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热带海洋学报 >

2018 , Vol. 37 >Issue 4: 38 - 44

DOI: https://doi.org/10.11978/2017106

深海来源微生物乙酰酯酶的酶学性质鉴定及拆分制备D-乳酸甲酯

  • 黄锦龙 , 1, 3 ,
  • 张继福 , 2 ,
  • 胡洁莹 4 ,
  • 关见留 4 ,
  • 张云 1, 3 ,
  • 孙爱君 1, 3 ,
  • 胡云峰 , 1, 3
展开
  • 1. 中国科学院南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州510301
  • 2. 广东省中医院, 广东 广州 510120
  • 3. 中国科学院南海海洋研究所, 广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301
  • 4. 广东第二师范学院, 广东 广州 510303
通讯作者: 胡云峰(1980—)。E-mail: yunfeng.hu@scsio.ac.cn; 张继福(1983—)。E-mail: woodjeaff@qq.com

作者简介：黄锦龙(1986—), 男, 博士研究生, 研究方向为生物催化与酶工程。E-mail:

收稿日期: 2017-09-29

  要求修回日期: 2017-10-25

  网络出版日期: 2018-07-16

基金资助

中国科学院战略性先导科技专项项目(XDA11030404);广东省海洋渔业科技攻关与研发方向项目(A201701C12);广州市科技计划项目(201510010012)

收起

Characterization of one deep-sea derived microbial acetyl esterase and its utilization in the preparation of D-methyl lactate through kinetic resolution

  • HUANG Jinlong , 1, 3 ,
  • ZHANG Jifu , 2 ,
  • HU Jieying 4 ,
  • GUAN Jianliu 4 ,
  • ZHANG Yun 1, 3 ,
  • SUN Aijun 1, 3 ,
  • HU Yunfeng , 1, 3
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China
  • 3. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 4. Guangdong University of Education, Guangzhou 510303, China
Corresponding author: HU Yunfeng. E-mail: ; ZHANG Jifu. E-mail:

Received date: 2017-09-29

  Request revised date: 2017-10-25

  Online published: 2018-07-16

Supported by

Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDA11030404);Scientific and Technological Project of Ocean and Fishery from Guangdong Province (A201701C12);Guangzhou Science and Technology Plan Projects (201510010012)

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热带海洋学报编辑部
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摘要

D-乳酸及其酯是重要的手性药物中间体和手性化工产品。从南海深海芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO15029克隆到一个乙酰酯酶基因bae02030, 表达并鉴定该酶Bae02030的酶学性质。该酯酶的最适pH和最适温度分别为8.5和35℃, 其对多种有机溶剂和表面活性剂具有较好的耐受性。乙酰酯酶Bae02030能够通过水解拆分消旋乳酸甲酯来制备光学纯的D-乳酸甲酯。通过对拆分反应进行优化, 添加体积分数为60%的正庚烷能够改善乙酰酯酶Bae02030的光学选择性, 所制备的D-乳酸甲酯的对映体过量值(e.e.s)超过99%, 转化率(c)为56%。深海微生物来源的乙酰酯酶Bae02030作为生物催化剂在工业上制备手性药物中间体具有较好的应用潜力。

关键词： 深海微生物; 乙酰酯酶; 生物催化; D-乳酸甲酯; 手性拆分

本文引用格式

黄锦龙 , 张继福 , 胡洁莹 , 关见留 , 张云 , 孙爱君 , 胡云峰 . 深海来源微生物乙酰酯酶的酶学性质鉴定及拆分制备D-乳酸甲酯[J]. 热带海洋学报, 2018 , 37(4) : 38 -44 . DOI: 10.11978/2017106

Abstract

D-lactic acid and its esters are important chiral drug intermediates and chemicals. An acetyl esterase, Bae02030, from Bacillus sp. SCSIO15029 isolated from the deep sea of the South China Sea was cloned, expressed and functionally characterized. The optimum pH and temperature of acetyl esterase Bae02030 were 8.5 and 35°C, respectively. Bae02030 exhibited excellent resistance to most organic solvents and surfactants tested. Bae02030 could generate optically pure D-methyl lactate through resolution of racemic methyl lactate. After process optimization of the enzymatic resolution reactions, the addition of 60% heptane improved the enantio-selectivity of Bae02030. The enantiomeric excess of prepared D-methyl lactate was over 99% and conversion rate reached 56%. Acetyl esterase Bae02030 identified from deep-sea microorganism, as a biocatalyst, possesses great potential in the production of chiral drug intermediates in industry.

Key words： deep-sea microorganisms; acetyl esterase; biocatalysis; D-methyl lactate; chiral resolution

酶在药品和精细化工产品的制备中具有重要的意义, 如拆分制备高附加值的光学纯手性药物中间体和手性化工产品。生物酶催化的反应是绿色环保的生产过程, 生产的手性药物中间体/化工产品具有很高的光学纯度, 同时还可以避免传统有机合成反应带来的高毒性的金属催化剂残留。水解酶除了可以通过水解反应制备大宗化工产品, 还可以通过不对称水解和转酯等反应制备手性药物中间体/化工产品。乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)是来自于SGNH (Ser-Gly-Asn-His)超家族中的一类水解酶, 其具有4个保守区, 催化三联体为Ser-Asp-His, Gly和Asn在空间上靠近催化中心, 与催化中心构成氧离子穴(Mølgaard et al, 2000)。乙酰酯酶通常催化乙酸酯的水解, 生成相应的醇和乙酸。目前对乙酰酯酶应用研究较多的是围绕果胶、木聚糖等植物细胞壁成分的脱乙酰化, 木聚糖的脱乙酰化有利于加速其他裂解酶和水解酶分解多糖分子(Chang et al, 2004; Tong et al, 2015)。
乳酸甲酯是一种具有特殊气味的无色的液体, 广泛用作绿色溶剂、清洁剂、可塑剂和药物中间体等(Aqar et al, 2016)。由于乳酸甲酯和其水解物乳酸均是含有两个功能基团的手性化合物, 可以用来制备各种手性药物和手性化工产品, 如布渣叶生物碱(Raji-Reddy et al, 2016)、苯氧丙酸酯类除草剂(周明芳, 2014)和聚乳酸高分子(Yamane et al, 2003)等。然而, 通过传统有机合成很难制备高光学纯度的手性乳酸酯和手性乳酸, 特别是D-乳酸甲酯和D-乳酸。生物酶催化法特异性强, 能够通过不对称拆分获得高光学纯的乳酸甲酯或乳酸衍生物, 如Candida antarctica脂肪酶催化乳酸丁酯与丁酸酐的不对称酯化反应, 获得光学纯达95%的L-乳酸丁酯(Richard et al, 2013)。
关于乙酰酯酶拆分制备手性化合物的报道极少, 仅见乙酰酯酶EstK拆分消旋乙酸苏合香酯, 所制备的(R)-1-苯乙醇的光学纯度仅为80.4% (Millar et al, 2016)。本研究从一株我国南海深海耐高温芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO15029克隆到一个新颖的乙酰酯酶基因Bae02030, 并在大肠杆菌Escherichia coli中实现了该乙酰酯酶的可溶性异源表达。本研究对该乙酰酯酶进行了酶学性质鉴定, 并使用纯化的乙酰酯酶对消旋乳酸甲酯进行不对称水解来制备D-乳酸甲酯。实验通过对反应温度、反应pH、有机溶剂、表面活性剂、酶浓度和底物浓度等条件的系统优化, 获得高光学纯度的D-乳酸甲酯。

1 材料方法

1.1 实验材料与设备

南海深海芽孢杆菌Bacillus sp. SCSIO15029, 分离自南中国海(89º29′13″E, 10º00′7″N) 水下3400m海底灰白色粘土, 保存于中国科学院南海海洋研究所, 全基因组序列未公开。大肠杆菌E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3)和载体pET-28a(+)为本实验室保存。限制性内切酶购于Thermo Fisher Scientific (美国), T4 DNA连接酶和TransStart® Pfu DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司, Ni柱和脱盐柱购于GE公司。DL-乳酸甲酯购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司, 光学纯L-乳酸甲酯购于北京百灵威科技有限公司, 其他试剂均为分析纯, 购于广州东巨有限公司。分析检测仪器用福立气相色谱仪(FULI 9790 Ⅱ)。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因克隆, 载体构建与蛋白表达纯化
根据Bacillus sp. SCSIO15029全基因组测序序列与基因注释结果, 利用National Center for Biotechnology Information数据库(NCBI)同源搜索工具, 比对到一个乙酰酯酶基因(命名为bae02030)。该基因在NCBI上的登录号为MG252038, 与来源于B. subtilis strain BS38 (登录号: CP017314.1)的鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶基因相似度最高为99%。其氨基酸序列与鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶(登录号: WP_080031059.1)序列相似度为100%。然而, 目前还未有对该酶的酶学性质与功能进行相关的研究。根据序列设计一对引物, 正向引物序列为5′-CGCGGATCC ATGAAGAAACCAATTCAAGTATTTT-3′ (下划线为BamH I酶切位点), 反向引物为5′-CCGCTCGAG TTATACATGTTCTTTCCCCTCC-3′ (下划线为Xho I酶切位点)。PCR反应条件: 94℃变性5min, 以94℃变性40s, 56℃退火40s, 72℃延伸2min为一个循环, 共30个循环, 最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后切胶回收, 回收产物用BamH I和Xho I双酶切, 并与双酶切的pET-28a(+)载体连接, 用CaCl2法将连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞, 涂布于含50μg•mL-1卡那霉素的Luria-Bertani (LB)固体培养基上, 37℃培养15h, 挑选阳性菌落测序。
经过测序验证正确的载体转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞, 用于蛋白的表达。发酵条件为37℃培养3h至OD600约为0.6, 加入终浓度为0.2mmol•L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 22℃诱导培养15h。4℃ 4000r•min-1离心收集菌体, 用50mmol•L-1 Tris-HCl (pH 7.8)缓冲液悬浮菌体, 冰浴条件下超声破胞, 4℃ 10000r·min-1离心弃沉淀, 上清用于Ni琼脂糖亲和层析纯化蛋白。上样前, 用5mL 10mmol•L-1咪唑(pH 7.8)缓冲液平衡柱子; 接着上样, 待溶液流干后, 分别用20mL 10mmol•L-1 咪唑(pH 7.8)和40mmol•L-1咪唑(pH 7.8)缓冲液梯度洗脱杂蛋白, 最后用2.5mL 300mmol•L-1 咪唑(pH 7.8)缓冲液洗脱, 收集目的蛋白。随后用PD脱盐柱脱盐, 上样前用10mL 50 mmol•L-1 Tris-HCl (pH 7.8)平衡缓冲液平衡柱子, 待柱子流干后上样, 待液体流干后用3.5mL 50mmol•L-1 Tris-HCl (pH 7.8)洗脱缓冲液(含150mmol•L-1 NaCl)洗脱收集目的蛋白, 获得的酶液于-80℃保存备用。
1.2.2 Bae02030的底物特异性
本研究采用单因素试验优化反应的条件。以对硝基苯酚酯为水解底物, 测定酯酶的水解活性。一个标准的水解反应包含6.34×10-4mg·mL-1纯酶, 2mmol·L-1对硝基苯酚酯, 在0.1mol·L-1 Tris-HCl (pH 8.5)和35℃下反应5min, 用等体积的丙醇终止反应, 随后在405nm波长下测定吸光值。所有试验均重复3次, 取平均值。酶活单位(U)定义为在最适温度和pH下, 单位时间内产生对硝基苯酚的微摩尔数。
1.2.3 最适pH和最适温度的测定
由于乙酰酯酶Bae02030对对硝基苯酚乙酸酯水解活性最高, 对其他对硝基苯酚酯无水解活性, 因此后续的活性测定均用对硝基苯酚乙酸酯作为最适底物。根据上述标准反应条件, 在35℃下优化pH, 范围为7.5~9.5; 在最适pH下优化温度, 范围为25~50℃。
1.2.4 有机溶剂和表面活性剂对Bae02030活性的影响
用100mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.5)稀释纯酶液至20倍, 加入体积分数为10%的有机溶剂[正己烷、环己烷、正庚烷、甲醇、丙醇、丙酮、甲苯、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)]或质量分数为0.01%的表面活性剂[吐温20, 吐温80, 曲拉通, 三聚磷酸钠(STPP)], 35℃孵育0.5h, 测定各试验的相对酶活。以不加有机溶剂和表面活性剂的试验为对照组, 相对酶活为100%。
1.2.5 pH和温度对Bae02030拆分的影响
反应pH的优化。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 100mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.5~10.0), 0.1mL纯酶液(23U), 终浓度为25mmol·L-1乳酸甲酯。置于35℃和转速为200r·min-1的摇床中振荡反应4h。
反应温度的优化。在0.5mL的反应体系中加入0.4mL 100mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 9.0), 0.1mL纯酶液(23U), 终浓度为25mmol·L-1乳酸甲酯。设定反应的温度范围为30’50℃, 于转速为200r·min-1的摇床中振荡反应4h。
1.2.6 有机溶剂和表面活性剂对Bae02030拆分的影响
参考酶活性耐受实验, 选取相对酶活保持80%以上的有机溶剂和表面活性剂作为添加剂, 考察Bae02030的立体选择性。在0.5mL的反应体系中加入0.35mL 100mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 9.0), 0.1mL纯酶液(23U), 终浓度为25mmol·L-1乳酸甲酯, 以及体积分数为10%的有机溶剂(正己烷、正庚烷、环己烷、甲醇、甲苯、丙酮和DMSO)或质量分数为0.01%的表面活性剂(曲拉通X-100、吐温20、吐温80、STPP), 以不加任何有机溶剂和表面活性剂为对照。反应混合液置于最适温度(40℃)和转速为200r·min-1的摇床中振荡反应4h。
1.2.7 酶浓度对Bae02030拆分的影响
在0.5mL的反应体系中加入0.1mL 100mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 9.0), 不同终浓度(0.32、0.64、 0.96、1.28、1.60、1.92mg·mL-1)的纯酶液, 终浓度为25mmol·L-1乳酸甲酯, 以及60%正庚烷。反应混合液置于40℃和转速为200r·min-1的摇床中振荡反应1h。
1.2.8 底物浓度对Bae02030拆分的影响
在0.5mL的反应体系中加入0.2mL 100mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 9.0), 不同终浓度的乳酸甲酯(12.5、25、37.5、50mmol·L-1), 以及体积分数60%正庚烷。反应体系的酶的质量浓度为1.60mg·mL-1 (23U)。反应混合液置于最适温度(40℃)和转速为200r·min-1的摇床中振荡反应, 每间隔1h取0.5mL样品测定。
1.2.9 气相色谱分析
以上所有拆分实验均用乙酸乙酯终止反应, 并萃取3次, 将有机相合并后加入适量的无水Na2SO4干燥, 即可用于气相分析。有机相中的底物分析用FULI 9790 Ⅱ气相色谱仪, 手性毛细管柱为112-6632 CYCLOSIL-B (长30m×宽0.25mm, 直径0.25μm, 安捷伦公司), 载气为氮气, 流速为1.2mL·min-1。色谱柱的升温程序为80℃保持1min, 以15℃·min-1的速度升温至120℃, 保持1min, 再以10℃·min-1的速度升温至160℃。进样器和检测器的温度分别设置为220℃和250℃。底物乳酸甲酯的对映体过量值(e.e.s)根据峰面积进行计算, 根据乳酸甲酯标准曲线计算反应后乳酸甲酯的浓度, 并按如下公式计算底物的转化率(c)和选择性(E)(Chen et al, 1982), 计算公式为:
$e.e{{.}_{\text{s}}}={\left( {{A}_{\text{D}}}-{{A}_{\text{L}}} \right)}/{\left( {{A}_{\text{D}}}+{{A}_{\text{L}}} \right)}\;$
$c={\left( {{D}_{\text{0}}}+{{L}_{\text{0}}}-D-L \right)}/{\left( {{D}_{\text{0}}}+{{L}_{\text{0}}} \right)}\;$
$E={\text{ln}\left[ \left( \text{1}-c \right)\left( \text{1}-e.e{{.}_{\text{s}}} \right) \right]}/{\ln \left[ \left( \text{1}-c \right)\left( \text{1}+e.e{{.}_{\text{s}}} \right) \right]}\;$
式中: AD和AL分别代表D-乳酸甲酯和L-乳酸甲酯的峰面积(单位: μV·s); D0和L0分别代表反应前对应构型的乳酸甲酯的浓度(单位: mmol·L-1); D和L分别代表反应后对应构型的乳酸甲酯的浓度(单位: mmol·L-1)。

2 结果

2.1 Bae02030的纯化

Bae02030蛋白的理论分子量为25.87kDa, 等电点pI为5.29。含重组质粒pET28a-02030的大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌过表达Bae02030蛋白, 该蛋白可以可溶性表达并纯化。从图1可看出, Bae02030蛋白大小符合预期。
Fig. 1 SDS-PAGE of Bae02030. M. markers; 1. total proteins of recombinant stain before IPTG induction; 2. total proteins of recombinant stain after IPTG induction; 3. purified Bae02030

图1 Bae02030蛋白SDS-PAGE电泳
M. 蛋白分子量; 1. 重组菌诱导前对照; 2. 重组菌诱导后总蛋白; 3. 镍柱纯化的Bae02030蛋白

2.2 Bae02030的最适pH和最适温度

用不同pH缓冲液测定Bae02030的酶活, 结果见图2a。Bae02030在pH 8~9.5范围内活性较高, 保持有70%以上的酶活, 最适pH为8.5。pH低于8时, 酶活性降低迅速, 相对酶活只有28.6%。在最适pH下测定不同温度的活性, 结果见图2b。Bae02030在较宽的温度范围内(25~50℃)均具有较高的活性, 保持有58.9%以上的酶活, 最适温度为35℃。在最适条件下测得的特异性酶活为36.83±0.93U·mg-1。
Fig. 2 Effects of pH (a) and temperature (b) on Bae02030 activity

图2 pH (a)和温度(b)对Bae02030活性的影响

2.3 有机溶剂和表面活性剂对Bae02030酶活的影响

Bae02030在有机溶剂和表面活性剂中的耐受性是一个重要的性质。实验比较了12种有机溶剂和4种表面活性剂对酶活的影响, 结果见图3。Bae02030在5种有机溶剂(正庚烷、正己烷、环己烷、DMSO、甲醇)和4种表面活性剂中的活性均高于对照组, 其中在正庚烷中的活性是对照的3.01倍。在THF中的活性最低, 仅保留4.82%的相对酶活。
Fig. 3 Effects of organic solvents and surfactants on the relative activity of Bae02030

图3 有机溶剂和表面活性剂对Bae02030酶活的影响

2.4 pH和温度对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

pH和温度是影响酶拆分的两个重要因素。由表1可看出, 随着pH的升高, 底物e.e.s值先升高后逐渐下降, 在pH 9.0达到最大值, 而底物转化率逐渐升高。在拆分反应中, 优先考虑e.e.s值, 因此以pH 9.0作为拆分反应的最佳pH。与pH的影响类似, 底物e.e.s值随着温度的升高, 在40℃达到最大值, 后逐渐下降, 而底物转化率c逐渐升高, 当温度达到50℃时, 转化率略有下降, 可能与高温抑制酶的活性有关。因此, 以40℃作为拆分反应的最佳温度。
Tab. 1 Effects of pH and temperature on the resolution of methyl lactate by Bae02030

表1 pH和温度对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

pH 对映体
过量值/%		 转化率/% 温度/°C 对映体
过量值/%		 转化率/%
7.5 35.85 ± 0.31 53.73 ± 0.25 30 71.17 ± 0.44 55.29 ± 0.40
8.0 48.13 ± 0.38 55.0 ± 0.30 35 76.33 ± 0.28 56.42 ± 0.18
8.5 66.05 ± 0.62 56.23 ± 0.29 37 81.17 ± 0.35 57.86 ± 0.51
9.0 76.45 ± 0.53 56.96 ± 0.52 40 83.29 ± 0.53 58.47 ± 0.32
9.5 65.21 ± 0.33 58.21 ± 0.41 45 79.87 ± 0.71 60.08 ± 0.33
10.0 63.79 ± 0.19 59.31 ± 0.38 50 64.79 ± 0.36 59.57 ± 0.59

2.5 有机溶剂/表面活性剂对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

由表2可看出, 添加环己烷、正庚烷、吐温20、吐温80和STPP的反应, 产物e.e.s值略高于对照, 尤其以正庚烷促进作用较佳, 其转化率更接近理论值(50%)。对正庚烷的体积分数进行优化的实验发现, e.e.s值随着正庚烷体积分数增加到60%时达到最大值, 而后下降, 底物转化率c则一直减少(图4), 在体积分数为60%时, 立体选择性最大。因此, 以体积分数60%正庚烷作为溶剂用于后续的实验优化。
Tab. 2 Effects of organic solvents and surfactants on the resolution of methyl lactate by Bae02030

表2 有机溶剂和表面活性剂对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

lgP 对映体过量值/% 转化率/%
对照 0 89.23 ± 0.42 66.60 ± 0.55
正己烷 3.94 89.15 ± 0.27 66.76 ± 0.32
环己烷 3.39 90.27 ± 0.46 66.32 ± 0.42
正庚烷 4.47 90.53 ± 0.52 61.34 ± 0.20
甲醇 -0.72 52.89 ± 0.63 54.97 ± 0.46
甲苯 2.68 84.23 ± 0.35 64.60 ± 0.34
丙酮 -0.16 50.19 ± 0.30 45.88 ± 0.09
DMSO -1.35 88.89 ± 0.73 61.94 ± 0.24
曲拉通 0 88.23 ± 0.33 67.30 ± 0.22
吐温-20 0 90.53 ± 0.25 69.80 ± 0.88
吐温-80 0 91.33 ± 0.41 66.42 ± 0.27
STPP 0 90.15 ± 0.95 67.57 ± 1.04

注: lgP为有机化合物脂水分配系数, 数值参考自www. chemspider.com

Fig. 4 Effect of concentration of heptane on the resolution by Bae02030

图4 不同正庚烷体积分数对Bae02030拆分的影响

2.6 拆分反应中酶的质量浓度的优化

酶的质量浓度是酶促反应中一个重要的因素, 反应的速率随着酶量的增加而增加, 最后趋向平缓。从图5可看出, 反应1h, 测定的e.e.s值和c值都随酶的质量浓度的增加而升高, 但是当质量浓度为1.60mg·mL-1时, 转化率c增加缓慢, 说明酶的用量已经趋向过量, 反应速率也趋向恒定。因此, 酶的质量浓度为1.60mg·mL-1作为最适反应酶量。
Fig. 5 Effects of enzyme loading on the resolution of methyl lactate

图5 酶的质量浓度对拆分反应的影响

2.7 拆分反应中底物浓度的优化

底物浓度是影响酶催化进程的另一重要因素, 过高的浓度反过来会抑制酶的反应。由表3的结果可看出, 底物浓度影响Bae02030的拆分效果。当底物浓度为12.5mmol·L-1时, 转化率更接近理论值(50%), D-乳酸甲酯的产率均高于其他三个浓度的值。当底物浓度为50mmol·L-1时反应6h后, e.e.s值和c值均不再增加, 说明底物已经过量, 抑制酶的反应, 也可能产生过量的乳酸降低反应的pH, 不利于反应的进行。在最优底物浓度12.5mmol·L-1时, 所制备的D-乳酸甲酯的e.e.s超过99%, 转化率为56%。
Tab. 3 Effects of different substrate concentrations on the resolution of methyl lactate by Bae02030

表3 不同底物浓度对Bae02030拆分乳酸甲酯的影响

底物浓度
/(mmol·L-1)		 时间/h 对映体
过量值/%		 转化率/% D-乳酸甲酯产率 /(mmol·L-1·h-1)
12.5 2 > 99.5 56.03 ± 0.43 2.75 ± 0.03
25.0 4 > 99.5 61.43 ± 0.26 2.41 ± 0.03
37.5 6 > 99.5 63.35 ± 0.35 2.29 ± 0.04
50.0 6 87.07 ± 0.31 54.58 ± 0.17 1.78 ± 0.01

3 讨论

乙酰酯酶本是水解醇的乙酸酯的一类水解酶。目前, 报道乙酰酯酶的底物中多数是短链酯, 如对硝基苯酚乙酸酯、乙酸-1-萘酯, 葡萄糖五乙酸酯(Kwon et al, 2016; Navarro-Fernández et al, 2008)。本文中鉴定的深海微生物乙酰酯酶Bae02030对短链的对硝基苯酚乙酸酯特异性较高, 而对长链的对硝基苯酚酯无活性; 乙酰酯酶Bae02030与多数乙酰酯酶一样, 最适pH和温度分别在7.5~8.5和30~40℃之间(Huy et al, 2012; Remoroza et al, 2014; Zhou et al, 2014)。同时乙酰酯酶Bae02030还对多种有机溶剂和表面活性剂具有较好的耐受性。Tian等(2014)研究发现, 来源于B. subtilis的乙酰木聚糖酯酶也对多种有机溶剂具有较好的耐受性。低浓度的DMSO对来源于Neurospora crassa的阿魏酸酯酶的活性有一定的促进作用, 但是高浓度的DMSO则对酯酶活性有抑制作用(Faulds et al, 2011)。
本研究发现乙酰酯酶Bae02030可以作为高效的生物催化剂对消旋的羧酸酯(DL-乳酸甲酯)进行拆分。通过对乙酰酯酶Bae02030拆分DL-乳酸甲酯的酶促反应进行系统的优化, 所制备的D-乳酸甲酯的对映体过量值超过99%, 转化率为56%。我们发现有机溶剂正庚烷不仅可以促进乙酰酯酶Bae02030的水解活性, 而且高浓度的正庚烷(60%)可以极大地促进乙酰酯酶Bae02030的拆分光学选择性。本课题组先前从海洋微生物Pseudomonas oryzihabitans和Bacillus sp. SCSIO 15029中开发的羧酸酯酶PHE14和BSE01701均可拆分消旋的乳酸甲酯, 获得D-乳酸甲酯的对映体过量值均达到99%, 转化率分别为50.6%和60% (Huang et al, 2016; Wang et al, 2016)。乙酰酯酶Bae02030为本课题组从南海深海微生物中鉴定开发的又一个新颖的可用于D-乳酸甲酯等重要手性药物中间体/化工产品制备的绿色生物催化剂, 可以避免传统有机化学合成存在的金属催化剂残留和产物光学纯度不高等缺点, 具有较好的工业应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

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原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
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