)。多巴胺受体(dopamine receptor)属于G蛋白偶联受体家族(G Protein-coupled receptors, GPCRs), 其蛋白质整体结构包含7个跨膜结构域、1个胞内羧基端、1个胞外氨基端、胞内环与胞外环各3个(Rosenbaum et al, 2009)。多巴胺受体的分类标准是环磷酸腺苷(cAMP)的水平变化。在脊椎动物中, 经多巴胺刺激后, cAMP水平上升的为D1类, 包含D1和D5亚型; cAMP下降的为D2类, 包含D2、D3、D4亚型(Vallone et al, 2000)。在无脊椎动物中, 多巴胺受体分为3类, 其中两类与脊椎动物的D1和D2类受体相似, 还有一类, 区别于脊椎动物, 是无脊椎动物特有类型——无脊椎动物型多巴胺受体类(invertebrate-type dopamine receptors, INDR) (Mustard et al, 2005)。
在水产动物中, 已有相关多巴胺受体的报道, 如斑节对虾Penaeus monodon (Sukthaworn et al, 2013)、牡蛎Crassostrea angulata (Yang et al, 2013)、甲壳类(Clark et al, 2006)、罗非鱼(LEVAVI-SIVAN et al, 2005)、斑马鱼(Boehmler et al, 2007)、椎实螺Lymnaea (Aonuma et al, 2016)等。将牡蛎作为模式生物, 通过检测鳃丝摆动频率, 验证P-氨基水杨酸(P-aminosalicylic acid)是否对治疗帕金森症有作用(Nelson et al, 2010)。在螺类动物中, 对多巴胺受体在条件性味觉厌恶中的作用进行研究, 并提出多巴胺作为神经递质的补偿、奖赏作用(Aonuma et al, 2016)。在罗氏沼虾中研究了多巴胺受体在免疫调节中的相关作用(Chang et al, 2016)。金鱼的体外实验证明了D2样受体在多巴胺能抑制促性腺激素分泌中起作用(Chang et al, 1990), 以及多巴胺通过D2受体抑制α-黑素细胞刺激素 (α-melanocyte- stimulating hormo-ne, α-MSH) 的释放(Olivereau et al, 1987; Omeljaniuk et al, 1989)。
缢蛏Sinonovacula constricta是我国四大养殖贝类之一, 属于软体动物门、瓣鳃纲、异齿亚纲、帘蛤目、竹蛏科, 具有很好的发展前景。缢蛏的养殖产量一直被人们所重视, 但因养殖模式和结构、环境因素、病害的发生等, 其产量受到限制(王兴强 等, 2006)。在缢蛏养殖过程中, 由于种种自然和人为的因素, 组织损伤的现象常有发生。外套膜、水管、斧足这些时常暴露于壳外活动的组织成为重要的受损组织对象。组织受损不仅影响缢蛏的品质, 而且增加缢蛏感染病菌的概率, 对缢蛏的产量有不利影响。组织损伤易诱发病原菌的感染, 引起机体的免疫炎症反应等, 导致大量免疫细胞的聚集, 清除损伤细胞并启动组织的修复(Cone, 2001; Muller, 2003)。本研究分析了缢蛏两个多巴胺受体基因的序列差异特征, 表达模式, 进一步探索了该基因在组织损伤修复过程中发挥的作用。研究结果对揭示神经递质受体的相关功能及其分子机制提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

组织分布实验所用缢蛏来自浙江省宁海县养殖基地。随机选取1龄缢蛏30只, 平均壳长5.53cm, 带回实验室后于充气水箱中暂养, 养殖条件为: 水温22℃, 盐度20‰。挑选健康个体, 分别取鳃、水管、斧足、外套膜、肝胰脏、性腺、唇瓣组织, 液氮冻存后, 保存于-80℃冰箱中待用。
水管损伤实验所用缢蛏来自浙江省宁海县养殖基地, 挑选健康1龄缢蛏个体200只进行暂养, 平均壳长5.81cm, 养殖水温22℃, 盐度20‰。实验设置实验组与对照组各3组, 每组33只缢蛏, 实验组对照组总计各99只。实验组对入水管0.5cm剪开损伤处理, 对照组不做处理。在处理后的8个时间点(4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h和72h), 分别采集实验组与对照组缢蛏个体的入水管组织。

1.2 多巴胺受体基因片段的筛选和验证

从缢蛏发育转录组文库中(Niu et al, 2016)筛选得到缢蛏多巴胺受体基因的部分序列。利用DNAMAN软件设计上下游引物F、R (表1), 进行序列验证。PCR (polymerase chain reaction)扩增体系(20μL): 2×TaqPCR Master Mix 10μL; 上下游引物各0.6μL (10umol·L-1); cDNA模板2μL; Rnase Free water 6.8μL。PCR程序: 94℃ 3min, 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 2min, 30个循环, 72℃ 10min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶割胶回收。连接于pGEM®-T Easy Vector (Promega), 16℃连接仪中连接12~16h。冰浴30min, 热击90s, 冰浴3min, 将质粒转化于大肠杆菌DH5α(Tiangen)中, 挑选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
Tab. 1 Information of primers used for PCR analysis

表1 引物序列信息

引物 序列(5′-3′) 用途
F ATCCACAGTGCTACAAGAGTTGC 中间片段扩增
R CTGCTGACGACGTCTGTTCT 中间片段扩增
3R1 AGTGAAAGTGACGAGGACGACCATACCAAC 3′RACE
3R2 TTCCAACCACGAGGTGCAAACAGAAGCTAC 3′RACE
3R3 ATCAACATCACAACAATCAGCGACCAATG 3′RACE
3R4 TTCATCACCAAACGTCTCCGACAATTAGC 3′RACE
3R5 TACAGATTCTACCAGAACAGACGTCGTCAGC 3′RACE
下游内部引物 CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3′RACE
下游外部引物 TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3′RACE
18SF TCGGTTCTATTGCGTTGGTTTT 荧光定量内参引物
18SR CAGTTGGCATCGTTTATGGTCA 荧光定量内参引物
ScdoprF CTTCCAATCGGCTGTTCG ORF区段荧光定量引物
ScdoprR GGTATGGTCGTCCTCGTCAC ORF区段荧光定量引物
ScDopR2bF AACTGTCCGTAACGCCAAAG ScDopR2b特异区荧光定量引物
ScDopR2bR TCAAACATCCCACTTCGGG ScDopR2b特异区荧光定量引物
ORF-F CATCACAACAATCAGCGAC 半定量验证引物
ORF-R ACAACAATCCCAAGCGTC 半定量验证引物
UTR-F TTCAGCGTGGTTGATGTG 半定量验证引物
UTR-R CTTTGGCGTTACGGACAGT 半定量验证引物

注: F表示上游引物; R表示下游引物。

1.3 多巴胺受体基因cDNA模板的合成

根据RNA prepPure Tissue Kit RNA prepPure动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取缢蛏各组织的RNA, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, 用NanoDrop2000C检测RNA的浓度和纯度, 液氮冻存后保存于-80℃冰箱中。
根据PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录说明书合成中间片段验证的模板。根据3′-Full RACE Core Set with PrimeScript™ RTase使用说明书反转用于3′克隆的模板。取3个个体, 提取每个个体的各组织RNA, 样本终浓度为1000ng·μL-1。根据PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)说明书合成Q-PCR的模板。cDNA模板放于-20℃保存。

1.4 多巴胺受体基因cDNA全长

根据所验证的中间片段, 用DNAMAN软件设计5条3′RACE引物, 引物信息见表1。 采用Touch down PCR扩增程序进行扩增, 程序为: 94℃ 30s, 68℃ 30s, 72℃ 1min, 2个循环; 94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1min, 2个循环; 94℃ 30s, 62℃ 30s, 72℃ 1min, 2个循环; 94℃ 30s, 59℃ 30s, 72℃ 1min, 2个循环; 94℃30s, 57℃ 30s, 72℃ 1min, 2 个循环; 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 25 个循环; 72℃ 10min, 4℃保存。第一次PCR以缢蛏水管组织为模板, 分别以5个引物和outer primer引物进行扩增; 第二次PCR以第一次4个PCR产物为模板, 以位置位于第一次PCR产物后面的引物和inner primer引物进行扩增, 两次PCR程序均采用Touch down PCR程序进行扩增。琼脂糖凝胶检测PCR产物, 将二次PCR产物割胶回收, 连接于pGEM®-T Easy Vector (Promega)上, 16℃于连接仪中连接12~16h。冰浴30min, 热击90s, 冰浴3min, 将质粒转化于大肠杆菌DH5α(Tiangen)中, 挑选阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。
DNAMAN软件在该基因ORF (open reading frame)区段和ScDopR2b基因特异区段分别设计一对引物, 将3个缢蛏个体的RNA配成500ng·μL-1的相同浓度, 分别反转录进行选择性多聚腺苷酸化变异体的验证, 扩增程序为: 94℃ 5min, 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 30个循环, 72℃ 10min。扩增体系为20μL: 2×TaqPCR Master Mix 10μL; 上下游引物各0.6μL (10μmol·L-1); cDNA模板2μL; Rnase Free water 6.8μL。

1.5 多巴胺受体基因的序列特征分析

应用DNAMAN软件进行3′RACE序列与中间片段序列的拼接, 将缢蛏多巴胺受体基因的cDNA全长分别与GenBank核酸数据库和蛋白数据库做BLAST分析, 通过ORF Finder 程序(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)确定ORF序列。用SignalP 4.1 Server 程序进行信号肽预测(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。NetNGlyc 1.0 Server进行N-糖基化位点的预测。应用EMBL 网站Service 工具 InterProscan 程序分析蛋白序列的保守结构域信息以及胞质域和胞外域。应用Expasy提供的Protscale程序进行蛋白质疏水性分析(http://au.expasy.org/tools/protscale.html)。应用美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的BLAST程序和DNAMAN软件对序列进行多重比对分析。应用MEGA 4.0软件采用最大简约法进行系统进化树的构建。应用 http://dnafsminer.bic.nus.edu.sg/ 网站 DNA Functional Site Miner 程 序中 Poly(A) Signal Miner模块进行缢蛏ScDopR2基因加尾信号(polyadenylation signals, PAS)的预测。

1.6 多巴胺受体基因组织表达以及水管损伤后的表达分析

用DNAMAN软件, 参照SYBR® Premix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)说明书的引物设计要求, 设计2条用于ORF区荧光定量的引物doprF和doprR, 以及2条用于ScDopR2b特异区荧光定量的引物, 以18SrRNA作为内参基因。每个实验重复在每个时间点采集3个个体的入水管, 3个样本RNA等量混合制备成1个样本池, 进行荧光定量检测。反应体系为: SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ (Tli RNaseH Plus) 10μL; 上下游引物各0.6μL (10μmol·L-1); cDNA模板2μL; Rnase Free water 6.8μL。PCR 扩增标准程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5s, 60℃ 30s, 40 个循环; 95℃ 10s; 从65℃到95℃采集信号, 每个循环增加0.5℃, 持续5s获得解链温度。在CFX96 Real-Time PCR Detection System仪器上进行。数据应用2-ΔΔCT方法进行相对定量分析, 所有值均为平均值±标准偏差(x ± SD), 采用SPSS 16.0软件进行t检验统计分析, 其中P < 0.05差异显著。

2 结果

2.1 缢蛏多巴胺受体基因的序列特征分析

从缢蛏转录组文库中筛选获得多巴胺受体基因编码区片段(ScDopR2), 3′RACE 克隆电泳图如图1所示, 将第2次PCR产物割胶回收, 进行测序, 经克隆测序获得多巴胺受体基因的2个选择性多聚腺苷酸化变异体, 命名为ScDopR2a和 ScDopR2b, cDNA全长分别为1824bp和2758bp。两个变异体均包含相同5′UTR(24bp)和开放阅读框(1440bp), 编码479个氨基酸残基。但是, ScDopR2a和 ScDopR2b基因 3′UTR 长度分别为360bp和1294bp。缢蛏水管组织半定量结果表明, ScDopR2基因ORF区段比ScDopR2b基因UTR特异区段的表达量高(图2)。两个变异体的区别在于ScDopR2b比ScDopR2a在polyA尾前插入936bp(图3)。经SignalP 4.1 Server预测, 不含信号肽序列。
Fig. 1 The cloning picture of two isoforms of ScDopR2 gene from S. constricta

图 1 缢蛏ScDopR2基因两个多聚腺苷酸化变异体克隆电泳图
a. 3′RACE第一次PCR, 图中数字表示扩增引物; b. 3′RACE第二次PCR, 图中a表示ScDopR2a, b表示ScDopR2b, 数字表示扩增引物。图a与图b右数第一列为marker, 片段大小自上而下依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp

Fig. 2 The semi-quantitative PCR picture of two isoforms of ScDopR2 gene from S. constricta

图 2 缢蛏ScDopR2基因两个多聚腺苷酸化变异体半定量电泳图
图为缢蛏水管组织的半定量; 1、2、3表示3个缢蛏个体; 前3个为ORF区段引物扩增, 中间3个为ScDopR2b特异UTR区段引物扩增, 后3个为18S引物扩增

EMBL 网站Service 工具 InterProscan 程序分析蛋白序列的保守结构域信息, 在79~432aa结构显示此蛋白属于G蛋白偶联受体家族, 具有t7m的典型结构域 (IPR017452)。 该基因7次跨膜区域的氨基酸位置分别为65~87aa、100~122aa、137~159aa、180~202aa、222~244aa、380~402aa、412~434aa。用公式x×3+24(x为蛋白质上的氨基酸位置), 计算得到在mRNA上对应的碱基位置分别为219~285bp、324~390bp、435~501bp、564~630bp、690~756bp、1164~1230bp、1260~1326bp。将缢蛏ScDopR2编码区与海洋贝类用DNAMAN进行多重序列比对分析, 相似度很高, 且在跨膜域高度保守(图4)。多重比较后发现, 缢蛏ScDopR2基因与虾夷扇贝M. yessoensis、光滑双脐螺B. glabrata、章鱼O. bimaculoides的多巴胺2类受体的一致性最高, 其一致性分别为64%、63%和61%。
Fig. 3 Full-length of cDNA and deduced amino acid sequence of ScDopR2 gene from S. constricta

图 3 缢蛏ScDopR2编码基因cDNA全长及推导的氨基酸序列
大写字母表示起始密码子和终止密码子, 大写斜体字母表示多腺苷酸化加尾信号AATAA, 下划线区域表示ScDopR2b比ScDopR2a多出的序列, 方框区域表示预测的糖基结合位点, 阴影区域为7次跨膜结构域

应用Expasy提供的Protscale程序进行蛋白质疏水性分析, TM5与TM6之间包含长的胞质环, TM7后为短的C-末端, 表现出D2类受体区别于D1类受体的氨基酸序列特征。疏水性最大值3.444, 疏水性最小值-3.589(图5)。
将长序列ScDopR2b序列输入http://dnafsminer. bic.nus.edu.sg/网站, 进行缢蛏ScDopR2基因选择性多聚腺苷酸化加尾信号的预测, PAS序列与分值见表2。
Tab. 2 Prediction information of alternative polyadenylation signal of ScDopR2 gene from S. constricta

表 2 缢蛏ScDopR2基因选择性多聚腺苷酸加尾信号的预测信息

位置/bp PAS序列 分值
1720 TATAAA 0.469
1727 TATAAA 0.577
1794 TATAAA 0.558
2735 AATAAA 0.097
Fig. 4 Multiple alignment of the amino acid sequence of ScDopR2 with its homologues in other organisms

图 4 缢蛏和其他物种的DopR2基因氨基酸序列的多重比对
阴影表示相同部分, 下划线表示7次跨膜域。GenBank 序列号 (NCBI): Crassostrea gigas (EKC35779.1); Octopus bimaculoides (XP_014768037.1) ; Aplysia californica (XP_005099999.1)

Fig. 5 Hydrophobicity analysis of ScDopR2 protein from S. constricta (by Protscale)

图 5 缢蛏ScDopR2编码蛋白质的疏水性分析(由Protscale程序预测)
通过分析程序对缢蛏ScDopR2基因推导的氨基酸序列进行疏水性结构预测。x轴表示从N端起始的氨基酸数目, y轴表示程序得到的亲疏水性数值,正值表示疏水,负值表示亲水。图中峰表示7次跨膜结构依次为TM1—TM7

2.2 缢蛏ScDopR2基因的系统进化分析

MP法构建系统进化树如图6所示, 构建系统进化树的序列信息见表3。图中可以看出多巴胺D1类受体聚为一支, D2类聚为一支, 缢蛏ScDopR2基因与虾夷扇贝以及两种牡蛎(C. virginica、C. gigas)的多巴胺D2类受体的亲缘关系最近首先聚在一起, 再与光滑双脐螺的多巴胺D2类受体聚在一起, 然后与其他海洋无脊椎动物聚在一起。
Fig. 6 Maximum-Parsimony phylogenetic tree of dopamine receptor amino acid sequences

图 6 基于MP法构建的多巴胺受体基因系统进化树

2.3 缢蛏多巴胺受体基因 mRNA 的组织表达

在基因同源区段的ORF区设计引物, 检测ScDopR2基因的组织表达情况; 在3′UTR区(ScDopR2b特异区)设计引物, 检测ScDopR2b变异体的组织表达情况。结果显示, ScDopR2在鳃、水管、斧足中的表达量明显高于其他组织, 在性腺、外套膜、唇瓣中的表达量相对较少, 而在肝胰脏中表达量最低。ScDopR2b与ScDopR2基因的组织分布大致相似, 在鳃、斧足、水管的表达量最高, 而在肝胰脏的表达量最低(图7)。
Tab. 3 Information of the sequences used in the phylogenetic analysis

表 3 用于系统进化分析的序列信息

基因名 物种名 登录号
AaDopR1 Aedes aegypti AFB73766.1
BmDopR1 Bombyx mori NP_001108459.1
MyDopR1 Mizuhopecten yessoensis XP_021361185.1
MsDopR1 Manduca sexta AEU17117.1
LfDopR2 Lampetra fluviatilis ADO23655.3
HsDopR2 Homo sapiens NP_000786.1
MyDopR2 Mizuhopecten yessoensis XP_021340507.1
BgDopR2 Biomphalaria glabrata XP_013063747.1
CvDopR2 Crassostrea virginica XP_022345762.1
CgDopR2 Crassostrea gigas XP_019919825.1
AcDopR2 Aplysia californica XP_005099999.1
RmDopR2 Rhipicephalus microplus AFC88980.1
CsDopR2 Chilo suppressalis AKR18179.1
MmDopR2 Mus musculus NP_034207.2
BmDopR2 Bombyx mori NP_001108338.1
ObDopR2 Octopus bimaculoides XP_014768037.1
LaDopR2 Lingula anatina XP_013419306.1
LpDopR2 Limulus polyphemus XP_013783833.1
Fig. 7 mRNA expression level of dopamine receptor gene homology region and ScDopR2b from S. constricta

图 7 缢蛏多巴胺受体基因同源区段和 ScDopR2b mRNA的组织表达
图中数据为3个重复的平均值±标准差; 缢蛏多巴胺受体基因同源区段和 ScDopR2b在各成体组织的表达量均以肝胰脏表达量为比较的倍数表示; *表示同源区段和 ScDopR2b mRNA在鳃、斧足、水管中的表达量与其他3个组织相比差异显著(P<0.05)

2.4 缢蛏多巴胺受体在水管损伤过程中的表达

利用荧光定量PCR分析了多巴胺受体基因在缢蛏水管损伤后的表达变化(图8)。在基因同源区段的ORF区设计引物, 检测ScDopR2基因在水管损伤后的表达情况, 结果显示, 在12h和48h时呈显著上调, 在8h、24h和72h时呈显著下调。在ScDopR2b特异区(3′UTR区)设计引物, 检测ScDopR2b变异体的表达情况, 结果显示, ScDopR2b在48h呈显著上调, 在8h、24h、36h、60h和72h时呈显著下调。
Fig. 8 The expression level of dopamine receptor homology region and ScDopR2b from S. constricta in waterpipe damage

图 8 缢蛏多巴胺受体基因同源区段和ScDopR2b在组织损伤中的表达
a. ORF区的表达图谱; b. ScDopR2b的表达图谱。图中数据为3个重复的平均值±标准差, 同源区段和ScDopR2b的表达以相同时间点处理组相对于对照组的表达量的倍数变化表示, *表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

本研究克隆得到两个缢蛏多巴胺受体基因的多聚腺苷酸化的变异体, 分别命名为ScDopR2a和ScDopR2b, 具有相同ORF区和5′UTR区, 而区别在于ScDopR2b比ScDopR2a在3′UTR区polyA尾前插入936bp序列, 均具有多巴胺D2类受体的特征域。BLAST分析显示, 与虾夷扇贝、章鱼、光滑双脐螺D2类受体的相似度分别为64%、61%、63%。聚类分析显示, 缢蛏ScDopR2基因与贝类多巴胺受体的亲缘关系最近。该基因ScDopR2的蛋白结构域为7次跨膜结构, 疏水区的位置与跨膜区相一致, 说明跨膜区的形成与其疏水性有关。软件预测蛋白质结构和拓扑结构, 显示第三胞内环较长, 而胞内C-末端较短。根据蛋白质结构上D1与D2类的区别: D2类第三胞内环较长、C-末端较短, 区分于D1类受体第三胞内环较短而C-末端较长的特征(Missale et al, 1998), 将ScDopR2判断为D2类受体。
调控转录本形成的3种主要机制包括对转录起始点的选择、剪接和多聚腺苷酸化(Le Texier et al, 2006)。多聚腺苷酸化形成的PolyA尾是真核生物mRNA的重要组成元件, 它与细胞的功能有着密切的关系(Edwalds-Gilbert et al, 1997), 在poly(A)前会出现几个碱基的结尾信号信息, 预示着3′UTR的结尾, 经典的 PAS序列是 AAUAAA, 其他非经典的PAS变体序列包括AUUAAA、AAGAAA 和 UAUAAA 等(Tian et al, 2005)。可变多聚腺苷酸化加尾信号的预测结果, 预测得到一个AATAAA位置, 位于2735bp处, 为ScDopR2b的加尾信号, 得分为0.097; 预测得到3个TATAAA位置, 其中1794bp处为ScDopR2a的加尾信号, 得分为0.558。选择性多聚腺苷酸化产生的不同转录本具有不同的翻译能力和稳定性等, 并对翻译具有一定的影响 (Zheng et al, 2014), 本实验克隆得到缢蛏的多巴胺受体基因的2种选择性多聚腺苷酸化变异体, 半定量结果表明, 缢蛏水管组织ScDopR2基因ORF区段比ScDopR2b基因UTR特异区段的表达量高。该基因的组织荧光定量结果显示, 缢蛏多巴胺受体ScDopR2同源区(ORF)和ScDopR2b基因在各成体组织中均有分布, 缢蛏多巴胺受体基因ScDopR2同源区(ORF)在鳃、斧足、水管的表达量明显高于其他组织; ScDopR2b基因与同源区表达量的变化趋势相似, 在鳃、斧足、水管的表达量明显高于其他组织, 而在性腺、肝胰脏、外套膜的表达量较低。有报道多巴胺以及多巴胺受体与生物体的运动功能有关, 抗精神失常药氯氮平对斑马鱼幼体运动的抑制作用可能是通过D4受体的介导(Boehmler et al, 2007)。推测缢蛏多巴胺受体基因在鳃、斧足、水管表达量高的现象可能与缢蛏鳃的摆动、水管伸缩、斧足的活动状态有关。在牡蛎的研究中表明多巴胺受体基因在放散期的性腺组织表达量低 (Yang et al, 2013), 本实验用缢蛏采集于12月份, 推测该基因在性腺组织定量中表达量较低的现象, 可能是由于处于放散期的原因。我们将同源区和缢蛏ScDopR2b变异体进行比较发现, 同源区(ORF)和缢蛏ScDopR2b变异体在鳃、斧足、水管虽然都是表达量高但趋势却不一致, 表明缢蛏ScDopR2基因的两个变异体在不同组织中的表达具有差异性, 不同的变异体具有不同的3′UTR区长度, 3′UTR区是与miRNA和RNA结合蛋白结合的区域, 3′UTR区的长短会对蛋白质功能产生影响(Sandberg et al, 2008; Whyteside et al, 2014), 这暗示缢蛏两个ScDopR2基因的选择性多聚腺苷酸化变异体在不同组织中的功能具有一定的差异性。
组织损伤增加缢蛏机体的感染病原菌的概率, 容易诱发机体产生炎症反应等, 对缢蛏的养殖产量产生不利影响。炎症反应是免疫应答的功能部分(Muller, 2003), 炎症反应会引起大量免疫细胞的聚集, 清除损伤的细胞并启动组织的修复(Cone, 2001;Muller, 2003), 其分子作用机制是通过受体配体的结合, 启动信号通路, 引起一系列的细胞反应, 如黏附、运动、迁移、吞噬作用等(Cone, 2001; Humphries et al, 2014)。神经递质在神经系统和免疫系统之间起到互相传达的作用(Sternberg, 2002), 神经系统能够通过释放儿茶酚胺类神经递质来调节免疫系统, 并作用于不同的免疫细胞(Sarkar et al, 2010)。多巴胺作为一种重要的儿茶酚胺类神经递质, 对免疫系统有着重要的作用(Basu et al, 2000)。多巴胺受体参与神经内分泌免疫调节网络, 调节肾脏、胃肠和内分泌等(Ahmed et al, 2015), 有报道多巴胺受体基因参与机体的免疫过程(Cosentino et al, 2015), 且在无脊椎动物中已报道对病原菌感染具有抵抗能力(Chang et al, 2016)。本研究对缢蛏的水管进行损伤, 结果表明水管损伤后 12h、48h时呈显著上调, 在8h、24h、72h时呈显著下调, 暗示缢蛏多巴胺受体基因参与了水管损伤后的反应过程。在螺类的研究中表明, 多巴胺作为一种奖赏物质, 是一种具有补偿性作用的神经递质(Aonuma et al, 2016), 推测这种上升与下调的表达模式可能与多巴胺的补偿作用有关。多巴胺受体作为连接免疫系统和神经系统的桥梁, 对炎症反应和抵抗病原体有重要的作用, 推测多巴胺受体可能通过参与启动免疫炎症过程, 来进行对水管损伤应激的应答。我们将同源区和缢蛏ScDopR2b进行比较, 同源区和ScDopR2b变异体的表达在多个时相中几乎呈现一致, 推测在水管损伤过程中变异体ScDopR2b发挥主要的生物学功能。ScDopR2a和ScDopR2b两变异体的区别在于, ScDopR2b在3′UTR区polyA尾前多出了936bp, 3′UTR区顺式作用元件对mRNA 丰度具有影响(Dever, 2002), 3′UTR的特定区域也是miRNA作用的对象, 引起mRNA的降解以及蛋白表达的阻遏(Djuranovic et al, 2012)。3′UTR区的差异性致使ScDopR2a和ScDopR2b两个变异体具有不同的表达模式和调控等, 其具体的调控仍需要进一步的实验研究。
综上所述, 本研究获得了两个缢蛏多巴胺受体基因选择性多聚腺苷酸化的变异体, 分析了多巴胺受体的组织表达及其在组织损伤中的应激反应, 为进一步研究多巴胺受体在贝类生长发育和免疫调节中的作用机制提供了分子基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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