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热带海洋学报 >

2020 , Vol. 39 >Issue 5: 19 - 29

DOI: https://doi.org/10.11978/2019126

海洋生物学

Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌多样性及细菌粗提物延缓秀丽隐杆线虫衰老活性研究*

  • 韩敏敏 , 1 ,
  • 李蜜 1 ,
  • 刘昕明 2 ,
  • 刘永宏 3 ,
  • 龙超 3 ,
  • 钟振国 1 ,
  • 易湘茜 1 ,
  • 高程海 , 1
展开
  • 1.广西中医药大学海洋药物研究院, 广西中医药科学实验中心, 药学院, 广西 南宁 530200
  • 2.广西壮族自治区海洋研究院, 广西 南宁 530022
  • 3.中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州 510301
高程海。E-mail:

韩敏敏(1993—), 女, 山东省济宁市人, 硕士研究生, 主要从事海洋药物基础与产品开发研究。E-mail:

Copy editor: 殷波

收稿日期: 2019-12-05

  要求修回日期: 2020-03-03

  网络出版日期: 2020-03-05

基金资助

国家自然科学基金项目(41566004)

国家自然科学基金项目(21662006)

广西中医药大学岐黄工程高层次人才团队培育项目(2018006)

广西中医药大学博士科研启动基金项目(2017BS039)

广西中医药大学海洋药物研究院团队科研专项经费项目(2018ZD005-A06)

版权

版权所有，未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
收起

Studies on bacterial diversity in coral reef sediments in Khai Island and Pathiu Island and bacterial crude extract retards aging activity of Caenorhabditis elegans*

  • HAN Minmin , 1 ,
  • LI Mi 1 ,
  • LIU Xinming 2 ,
  • LIU Yonghong 3 ,
  • LONG Chao 3 ,
  • ZHONG Zhenguo 1 ,
  • YI Xiangxi 1 ,
  • GAO Chenghai , 1
Expand
  • 1. Institute of Marine Drugs, Guangxi Scientific Research Center of Traditonal Chinese Medicine, Faculty of Pharmacy Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China
  • 2. Guangxi Academy of Oceanography, Nanning 530022, China
  • 3. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
GAO Chenghai. E-mail:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2019-12-05

  Request revised date: 2020-03-03

  Online published: 2020-03-05

Supported by

National Natural Science Foundation(41566004)

National Natural Science Foundation(21662006)

Development Program of High-level Talent Team under Qihuang Project of Guangxi University of Chinese Medicine(2018006)

Doctoral Research Foundation of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine(2017BS039)

Scientific Research Foundation of Institute of Marine Drugs, GUCM(2018ZD005-A06)

Copyright

Copyright reserved © 2020. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

摘要

在Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁生长海域采集2份珊瑚礁沉积物样品, 将样品预处理后采用6种分离培养基进行分离培养, 获得活性海洋细菌菌株, 通过PCR扩增和16s rRNA基因序列测定, 分析物种多样性, 并构建系统发育树。以模式生物秀丽隐杆线虫为模型考察菌株发酵提取物延缓衰老的作用。实验结果表明, 从4种样品中分离鉴定出22株细菌, 分别属于11目13科14属。16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的细菌有2株, 疑似为潜在新种。GXIMD014 (Vibrio galatheae)和GXIMD112 (Kocuria kristinae)的500μg·mL-1细菌粗提物具有延缓线虫衰老的活性, 能不同程度的延长线虫寿命, 提高线虫产卵量、运动能力、热激损伤能力、抗氧化损伤能力、体内酶活性以及改善虫体表皮形态。Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌具有较高的物种多样性, 蕴藏着丰富的微生物资源, 且部分细菌菌株具有延缓衰老的生物活性。

关键词： 珊瑚礁; 海洋细菌; 物种多样性; 延缓衰老活性

本文引用格式

韩敏敏 , 李蜜 , 刘昕明 , 刘永宏 , 龙超 , 钟振国 , 易湘茜 , 高程海 . Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌多样性及细菌粗提物延缓秀丽隐杆线虫衰老活性研究*[J]. 热带海洋学报, 2020 , 39(5) : 19 -29 . DOI: 10.11978/2019126

Abstract

Two coral reef sediment samples were collected from the coral reef growth areas of Khai Island and Pathiu Island After the samples were pretreated, six kinds of separation medium were adopted to obtain the active Marine bacterial strains. Through PCR amplification and 16s rRNA gene sequencing, species diversity was analyzed and phylogenetic trees were constructed. The effect of fermentation extract of Caenorhabditis elegans strain on senescence was investigated. The results showed that 22 strains of bacteria were isolated and identified from four samples, belonging to 11 orders, 13 families and 14 genera. There were two strains of bacteria with 16S rRNA gene sequence similarity less than 98.65 %, which were suspected to be potential new species. The crude extracts of 500 μg·mL -1bacteria from GXIMD014 (Vibrio galatheae) and GXIMD112 (Kocuria kristinae) have the activity of delaying the aging of Caenorhabditis elegans, and can prolong the life of Caenorhabditis elegans to different degrees, improve the oviposition, motility, heat-induced injury, ability to resist oxidative damage, enzyme activity in vivo, and improve the epidermal morphology of Caenorhabditis elegans. Coral reef sediment bacteria of Khai Island and Pathiu Island have high species diversity and rich microbial and bacterial resources, and some bacterial strains have anti-aging biological activity.

Key words： coral reef; marine bacteria; species diversity; anti-aging activity

*感谢广西中医药大学海洋药物研究院海洋生物研究室、广西科学院和广西壮族自治区海洋研究院对本论文完成提供的帮助。
日益加速的世界人口老龄化趋势已对社会经济发展产生了深远影响, 如何安全有效的延缓机体衰老进程成为急需解决的问题, 研制开发延缓衰老药物具有可观的研究前景与社会价值。1963年Brenner (1974)首次发现了秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(本文中简称线虫)可以作为研究发育生物学和神经生物学的理想模型动物。线虫基因与人类基因有高度同源性(60%~80%), 并具有易培养、易观察、生命周期短、神经系统完善等独特优势(Takuma, 2016; Park et al, 2017), 因而许多衰老相关疾病已用线虫造模进行研究。泰国湾位于东南亚中南半岛的南部, 总面积约为25×104km2, 海岸线长达1874.8km。珊瑚礁是泰国湾非常重要的海洋生态环境。近年来, 有不少研究者相继从泰国湾海域的珊瑚礁区采集的样品中分离得到放线菌、真菌和细菌, 相比之下对细菌的研究报道较少。Thawornwiriyanun等(2012)曾报道从泰国湾海域珊瑚礁区海绵中分离得到3株产玉米黄素细菌(CHOB06-6、KODA19-6和MAKB08-4), 其中菌株CHOB06-6和MAKB08-4为Sphingomonas phyllosphaerae FA2T的近缘种, 菌株KODA19-6为Shingomonas (Blastomonas) natatoria DSM 3183T近缘种, 并且经实验证明海绵相关细菌具有抗菌作用, 在海绵的防御机制中起着重要作用。Supong等(2013)从泰国湾海域的斯昌岛珊瑚礁区的一种海绵中分离出海绵小单孢菌(Micromonospora spongicola), 经16s rRNA基因鉴定分析为放线菌。Luepongpattana等(2017)从泰国湾海域的Koh Sichang岛珊瑚礁生长区分离到一些真菌, 并鉴定为金葡菌YTP6-14, 检测其生物表面活性剂特性, 制备出了Massoia内酯。由此可见泰国湾海域丰富的珊瑚礁资源蕴藏着各种各样的海洋微生物, 并且很多海洋微生物衍生分子已证实具有重要的药用价值(Hartmann et al, 2017)。
本研究从2份珊瑚礁沉积物样品中分离鉴定细菌菌株, 结合基因序列分析其多样性, 并采用线虫模型以寿命实验进行活性初筛测试, 探讨发酵菌株提取液对线虫相关指标的延缓衰老作用, 发现新型微生物来源的活性菌株, 以期寻求具有药用价值的细菌资源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集与处理
2018年8月在Khai岛(99º24′29′′—99º24′42′′E, 10º41′57′′—10º42º14′′N)和Pathiu岛(99º22′41′′—99º23′15′′E, 10º42′09′′—10º42′48′′N)共采集了2份珊瑚礁沉积物样品, 主要包括4种样品(珊瑚礁1、海水1、珊瑚礁2、海水2)。将采集到的样品放入灭菌封口袋内, 暂存于冰盒内, 带回实验室于4°C冰箱低温保存备用。
参考李菲等(2018)方法, 对样品分别进行处理。室温条件下, 称取2.0g珊瑚礁样品置于灭菌研钵中, 加入8mL无菌盐水充分研磨; 再取珊瑚礁中留下的海水以10-1梯度稀释, 依次稀释成10-3g·mL-1和10-4g·mL-1的样液; 分别涂布原液和稀释液各100μL于6种培养基中, 每个浓度梯度平行涂布2个平板, 置于恒温培养箱中28°C培养。
1.1.2 线虫培养相关材料
1) N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, Bristol strain N2)和尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50 (E. coli OP50)由广西科学院汪斌博士惠赠。
2) 线虫生长培养基为NGM培养基: 称取3g NaCl, 2.5g蛋白胨, 17g琼脂, 加入25mL K3PO4缓冲液(K2HPO4 3.56g, KH2PO4 10.83g, 加水至100mL), 975mL蒸馏水, 灭菌后加入抽滤除菌的5mg·mL-1胆固醇溶液1mL, 1mol·L-1 MgSO4溶液1mL, 1mol·L-1CaCl2溶液1mL。
3) 含过氧化氢的NGM培养基: 将灭菌NGM培养基置于无菌超净台中冷却至60°C时加入10mM过氧化氢溶液, 混合均匀后倒板, 4°C冰箱中避光保存备用。
4) 用于总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量测定的培养基: 将灭菌NGM培养基置于无菌超净台中冷却至60°C时加入5-氟尿嘧啶, 混合均匀后倒板。4°C冰箱中避光保存备用。
1.1.3 培养基的配制
1.1.3.1 分离培养基
参考孙静等(2014)采用的培养基, 设计如下6种分离培养基用于菌株分离, 分别为高氏一号、M7、M9、M10、P3和PDA。具体配方如下: 高氏一号培养基: 可溶性淀粉20g, KNO3 1g, K2HPO4 0.5g, MgSO4 0.5g, FeSO4 0.01g, NaCl 0.5g; M7培养基: 酵母粉5g, L-天冬酰胺1g, 甘油10g, 复合盐溶液10mL; M9培养基: 甘油6mL, 精氨酸1g, L-天冬酰胺1g, 复合盐溶液10mL; M10培养基: 葡萄糖10g, 水解酪素0.5g, 复合盐溶液10mL; P3培养基: 燕麦粉20g, 复合盐溶液10mL; PDA培养基: 土豆粉200g, 葡萄糖20g。每种培养基均加入1L海水、海盐30g, 调节pH至7.2~7.4, 然后加入20g琼脂, 121°C灭菌20min。复合盐溶液: KNO3 1.0g, NaCl 0.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, K2HPO4 0.5g, NH4NO3 0.1g, FeSO4 0.01g, MnCl2·H2O 0.001g, ZnSO4·7H2O 0.001g, 去离子水1L。
1.1.3.2 纯化及保藏培养基
改良ISP2固体培养基: 酵母提取物2.0g, 麦芽提取物2.0g, 葡萄糖2.0g, 琼脂 14.0g, 海水1L, pH 7.2。
1.1.3.3 发酵培养基
改良ISP2液体培养基: 酵母提取物2.0g, 麦芽提取物2.0g, 葡萄糖2.0g, 海水1L, pH 7.2。
1.1.4 主要仪器与试剂
主要仪器包括OLYMPUS SZX16体视镜[奥林巴斯(北京)销售服务有限公司]、钨丝灯扫描电子显微镜(苏州佐藤精密仪器有限公司)、SPH-200B振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)、超净工作台(北京亚泰科隆仪器有限公司)、恒温培养箱(上海博讯实业有限公司)、Systerc VB-75灭菌锅(日本Sanyo公司)、小型离心机(德国Sigma公司)、B-100旋转蒸发仪(上海沃珑仪器有限公司)、恒温水浴锅(常州市亿能实验仪器厂)、PCR扩增仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)、电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像仪(美国BioRad公司)。主要试剂包括培养基原料、PCR引物及其相关试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司、Chelex-100树脂购自上海伯乐生命医学产品有限公司、BCA蛋白试剂盒及总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒购自南京建成生物工程研究所、其他有机试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化及保藏
培养平板于28°C恒温培养箱中培养14~30d, 通过观察菌落形态特征, 挑选表面光滑的单菌落, 使用改良ISP2培养基进行分离纯化, 如有杂菌则进行二次或多次纯化, 直至获得纯净的单菌落, 同时记录菌落数及菌落的形态特征。纯化后的菌株制成体积分数为20%甘油管, 于-80°C超低温冰箱保存。
1.2.2 分离菌株的分子生物学鉴定
参考Chelex-100 Resin法(周双清 等, 2010)对分离菌株进行基因组DNA提取。利用16S rRNA基因序列分析对分离得到的菌株进行鉴定。PCR扩增和测序采用细菌通用引物, 分别为27F (5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3')、1492R (5'-GGTTACC TTGTTACGACTT-3'), PCR扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司进行序列测定。PCR扩增程序为: 94°C, 5min; 94°C, 30s; 50°C, 40s; 72°C, 2min; 共35个循环扩增。采用1%琼脂糖凝胶电泳处理PCR扩增产物, Bio-RAD凝胶成像系统观察电泳跑胶结果。条带合格后委托上海美吉广州分公司进行DNA测序。测序结果采用DNA Star软件处理, 登陆数据库EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net)(Kim et al, 2009)进行在线比对, 对测序得到的16S rRNA基因序列进行相似性搜索分析, 选取同源性最高典型菌株序列。
1.2.3 样品粗提物的制备
将22株培养至对数生长期的菌株分别接种于200mL改良ISP2液体培养基中发酵7d, 离心收集发酵液, 立即用乙酸乙酯萃取, 取乙酸乙酯层减压浓缩备用。收集粗提物, 置于干燥器中低温保存, 用于延缓衰老活性研究。
1.2.4 秀丽隐杆线虫的培养与同期化
将线虫挑至含E. coli OP50的NGM平板中, 于恒温培养箱中20°C培养。采用高氯酸钠裂解法获取同期化线虫, 具体操作为: 用提前4°C预冷的M9缓冲液将正处于产卵期的雌雄同体线虫虫体从NGM平板上冲洗至无菌离心管中。按照1:3比例向离心管中加入裂解液, 手动摇匀混合约3~5min, 离心30~60s, 转速为3000r·min-1, 弃去上清液收集沉淀。沉淀用已灭菌的M9溶液反复清洗2~3次, 再转至含E. coli OP50的NGM平板中, 置于20°C培养箱中培养, 待卵发育为成虫后, 视为同期化线虫, 可用于实验研究。
1.2.5 珊瑚礁沉积物细菌延缓线虫衰老活性研究
1.2.5.1 线虫寿命实验
菌株提取物样品用质量分数为1% DMSO溶液超声溶解使其浓度为500μg·mL-1, 于4°C冰箱中保存备用。将培养好的L4期(即成虫期)线虫挑至加有50μL 粗提物溶液的NGM平板中, 每组2板, 每板20条L4期线虫, 放入20°C培养箱中培养, 此时培养天数记为第0d。此后, 隔天对培养基中的线虫进行计数, 每次观察并记录线虫生存、死亡及剔除的数量, 将线虫每2d转移至新的含粗提物溶液的NGM平板中, 直至线虫全部死亡。寿命实验作为活性菌株初筛实验, 为进一步探讨其延缓衰老作用加强依据。
1.2.5.2 线虫产卵量的测定
待同期化的卵成长至L4期时, 每组3条线虫, 挑至NGM平板中, 于20°C培养箱培养, 每24h更换培养基, 直到线虫不再产卵为止。为方便和准确计数虫卵个数, 于线虫第一次产卵的3d后计数, 直至线虫产卵结束。线虫丢失、爬璧脱水死亡、虫带均不计入统计数据。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组。实验重复3次。
1.2.5.3 线虫移动能力的测定
待同期化的卵成长至L4期时, 每组70条线虫, 转移至NGM平板中, 于20°C培养箱培养, 每24h转移至新板中, 直至线虫全部死亡。记录样品组线虫每日的运动情况并统计。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组。行动力可分为A、B、C 3个等级, 判断标准如下: 线虫自主活动自如定义为A, 仅在挑针触碰头部或尾部后开始爬行定义为C, 介于两者之间的为B。实验重复3次。
1.2.5.4 热应激实验
待同期化的卵成长至L4期时, 连续给药3d后, 更换至新的NGM平板中, 将平板密封后放置在35°C恒温培养箱中至线虫全部死亡。每小时统计存活率, 用触碰产生响应的线虫数与线虫总数的比值表示。线虫丢失、爬璧脱水死亡、虫带均不计入统计数据。每组30条线虫。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组。实验重复3次。
1.2.5.5 H2O2氧化损伤实验
待同期化的卵成长至L4期时, 将线虫转移到含500μg·mL-1细菌粗提物溶液的NGM平板上, 为防止卵和幼虫发育对实验结果造成影响, 每24h将线虫转移至新鲜涂布的含粗提物溶液的新板中, 连续喂食粗提物溶液3d。在第4d时, 进行H2O2损伤抵抗实验。
将线虫转移至相对应组别的含10mM H2O2的NGM平板上, 放入20°C培养箱密封避光培养。每隔0.5h观察线虫状态并统计存活数, 每组40条线虫。线虫丢失、爬璧脱水死亡、虫带均不计入统计数据。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组。实验重复3次。
1.2.5.6 检测超氧化物歧化酶(SOD)表达量
待同期化的卵成长至L4期, 为防止卵和幼虫发育对实验结果造成影响, 每24h转移至新的含粗提物溶液的新板上, 20°C培养4d后, 测定线虫体内超氧化物歧化酶含量, 每组80条线虫。
用M9缓冲液冲洗收集虫卵于1.5mL的EP管中, 离心清洗3次, 将每组线虫重悬于0.5mL 0.9%生理盐水中, 冰水浴条件下机械匀浆, 制成10%的匀浆液, 3000r·min-1离心10min, 取上清液测定。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组。
SOD酶测定按照总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒的操作要求进行。依次加入试剂后混匀, 置37°C恒温水浴锅中温育40min, 加入显色剂, 在室温条件下平衡10min。用紫外可见分光光度计在550nm处, 使用1cm光径比色杯, 双蒸水调零, 测定吸光度, 计算SOD活力值。
1.2.5.7 线虫随年龄增长的形态学变化
待同期化的卵成长至L4期, 将所需线虫转移至含500μg·mL-1粗提物溶液的平板中, 在成虫第9d时取出所用线虫, 用M9缓冲液冲洗两次, 然后于37°C烘箱中保持5min后取出, 扫描电子显微镜观察。设置对照组(大肠杆菌组)和样品组, 每组5条。

2 结果与分析

2.1 珊瑚礁沉积物样品中细菌多样性分析

采用6种分离培养基, 从4种样品中分离得到35株细菌, 进行16S rRNA基因扩增和序列分析, 根据菌落形态特征及基因序列测序结果去冗余, 最终从35株细菌中选取22株细菌进行16S rRNA基因序列的系统多样性分析。结果如表1和图1所示, 22株菌分别属于4个大的系统发育类群: 厚壁菌门(Firmicutes, 31.82%)、变形菌门(Proteobacteria, 54.55%)、放线菌门(Actinobacteria, 9.09%)和拟杆菌门(Bacteroidetes, 4.54%)。其中有4株菌属于葡萄球菌属(Staphylococcus), 占所分离菌株总数的18.19%, 为优势菌属。根据22株细菌及其参比细菌16S rRNA基因序列构建了N-J系统进化树(图1), 4种样品中分离得到2株细菌的16S rRNA基因序列与其最近缘的典型菌株序列相似性低于98.65%, 其中菌株GXIMD144与有效发表菌株Aestuariibacter aggregatus WH169T (保藏号: FJ847832)、GXIMD003与有效发表菌株Alteromonas marina SW-47T (保藏号: AF529060)发育关系最为密切, 其相似性分别为96.68%和97.93%, 结合Kim等(2014)的潜在新属或新种的归类原则, 初步判断以上2株细菌可能为潜在新细菌物种。
表1 22株珊瑚礁沉积物细菌的物种多样性

Tab. 1 The species diversity of 22 sediment bacteria in coral reefs

类群 菌株编号 相似性最高模式菌株 16S rRNA基因
序列相似性/%		 GenBank登录号
Kocuria sp. GXIMD112 K. Kristinae (BCSM01000028) 99.74 MT111730
Vibrio sp. GXIMD014 V. Galatheae (JXXV01000023) 99.35 MT111742
GXIMD099 V. Sagamiensis (AB428909) 98.75
Bacillus sp. GXIMD115 B. Megaterium (JJMH01000057) 99.74
GXIMD039 B. Aryabhattai (EF114313) 99.48
GXIMD105 B. Altitudinis (ASJC01000029) 98.97
Pseudomonas sp. GXIMD091 P. Pachastrellae (MUBC01000081) 98.97
Shewanel sp. GXIMD013 S.Waksmanii (AY170366) 99.59
Staphylococcus sp. GXIMD124 S. Gallinarum (D83366) 99.23
GXIMD017 S. Nepalensis (UHDS01000001) 99.09
GXIMD114 S. Haemolyticus (LILF01000056) 100.00
GXIMD133 S. hominis subsp. Novobiosepticus (AB233326) 99.35
Achromobacter sp. GXIMD088 A. marplatensis (EU150134) 98.83
GXIMD134 A. Ruhlandii (AB010840) 99.61
Leeuwenhoekiella sp. GXIMD126 L. Palythoae (jgi.1059018) 98.83
Marinomonas sp. GXIMD067 M. Vaga (X67025) 99.09
Gordonia sp. GXIMD145-1 G. Bronchialis (CP001802) 99.23
Rhizobium sp. GXIMD055 R. Roseltifomans (EU781656) 99.36
Erythrobacter sp. GXIMD154 E. Pelagi (HQ203045) 99.87
Alteromonas sp. GXIMD063 A. Macleodii (CP003841) 99.61
GXIMD003 A. Marina (AF529060) 97.93
Aestuariibacter sp. GXIMD144 A. aggregatus (FJ847832) 96.68

注: 2株活性菌株(GXIMD112和GXIMD014)的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库得到GenBank登录号, 其他菌株未获得GenBank登录号

图1 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树

标尺0.005为进化距离; 分支点上的数值为1000次bootstrap分析所得值

Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.2 珊瑚礁沉积物细菌在样品及培养基中的分布

2.2.1 珊瑚礁沉积物细菌在样品中的分布来源于4种样品的细菌种类和数量显示出一定差异, 但差异并不显著(图2)。珊瑚礁样品2分离得到的菌株数量最多, 共17株, 分别属于交替单胞菌属、芽孢杆菌属、假交替单胞菌属等7种细菌属。珊瑚礁样品1分离得到12株细菌, 分别属于根瘤菌属、弧菌属、海单胞菌属等9种细菌属。海水样品1分离得到14株细菌, 分别属于10种细菌属。海水样品2分离到14株细菌, 分别属于9种细菌属。海水样品1分离得到14株细菌, 分别属于交替单胞菌属、列文虎克菌属、希瓦氏菌属10种细菌属。海水样品2分离到14株细菌, 分别属于腐生球菌属、戈登氏菌属、假单胞菌属等9种细菌属。可见珊瑚礁样品中细菌数量与海水样品中细菌数量差异并不显著, 但从菌株菌属分布多样性角度来看, 珊瑚礁样品中菌株菌属丰富度较高。
图2 不同样品中分离得到的细菌数量

Fig. 2 The number of bacteria isolated from different

2.2.2 不同培养基对珊瑚礁沉积物细菌的分离效果本实验采用6种分离培养基, 从4种样品中分离获得22株细菌, 不同培养基分离得到的细菌数量差异较大, 具体如图3所示。6种分离培养基的分离效果显示: PDA培养基分离到的菌株最多(18株), 菌属最为丰富且分布最为广泛, 包括芽孢杆菌属、无色杆菌属、弧菌属等11个属; 其次是高氏一号培养基(10株)和M10培养基(9株), 均分离得到弧菌属, 且菌株分布种属较为丰富; M7培养基(6株)、P3培养基(3株)和M9培养基(1株)均分离到弧菌属。综上可见, PDA培养基上分离得到的细菌种类丰富并且有利于珊瑚礁细菌的分离纯化。此外, 在PDA培养基的分离过程中, 未加细菌抑制剂, 所以分离到的细菌数量较多, 其中分离到的腐生球菌属的菌株最多。
图3 6种培养基的分离效果

Fig. 3 Isolation effects of six mediums

2.3 22株珊瑚礁沉积物细菌的发酵提取物在线虫模型中的延缓衰老作用

2.3.1 珊瑚礁沉积物细菌的发酵提取物对线虫寿命的影响本研究分别测试了22株细菌的质量浓度为500μg·mL-1的发酵粗提物样品对线虫寿命的影响, 并分析了其平均寿命和最长寿命。结果显示, 在编号为GXIMD014、GXIMD112和GXIMD039的3株珊瑚礁沉积物细菌的发酵粗提物中培养的线虫的平均寿命和最长寿命高于对照组(表2)。与对照组相比,菌株GXIMD039 (B. aryabhattai)组的平均寿命增长了18.41% (p<0.05), 最长寿命提高了16.25%; 菌株GXIMD014 (V. galatheae) 组线虫的平均寿命增长了30.40%, 最长寿命提高了27.51%; GXIMD112 (K. kristinae)组线虫的平均寿命增长了22.40% (p<0.01), 最长寿命提高了25.44%, 说明这3株细菌的粗提物均能不同程度的延长线虫寿命。本文利用这3株细菌的粗提物样品进行延缓衰老的生物活性测试, 表3为3株细菌的粗提物样品的基本信息。
表2 22株珊瑚礁沉积物细菌的粗提物对秀丽隐杆线虫生存寿命的影响($\bar{x}$±s, n=40)

Tab. 2 Effects of crude extracts from 22 coral reef sediment bacteria on the lifespan of Caenorhabditis elegans ($\bar{x}$±s, n=40)

菌株编号 平均寿命/d 最长寿命/d 菌株编号 平均寿命/d 最长寿命/d
1% DMSO 16.68±1.057 18.83 GXIMD039 19.75±1.060* 21.89
GXIMD055 14.50±0.844 16.21 GXIMD114 15.30±0.834 16.99
GXIMD099 15.50±0.938 17.40 GXIMD115 14.25±0.839 15.95
GXIMD154 16.56±1.126 18.84 GXIMD091 17.10±1.261 19.65
GXIMD144 14.30±0.818 15.96 GXIMD088 15.65±0.826 17.32
GXIMD112 20.75±1.417** 23.62 GXIMD145-1 14.27±0.891 16.08
GXIMD013 16.20±0.891 18.00 GXIMD014 21.75±1.119** 22.01
GXIMD124 16.45±1.041 18.56 GXIMD003 15.05±0.950 16.97
GXIMD017 17.22±1.250 19.78 GXIMD134 16.10±1.107 18.34
GXIMD126 15.20±0.925 17.07 GXIMD063 13.25±0.867 15.00
GXIMD067 13.15±0.671 14.51 GXIMD133 14.40±0.817 16.05
GXIMD105 14.22±1.010 16.26

注: *表示与对照组比较, 差异显著(p<0.05); **表示与对照组比较, 差异极显著(p<0.01)

表3 3株细菌粗提物样品的基本信息

Tab. 3 Basic information of crude extract samples of three strains of bacteria

属 种 菌株粗提物 菌株粗提物编号 浓度/(μg·mL-1) 菌株粗提物编号
Vibrio sp. Vibrio galatheae GXIMD014细菌粗提物 S1 250 S1-1
500 S1-2
1000 S1-3
Kocuria sp. Kocuria kristinae GXIMD112细菌粗提物 S2 250 S2-1
500 S2-2
1000 S2-3
Bacillus sp. Bacillus aryabhattai GXIMD039细菌粗提物 S3 250 S3-1
500 S3-2
1000 S3-3
2.3.2 3株细菌的发酵提取物对线虫产卵量的影响
从图4可以看出, S1-1、S1-2、S1-3和S2-1、S2-2、S2-3均能提高线虫总产卵量, 其中以S1-2提高线虫总产卵量最明显(p<0.05)。
图4 不同浓度不同种类的细菌提取物对线虫总产卵量的影响

*表示p<0.05, 具有显著性意义

Fig. 4 Effects of different concentrations and species of bacterial extracts on total oviposition of Caenorhabditis elegans.

* indicates p < 0.05, which is significant

从图5可以看出, S1-2和S2-2均能提高线虫每日产卵量, 成虫期给药后的第3d产卵量最多, 随后每天的产卵量逐渐降低, 在第6d后, 基本停止产卵。以S1-2明显高于对照组的产卵量, 提高线虫日产卵量效果最为明显。而S3-2从线虫总产卵量和日产卵量分析结果来看, 并没有提高线虫产卵量的效果。
图5 质量浓度为500μg·mL-1的细菌提取物对线虫日产卵量的影响

Fig. 5 Effect of bacterial extract with a mass concentration of 500 μg·mL-1 on the daily oviposition of Caenorhabditis elegans

综合来看, S1和S2对线虫产卵量具有较为明显的促进作用, 主要以S1-2和S2-2对成虫繁殖力影响显著, 而S3不能提高线虫繁殖力。
2.3.3 3株细菌的发酵提取物对线虫移动能力的影响
线虫移动能力是评价线虫正常运动的生理指标之一, 线虫的肌肉功能与衰老密切相关。本研究测试了喂食粗提物溶液后第3、9和16d时线虫的移动能力(图6)。第3d时, 各组线虫的行动力都比较活跃, 划分为A级。第9d时, S1-2、S2-2和S3-2划分为A级的线虫大约占70.00%、65.71%和30.00%, 对照组A级所占的比例为35.71%。第16d时, S1-2、S2-2和S3-2划分为A级的线虫大约占30.00%、20.00%和0, 对照组A级所占的比例为0, 而B、C级的线虫大约占35.71%和64.29%。综合来看, S1-2和S2-2样品对线虫运动行为更为活跃, 其中S1-2增强运动能力的效果较为明显, 而S3-2没有增强线虫运动能力的效果。
图6 质量浓度为500μg·mL-1的细菌提取物对秀丽隐杆线虫移动能力的影响

A、B、C为线虫移动能力等级

Fig. 6 Effect of bacterial extract with a mass concentration of 500 μg·mL-1 on the mobility of Caenorhabditis elegans

2.3.4 3株细菌的发酵提取物对线虫抗热激损伤能力的影响
在35°C热激条件下, 3株细菌粗提物对线虫的抗热保护作用如图7所示, 与对照组比较, S1-2能显著提高线虫抗热激能力(p<0.05), S2-2也能提高线虫抗热激能力, 但无显著性, 而S3-2没有抗热激损伤能力。
图7 质量浓度为500μg·mL-1的细菌提取物对各组秀丽隐杆线虫热应激损伤的影响

*表示p<0.05, 具有显著性意义

Fig. 7 Effect of bacterial extract with a mass concentration of 500 μg·mL-1 on heat stress injury of Caenorhabditis elegans.

* indicates p < 0.05, which is significant

2.3.5 3株细菌的发酵提取物对线虫抗氧化损伤能力的影响
3株细菌的发酵粗提物(S1-2、S2-2和S3-2)对线虫氧化损伤抵抗的影响见图8, 其中S1-2和S2-2均具有抗氧化损伤能力, 以S1-2效果较为显著。而S3-2没有提高线虫耐受能力的效果。综合来看, S1-2和S2-2对H2O2损伤条件下的线虫有显著的保护作用, 表明了这两株细菌粗提物具有一定抗氧化损伤能力, 而S3-2没有此效果。
图8 质量浓度为500μg·mL-1的细菌提取物对线虫氧化损伤抵抗的影响

Fig. 8 Effect of bacterial extract with a mass concentration of 500 μg·mL-1 on oxidative damage resistance of Caenorhabditis elegans

2.3.6 3株细菌的发酵提取物对线虫体内SOD含量的影响
线虫体内SOD含量能够直观体现线虫抗氧化、抗衰老的程度(王怀玲, 2018)。细菌发酵提取物对线虫体内SOD表达的影响如图9所示, S1-2喂食线虫后, 线虫体内SOD相对含量显著高于对照组(p<0.05), 较对照组提高46.95%, 效果较明显。S2-2喂食线虫后, SOD相对含量较对照组提高17.46%, 而S3-2的SOD相对含量比对照组低。表明S1-2和S2-2样品喂食线虫后, 线虫体内的超氧化物歧化酶表达量提高。
图9 质量浓度为500μg·mL-1的细菌提取物对线虫SOD表达的影响

*表示p<0.05, 具有显著性意义

Fig. 9 Effect of bacterial extract with a mass concentration of 500 μg·mL-1 on SOD expression of Caenorhabditis elegans.

* indicates p < 0.05, which is significant

2.3.7 3株细菌的发酵提取物可减轻随年龄增长的形态学衰退
众所周知, 随着年龄的增长, 线虫的肌肉和虫体表面会出现严重的形态缺陷(Herndon et al, 2002)。成虫第9d时的对照组和3个药物组的虫体扫描电镜图显示体壁肌肉体积无明显差异, 但虫体表皮形态有明显差异(图10)。对照组第9d成虫的表皮开始出现老化的“褶皱”和“破裂”现象, S3-2虫体表皮也出现轻微“褶皱”现象, 而S1-2和S2-2样品的线虫表皮形态变化类似于成虫期的虫体形态。结合已报道研究中线虫表皮在维持其形状和大小方面的重要作用(Chisholm et al, 2012), 可以认为正是这种对表皮退化的改善使得经活性菌株(GXIMD014和GXIMD112)处理的线虫能够保持健康、年轻的形态。因此, 与对照组相比, S1和S2样品能延缓线虫随年龄增长的形态衰退, 而S3不能。结合以上线虫相关衰老指标的活性测试结果, 再次验证了活性菌株(S1和S2)具有延缓线虫衰老的活性。
图10 样品组与对照组线虫的扫描电镜图(3000×)

a. 对照组, 图中箭头所指为成虫表皮出现的老化现象; b和c. S1和S2, 成虫未见表皮结构异常; d. S3, 图中箭头所指为成虫表皮有轻微“褶皱”现象

Fig. 10 Scanning electrogram of Caenorhabditis elegans in sample group and control group (3000×).

(a) Control group, the arrows in the figure refer to the aging phenomenon of the adult. (b and c) S1 and S2, no epidermal structural abnormalities were observed in the adults. (d) S3, the arrow in the figure indicates that the epidermis of the adult has a slight “fold”

3 结论

利用16S rDNA基因序列分析方法, 本研究从2份海洋珊瑚礁沉积物样品中分离鉴定到22株海洋细菌, 分属于11目13科14属, 优势菌属为葡萄球菌属(Staphylococcus)。研究结果表明, Khai岛和Pathiu岛珊瑚礁沉积物细菌资源的丰富性。
此次在菌株分离过程中发现, 分离培养基类型会影响出菌率。本实验选用了6种分离培养基, 分离到14个菌属的细菌, 其中以PDA培养基分离出的菌株数量所占比例最大, 其他类型的培养基分离出的菌株较少, 说明培养基类型影响菌株的生长发育。因此, 在以后的实验中应多选择尝试不同类型的培养基进行菌株培养, 以提高获得其他稀有细菌的可能性。
本研究采用经典衰老模型生物秀丽隐杆线虫为研究对象, 测试22株细菌的发酵粗提物的抗衰老活性。延缓衰老指标评估表明, S1 (V. galatheae)和S2 (K. kristinae) 的500μg·mL-1细菌粗提物具有较为显著延缓线虫衰老的作用, 能够延长线虫的寿命, 提高线虫的产卵量、移动能力、热应激、氧化损伤抵抗能力、体内SOD含量表达以及能改善线虫形态学衰退现象, 进而达到延缓衰老的保护作用, 为后续延缓衰老药物的开发奠定了基础。

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