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热带海洋学报 >

2021 , Vol. 40 >Issue 2: 27 - 38

DOI: https://doi.org/10.11978/2020055

海洋生物学

Epsilon-变形菌趋化信号通路中偶联蛋白CheV与趋化受体蛋白的CZB结构域的功能研究

  • 刘煜耿 , 1, 2 ,
  • 毛颖津 1, 2 ,
  • 章灿川 1, 2 ,
  • 高贝乐 , 1
展开
  • 1.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省海洋药物重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
高贝乐。email:

刘煜耿(1994—), 男, 广东省揭阳市人, 硕士研究生, 研究方向为微生物功能基因组学。email:

Copy editor: 殷波

收稿日期: 2020-05-26

  要求修回日期: 2020-06-29

  网络出版日期: 2020-07-29

基金资助

国家自然科学基金(31870064)

版权

版权所有，未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
收起

Functional study of coupling protein CheV and CZB domain of chemoreceptors in the Epsilon-proteobacteria chemotaxis signaling pathway

  • LIU Yugeng , 1, 2 ,
  • MAO Yingjin 1, 2 ,
  • ZHANG Canchuan 1, 2 ,
  • GAO Beile , 1
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
GAO Beile. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2020-05-26

  Request revised date: 2020-06-29

  Online published: 2020-07-29

Supported by

National Science Foundation of China(31870064)

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Copyright reserved © 2021.
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摘要

细菌通过趋化系统感知和响应外界环境变化并进行趋利避害, 因此很多细菌进化出了非常复杂多样的趋化系统以适应不同的生态位。Epsilon-变形菌广泛存在于自然界中, 能适应不同的生态环境, 特别是深海Epsilon-变形菌能适应深海热液口和冷泉等极端环境, 其趋化系统可能有其独特之处。通过BlastP和MIST数据库分析, 我们发现大部分深海Epsilon-变形菌拥有F3类型趋化系统且具有单拷贝的双功能域融合蛋白CheV。此外, 一种特殊结构域CZB (C-terminal Zinc-Binding) 存在于深海Epsilon-变形菌的趋化受体蛋白中, 而且在部分深海Epsilon-变形菌的趋化受体中还发现并鉴定了一种新的结构域CZB-like结构域。文章以Epsilon-变形菌的模式菌株空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni 81-176)为研究对象, 用细菌双杂交试验证实了CheV能与所有含MA结构域的趋化受体相互作用。用电感耦合等离子体质谱(ICP-Mass)技术证实了CZB-like结构域不能结合Zn离子, 但细菌双杂交试验证实它能介导趋化受体Tlp9与CheV的互作。

关键词： Epsilon-变形菌; 趋化系统; 融合蛋白CheV; CZB结构域

本文引用格式

刘煜耿 , 毛颖津 , 章灿川 , 高贝乐 . Epsilon-变形菌趋化信号通路中偶联蛋白CheV与趋化受体蛋白的CZB结构域的功能研究[J]. 热带海洋学报, 2021 , 40(2) : 27 -38 . DOI: 10.11978/2020055

Abstract

Epsilon-proteobacteria is widely distributed, from deep-sea hydrothermal vent to surface sea water, from free-living environment to host-associated one. Chemotaxis plays an important role in bacteria survival through sensing and responding to environmental changes. Thus, some bacteria have evolved into many complex and diverse chemotaxis systems. Epsilon-proteobacteria can adapt to different environments; especially, some species can survive in the deep-sea extreme environments including hydrothermal vent and cold seep, whose chemotaxis system may have special characteristics. Bioinformatics analyses by BlastP and MIST database revealed that most Epsilon-proteobacteria species in the deep-sea hydrothermal vent have F3 type chemotaxis system. They all contain a single copy of CheV, which is a double domain fusion protein. Besides, a unique domain, CZB (C-terminal Zinc-Binding) domain, exists in chemoreceptors of deep-sea Epsilon- proteobacteria. A CZB-like domain is also identified in Epsilon-proteobacteria. Using the model strain Campylobacter jejuni 81-176, we confirmed that CheV can interact with all chemoreceptors with MA domain by bacterial two-hybrid experiments. Additionally, we demonstrated that CZB-like domain cannot bind Zn by ICP-Mass, but it can promote the interaction between chemoreceptor Tlp9 and CheV.

Key words： Epsilon-proteobacteria; chemotaxis; CheV; CZB domain

Epsilon-变形菌广泛分布于自然界中, 包括深海热液喷口富集的Caminibacter、Nautilia、Nitratifractor、Sulfurimonas和Hydrogenimonas等属, 水环境或沉积物中分离的Sulfurospirillum、Sulfuricurvum、Thiovulum等属和部分Arcobacter属, 以及人和动物的胃肠道致病菌Campylobacter和Helicobacter属 (Campbell et al, 2006)。Epsilon-变形菌是深海热液口生态系统中的优势菌群, 可以占据高达85%的微生物量, 是深海热液口生态系统中重要的初级生产者 (Waite et al, 2017; McNichol et al, 2018)。由于环境分离获得纯培养的Epsilon-变形菌特别是深海极端环境富集的Epsilon-变形菌的数量较少, 目前关于这类菌的研究报道主要集中在两大病原菌——空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(Campbell et al, 2006)。因此, 空肠弯曲菌和幽门螺杆菌成为研究Epsilon-变形菌的模式菌。
趋化作用是细菌重要的环境适应机制。细菌通过趋化信号系统感知周围物质浓度变化, 并将胞外的化学刺激转变成鞭毛马达转动方向改变的信号, 促使细菌改变运动轨迹趋利避害(Lertsethtakarn et al, 2011)。经典的模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)的趋化信号转导组分包括5个趋化受体蛋白MCP (Methyl-accepting Chemotaxis Proteins)、一个偶联蛋白CheW、一个激酶CheA、一个应答蛋白CheY、一个磷酸酶CheZ和一个由甲基酯酶CheB和甲基转移酶CheR两个蛋白组成的趋化适应系统(Chemotaxis adaptation system)(图1a)(张云怡 等, 2011)。E. coli的趋化受体蛋白可以与CheW、CheA互作在细胞极点形成一个稳定且高效合作的跨膜趋化受体蛋白复合体(Parkinson et al, 2015; Piñas et al, 2016)。细菌通过这种趋化受体复合体感知外界信号并通过蛋白磷酸化反应进行信号传递, 最终磷酸化的CheY作用于鞭毛并使细菌改变运动方向(Delalez et al, 2010; Porter et al, 2011)。但是, 相较于经典的E. coli趋化信号系统, 其他细菌的趋化系统呈现复杂性和多样性(Wadhams et al, 2004; Stocker et al, 2012)。比如, Bacillus subtilis多出一个偶联蛋白CheV和另一套由磷酸酶CheC和脱酰胺酶CheD组成的适应系统(Rao et al, 2008; Alexander et al, 2010); Helicobacter pylori虽没有经典的CheB和CheR适应系统, 却含有3个CheV (Pittman et al, 2001); C. jejuni除了具有E. coli的趋化组分, 还多出一个CheV和另一种磷酸酶CheX (图1b)(Zautner et al, 2012)。虽然不同细菌的CheV数量存在差异, 但CheV是一种保守的双结构域融合蛋白, N端是CheW结构域, C端是REC结构域。
图1 大肠杆菌(Escherichia coli, a)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, b)的趋化系统示意图

图中字母表示不同的趋化蛋白; FliM表示鞭毛马达蛋白; Pi表示磷酸基团

Fig. 1 Schematic diagram of chemotaxis system

The letters represent different chemotaxis proteins; FliM is flagellum motor protein; Pi stands for phosphate group

趋化基因在基因组上趋向于成簇出现, 基因簇内部具有规律的基因排布顺序, 根据基因分布规律将趋化组分划分为不同的类别, 即F系统, 包括F1~ F17 (Wuichet et al, 2010)。例如, F3类型趋化系统的基因顺序为cheV-cheA-cheW, 该系统的CheA因有一个额外的REC结构域而被称为CheAY, 该类型趋化系统目前仅在Epsilon-变形菌中发现。不同细菌存在不同数量的CheV, 生物信息学研究表明在肠道菌株中CheV的数量跟趋化受体蛋白的数量存在正相关性(Ortega et al, 2016)。C. jejuni有且仅有一个F3类型的CheV (后面用F3-CheV表示F3类型的CheV); H. pylori有3个拷贝的F3-CheV, 有2个F3- CheV不是在cheV-cheA-cheW基因组结构中。已有研究也表明H. pylori的3个CheV功能具有差异性, CheV1突变对趋化有很大的影响, 而CheV2和CheV3突变对趋化仅是轻微的影响(Pittman et al, 2001; Alexander et al, 2010)。此外, 不同F类型CheV的功能存在差异。Salmonella typhimurium的F7类型CheV缺失对趋化的表型影响很小(Alexander et al, 2010)。B. subtilis的F1类型CheV具有跟CheW类似的偶联功能(Rosario et al, 1994), 其CheV被磷酸化后能抑制CheA的激酶活性(Karatan et al, 2001)。因此CheV是一个分布广泛且发挥重要功能的趋化蛋白, 但是其具体的作用机制还不清楚, 比如CheV跟趋化受体蛋白是否有选择性互作从而参与特定趋化受体复合体的形成?是否所有的CheV都能被CheA磷酸化且磷酸化后的CheV又有什么样的功能变化?本文将探讨F3-CheV跟趋化受体蛋白是否有选择性互作。
典型的趋化受体蛋白由多种结构域组成, 包括化学感受器LBD (Ligand Binding domain)、HAMP (Histidine kinases, Adenylyl Cyclases, Methyl- accepting chemotaxis proteins, Phosphatases)和MA (Methyl-Accepting domain)等结构域。而H. pylori的趋化受体TlpD (Transducer-like proteins D)除包含有保守的MA结构域外, C-末端还存在一个能结合Zn离子的CZB结构域(C- terminal Zinc-Binding domain), 研究表明该结构域有助于H. pylori应对氧化压力(Collins et al, 2016)。目前发现很多具有CZB结构域的趋化受体都是胞内蛋白, 且部分趋化受体没有经典的LBD结构域, 因此推测其可能是一个新型的信号感知结构域, 或者CZB结构域可以通过结合解离Zn离子的方式对趋化信号传递进行调节(Collins et al, 2016)。我们通过生物信息学分析发现深海热液口的Epsilon-变形菌均有CZB结构域的存在, 但有些趋化受体蛋白的CZB结构域的重要氨基酸位点H-C-H-H发生突变, 我们将其命名为CZB-like结构域。本文对CZB-like结构域的Zn离子结合能力和功能进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株的基因组信息下载于GeneBank, 空肠弯曲杆菌C. jejuni 81-176、蛋白表达菌株E. coli BL21、细菌双杂交菌株E. coli BTH101以及质粒均源于实验室保藏。深海热液口虽具有丰富的微生物量, 但大部分是厌氧菌且难以培养(王风平 等, 2013)。我们选取为数不多已经完全测序的深海Epsilon-变形菌菌株进行分析, 并通过文献调研分析这些物种的呼吸类型和是否是纯化培养。菌株信息见表1, 质粒信息见表2, C. jejuni 81-176相关基因见表3。
表1 菌株信息

Tab. 1 Strain information

物种名称 菌株 生物样品序列号 生物项目序列号 基因组编号 纯培养 呼吸类型 参考文献
Caminibacter mediatlanticus TB-2 SAMN10884411 PRJNA521379 GCA_006459125.1 是 厌氧 Giovannelli 等(2011)
Cetia pacifica TB6 SAMN03737945 PRJNA284962 GCA_003346815.1 是 厌氧 Grosche等(2015)
Hydrogenimonas sp. MAG SAMN00210774 PRJNA543187 GCA_005886055.1 否 兼性厌氧 Takai等(2004)
Lebetimonas sp.# JS138 SAMN03737948 PRJNA66817 GCA_003660105.1 否 厌氧 Meyer等(2014)
Nautilia profundicola AmH SAMN03737951 PRJNA284966 GCA_003544915.1 是 厌氧 Smith等(2008)
Nautilia sp. PV-1 SAMN03737952 PRJNA284967 GCA_003346755.1 是 厌氧 Smith等(2008)
Nitratiruptor sp. SB155-2 SAMN03737954 PRJNA66821 GCA_003544935.1 是 兼性厌氧 Nakagawa等(2005)
Sulfurimonas autotrophica DSM 16294 SAMN03737955 PRJNA66823 GCA_003346775.1 是 好氧 Inagaki等(2003)
Campylobacter jejuni* 81-176 SAMEA4030738 PRJEB6403 GCA_900637395.1 是 微好氧 Snelling等(2005)

注: #表示没有完全测序; *表示试验用模式菌株

表2 质粒相关信息

Tab. 2 Plasmid information

质粒名称 质粒描述
pGEX-6P 用于构建GST融合蛋白表达载体
pKNT25 细菌双杂交T25融合蛋白表达载体
pUT18C 细菌双杂交T18(在N端)融合蛋白表达载体
pCH363 细菌双杂交T18(在C端)融合蛋白表达载体
表3 Campylobacter jejuni 81-176相关基因信息

Tab. 3 Campylobacter jejuni 81-176 related genetic information

基因 基因编号 蛋白结构域示意图
cheV CJJ81176_0311
cheW CJJ81176_0309
tlp1 CJJ81176_1498
tlp2 CJJ81176_0180
tlp3# CJJ81176_1548
tlp3# CJJ81176_1549
tlp4 CJJ81176_0289
tlp5* CJJ81176_0271-4 Pseudogene
tlp6 CJJ81176_0473
tlp7 CJJ81176_0975
tlp8 CJJ81176_1128
tlp9 CJJ81176_1205
tlp10 CJJ81176_0046
aer1 CJJ81176_1204
aer2 CJJ81176_1206

注: #表示Tlp3出现了点突变, 但还具有完整的MA结构域; *表示Tlp5出现了3次点突变, 为假基因

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析方法
以C. jejuni 81-176的CheV和Tlp1的MA结构域的氨基酸序列为模板进行BlastP同源蛋白分析 (Altschul et al, 1997; Schäffer et al, 2001); 用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred)生物信息数据库预测蛋白的二级结构(Letunic et al, 2018; Zimmermann et al, 2018); 用MIST网站(https://mistdb.com/genomes)分析趋化组分的F类型(Gumerov et al, 2020); 用ClustalX 2.1进行多序列比对并生成序列对齐图案(Crooks et al, 2004; Larkin et al, 2007); 用UBCG程序包获取Epsilon-变形菌保守蛋白的比对串联序列(Na et al, 2018)。所有分析均采用默认参数。
CheV进化距离的分析。将Epsilon-变形菌菌株的所有F3-CheV和Sulfurimonas autotrophica的F8-CheV进行多序列比对; 用Epsilon-变形菌的保守蛋白串联序列代表菌株物种进化; 用MEGA7.0的泊松分布模型分别计算CheV间和物种间的进化距离(Kumar et al, 2016)。
CZB结构域的分析。因为CZB结构域结构已解析, 存在于DgcZ蛋白中[蛋白质结构数据库(PDB)编号: 3T9O], 因此通过BlastP、SMART和HHpred数据库分析趋化受体蛋白是否存在类似DgcZ-CZB的结构域。根据CZB结构域的保守氨基酸位点[H] x..x [C] xxx [G] x [W] x..x [H] xxx [H] (H-C-H-H是结合Zn离子的重要氨基酸)用多序列比对方法加以鉴定(Zahringer et al, 2013)。
1.2.2 生化试验方法
质粒构建: 采用天根公司的试剂盒提取质粒和C. jejuni 81-176的基因组, 并设计引物(表4)进行PCR扩增目的片段, 然后进行Gibson连接(Gibson et al, 2009)。
表4 引物序列

Tab.4 Primer sequence

引物名称 序列(5’→ 3’)
pKNT25+cheV_F CTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGTTTGATGAAAATATCGT
pKNT25+cheV_R GTCATTGAATTCGAGCTCGGTTACCCCTGTTCTTGAGATT
pKNT25+cheW_F CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGAGTAATGAAAAATTAGAGCAAATTTTGC
pKNT25+cheW_R CTGCATGGTCATTGAATTCGAGCTCGGAAATTCGCGCTTAAGTAAAGCTTCTACTTTG
pUT18C+tlp1_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATGAAATTAAAAAGATGCTTTTGGCTT
pUT18C+tlp1_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTAAAATCTTTTTTTACTCACATCTTCAAG
pUT18C+tlp4_F ACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGATCTCTCCCCACTTGCAGCTATCCAAACAGGT
pUT18C+tlp4_R TAGTTATATCGATGAATTGCTCGAGTTAAAACCTTTTCTTCTTAACATCTTCTAA
pUT18C+tlp6_F ACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGATATGTTTGGAAGTAAAATAAACCATTCTGAT
pUT18C+tlp6_R TAGTTATATCGATGAATTGCTCGAGTTAATGATCTGACTCATCAAGCATTTCTTT
pUT18C+tlp7_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATCAATTTATCGAAAAAACTCATAAGGCAGTT
pUT18C+tlp7_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTAAATTTGAAATTGGTTAAGTTCGCTTTC
pUT18C+tlp8_F ACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGATATGTTTGGTGCTAAGAAAAATAATACTGAA
pUT18C+tlp8_R TAGTTATATCGATGAATTGCTCGAGTTATGACATCGCTTTAGCAACTTCAGCAGAGCT
pUT18C+tlp9_F ACGCCACTGCAGGTCGACTCTAGATTTAGCAAACATAGAAGTGACAGCAAGATCT
pUT18C+tlp9_R TAGTTATATCGATGAATTGCTCGAGTTATATTTTTAATTTTGCTAAGATTTCAGC
pUT18C+tlp10_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATTCAAGTCATCAAAATTCACAAAAACTCAA
pUT18C+tlp10_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTACTGAAAGCTACTTAATTTTTCGGAGAG
pUT18C+aer1_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATAAAGAAATAGTTTTGTCTGAAAATGCTTTA
pUT18C+aer1_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTAATTATTTTCTTGTAAGTTAAAAATAAGTTCAT
pUT18C+aer2_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATTCAAGAGAAATTTTTTTACAAGAAGATAGT
pUT18C+aer2_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTATTTAGCTTCTTGAAGAGAAAAGATTAGC
pUT18C+tlp9 (no CZB-like)_F ACTGCAGGTCGACTCTAGATTTAGCAAACATAGAAGTGACAGCAAGATCT
pUT18C+tlp9 (no CZB-like)_R ATATCGATGAATTGCTCGAGTTAATAAAGAATATGATCGATTTTAACCAC
pCH363+tlp9_F ACAGCTATGACCATGATTACGCCATTAGCAAACATAGAAGTGACAGCAAGATCT
pCH363+tlp9_R TGGCCTCGCTGGCGGCTGAATTCGATATTTTTAATTTTGCTAAGATTTCAGCACT
pGEX-6P+tlp6_F TCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCTTGCTTAGACAACACAAAGATGAGC
pGEX-6P+tlp6_R GCTCGAGTCGACCCGGGAATTCCGGTTATATTTTTAATTTTGCTAAGATTTCAGCAC
pGEX-6P+tlp9_F TCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGTTTGGAAGTAAAATAAACCATTCTGATCTTC
pGEX-6P+tlp9_R GCTCGAGTCGACCCGGGAATTCCGGTTAATGATCTGACTCATCAAGCATTTC
pGEX-6P+tlp9 (no CZB-like)_F TCTGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGTTTGGAAGTAAAATAAACCATTCTGATCTTC
pGEX-6P+tlp9 (no CZB-like)_R GCTCGAGTCGACCCGGGAATTCCGGTTAATCGATTTTAACCACAGACAAAATCAATC
细菌双杂交方法: 克隆跨膜趋化受体(Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10)的胞内MA结构域及其C末端的核酸序列和胞质趋化受体(Tlp6、Tlp8和Aer1、Aer2)的全长核酸序列至pUT18C或者pCH363质粒中, 克隆cheA或cheW至pKNT25质粒中, 然后共转化至双杂交细菌E. coli BTH101中(图2a、2b)。因Tlp2、Tlp3、Tlp4的MA结构域的氨基酸序列100%相似, 因此只用了Tlp4进行试验; 因为tlp5基因发生了点突变不能正常翻译, 因此没有用Tlp5进行试验。将构建好的质粒转化至E. coli BTH101中, 在含有氨苄青霉素(100μg·mL-1)+卡那霉素(50μg·mL-1)+IPTG (0.5mmol·L-1)+X-gal (40μg·mL-1)的固体LB培养基中30℃培养观察48h, 若菌斑变蓝则证明有相互作用, 如果菌落显白色则表明无相互作用, 通过菌斑的蓝色深浅粗略判断蛋白互作的强弱(Battesti et al, 2012)。
图2 细菌双杂交研究Campylobacter jejuni 81-176的CheV与趋化受体蛋白的相互作用

a. 细菌双杂交操作示意图; b. 基因克隆示意图, 左图表示跨膜的Tlp只截取胞内的MA 结构域及MA 结构域后的序列进克隆, 右图表示胞内趋化受体选取蛋白的全长序列进行克隆; c. CheV与趋化受体蛋白的细菌双杂交结果; d. CheW与趋化受体蛋白的细菌双杂交结果。图c和图d中颜色深浅代表蛋白相互作用的强弱程度。BTH101为细菌双杂交系统菌株

Fig. 2 Using bacterial two-hybrid system to study the interaction between CheV and chemotactic receptors in Campylobacter jejuni 81-176

(a) Schematic diagram of bacterial two-hybrid experiment; (b) Schematic diagram of gene cloning. The left panel shows that for transmembrane Tlps, only MA domains and sequences after the MA domain were cloned into vectors. The right panel shows the full-length sequence of the cytolasmic chemotactic receptor was selected for cloning; (c) Interaction of CheV with Tlps by bacterial two-hybrid experiments; (d) Interaction of CheW with Tlps by bacterial two-hybrid experiments. The shade of color in Figure C and D represents the strength of protein interaction. BTH101 is a strain for bacterial double hybrid system

蛋白表达纯化及Zn离子的测定: 分别构建Tlp6全长蛋白、Tlp9胞内全长蛋白及其不含CZB- like结构域的胞内蛋白表达载体, 转化至E. coli BL21中。蛋白纯化过程中, 先用含60mmol·L-1咪唑的蛋白缓冲液进行洗杂, 最后用不含NaCl的300mmol·L-1咪唑蛋白缓冲液洗脱目的蛋白。加入浓硝酸消解蛋白溶液, 后用双氧水(ddH2O)稀释浓硝酸至1%以下, 使用电感耦合等离子体质谱(ICP- Mass)测定Zn离子含量。

2 结果与分析

2.1 深海Epsilon-变形菌的F趋化类型及CheV蛋白的分析

我们使用MIST数据库调查深海Epsilon-变形菌的F趋化系统类型, 发现在所分析的Epsilon-变形菌菌株中, 除Nitratiruptor sp. SB155-2外, 都具有F3类型趋化系统, 而且大部分深海Epsilon-变形菌与C. jejuni类似, 都是有且仅有一个F3类型趋化系统(表5)。
表5 深海Epsilon-变形菌的F类型和CheV的分析统计

Tab. 5 Analysis and statistics of F-Class and CheV in deep sea Epsilon-proteobacteria

菌株 F类型 CheV蛋白编号 菌株 F类型 CheV蛋白编号
Campylobacter jejuni* 1 (F3) WP_002857365.1 Nautilia profundicola 1 (F3) WP_041361491.1
Caminibacter mediatlanticus 1 (F3) WP_007474092.1 Nautilia sp. PV-1 1 (F3) WP_127679461.1
Cetia pacifica 1 (F3) WP_123351600.1 Nitratiruptor sp. SB155-2 1 (F14) WP_012081979.1
Hydrogenimonas sp. MAG 1 (F3) BBG65199.1 Sulfurimonas autotrophica 2 (F3/F8) WP_013326429.1
WP_013327173.1#
Lebetimonas sp. JS138 1 (F3) WP_024787070.1

注: *表示非深海菌株; #表示F8类型

已知不同细菌的CheV的数量和功能存在差异。C．jejuni和大部分深海Epsilon-变形菌只有一个CheV且都属于F3类型(表5), 因此C．jejuni的F3-CheV很有可能是由深海Epsilon-变形菌的F3-CheV垂直遗传的, 而非基因水平转移的结果。为了验证这个猜想, 我们将深海Epsilon-变形菌和C．jejuni的F3-CheV以及作为对照的Sulfurimonas autotrophica的F8-CheV (表5, 8个F3-CheV, 1个F8-CheV)进行两两比较, 计算不同菌株的CheV之间的进化距离; 用UBCG程序包产生各Epsilon-变形菌的保守蛋白串联序列并以此计算物种间的进化距离。图3显示这些菌株两两之间的F3-CheV进化距离跟物种进化距离一致(斜率接近1), 而Sulfurimonas autotrophica的F8-CheV与其他Epsilon-变形菌的F3-CheV间的距离远远大于Sulfurimonas autotrophica与这些Epsilon-变形菌间的物种距离, 但是同是源自Sulfurimonas autotrophica的F3-CheV却与物种有相近的进化距离。这表明F3-CheV可以稳定地在这些菌株中进行基因垂直传递, 而非F3类型的CheV如F8-CheV应该来自水平基因转移(图3)。因此深海Epsilon-变形菌与C. jejuni的F3-CheV功能应该是同样的。
图3 深海Epsilon-变形菌和Campylobacter jejuni的CheV分子间进化距离分析

蓝色表示深海Epsilon-变形菌的两两比较; 橙色表示深海Epsilon-变形菌与C. jejuni 81-176的两两比较; 圆圈表示不同菌株的F3-CheV间的距离; 三角形表示Sulfurimonas autotrophica的F8-CheV与其他Epsilon-变形菌菌株的F3-CheV之间的距离

Fig. 3 Pairwise Distances matrix to calculate the evolutionary distance for CheV homologs between deep-sea Epsilon-proteobacteria and Campylobacter jejuni

Blue indicates the evolutionary distance between deep-sea Epsilon- proteobacteria. Orange indicates the evolutionary distance between deep-sea Epsilon-proteobacteria and C. jejuni 81-176. Dot shows the distance between F3-CheV in different Epsilon-proteobacteria, and triangle shows the distance between F8-CheV in sulfurimonas autotrophica and F3-CheV in other Epsilon-proteobacteria

2.2 CheV与趋化受体蛋白的相互作用

由于深海Epsilon-变形菌难以纯化培养和进行遗传操作试验(臧扬 等, 2017), 从前面CheV的进化距离分析推测垂直传递的F3-CheV功能上应该具有相似性, 因此我们选用Epsilon-变形菌的模式菌株C. jejuni 81-176进行CheV与趋化受体蛋白的互作研究, 进而推测深海Epsilon-变形菌F3-CheV的功能。C. jejuni 81-176具有MA结构域的完整趋化受体Tlp和没有MA结构域但有PAS结构域的趋化受体Aer (An energy taxis receptor)。我们采用细菌双杂交方法检测CheV或CheW是否与趋化受体蛋白之间发生互作, 将cheV和cheW基因克隆至载体pKNT25中, 将tlp或aer基因克隆至pUT18C中。已有研究发现趋化受体内只有MA结构域参与CheV和CheW的互作, 所以对于跨膜趋化受体, 我们只克隆了编码胞内含MA结构域的C末端核酸序列; 对于胞内趋化受体, 则克隆编码全长蛋白的核酸序列(图2a、2b)。
从结果可知CheV与Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10有强烈的互作, 而与Tlp6和Tlp8的互作性较弱, 与Aer1和Aer2没有互作(图2c)。Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp 10都是跨膜蛋白, CheV与这类蛋白互作很强, 而跟胞内Tlp6、Tlp8的互作较弱; Aer1和Aer2由于没有MA结构域, 无法跟CheV互作。CheW似乎跟所有的Tlp都有很弱的相互作用, 但是出乎意料的是Aer1和Aer2也与CheW显示有微弱的互作(图2d)。我们猜测由于CheW蛋白高度保守, 异源表达的CheW可能会参与E. coli BTH101自身的趋化受体复合体组装, 从而导致CheW的细菌双杂交试验结果产生异常。此外, Aer1和Aer2的PAS结构域可能结合到E. coli BTH101自身趋化受体的HAMP结构域上间接与CheW-T25互作, 从而使CheW与Aer1和Aer2产生假阳性结果。

2.3 CZB-like结构域的Zn结合能力及在蛋白互作中的作用

H. pylori的TlpD的CZB结构域可以帮助其适应氧化压力。因此我们想了解深海Epsilon-变形菌的趋化受体蛋白是否也含有CZB结构域来帮助其适应深海的极端环境。首先用BlastP分析以及SMART和HHpred数据库分析获得含CZB结构域的趋化受体蛋白, 进一步通过序列比对分析发现Caminibacter mediatlanticus和Cetia pacifica两株深海菌株以及C. jejuni 81-176存在含类似DgcZ-CZB结构域的趋化受体蛋白, 但是缺乏保守位点[H] x..x [C] xxx [G] x [W] x..x [H] xxx [H], 因此我们称这种结构域为CZB-like结构域; 而其他具有保守氨基酸位点的结构域则确认为CZB结构域(图4, 表6)。为了进一步确定CZB结构域的分布, 我们通过BlastP分析发现Epsilon-变形菌的很多菌株都存在含CZB结构域的趋化受体蛋白, 但是比例没有深海热液口的Epsilon-变形菌高, 比如C. jejuni和H. pylori都只有一个含CZB结构域的趋化受体蛋白。这说明CZB结构域可能在Epsilon-变形菌适应深海极端环境的过程中发挥重要功能。此外, 我们发现普通水生境的Arcobacter marinus和Arcobacter anaerophilus以及致病菌Campylobacter hepaticus也存在含CZB-like结构域的趋化受体蛋白。
图4 CZB结构域和CZB-like结构域的序列比对分析

通过多序列比对寻找保守氨基酸并以此区分CZB结构域和CZB-like结构域。蓝色字体代表的是深海菌株, 标红的字母代表CZB结构域的保守氨基酸位点

Fig. 4 Sequence alignment of CZB domain and CZB-like domain

Blue font indicates deep-sea strain, Red letter indicates conserved amino acids of CZB domain

表6 深海Epsilon-变形菌CZB结构域的分析统计

Tab. 6 Analysis and statistics of CZB domain in deep sea Epsilon-proteobacteria

菌株 CZB个数 含CZB的蛋白编号 CZB-like个数 含CZB-like的蛋白编号
Campylobacter jejuni* 1 WP_002857440.1 1 WP_002790076.1
Caminibacter mediatlanticus 2 WP_138323537.1, WP_138323100.1 1 WP_138323156.1
Cetia pacifica 2 WP_123352714.1, WP_123352123.1 1 WP_123351565.1
Hydrogenimonas sp. MAG 5 BBG65387.1, BBG65955.1, BBG65459.1,
BBG65926.1, BBG65424.1		 0 0
Lebetimonas sp. JS138 1 WP_024791915.1 0 0
Nautilia profundicola 2 WP_012663710.1, WP_015902667.1 0 0
Nautilia sp. PV-1 2 WP_127679641.1, WP_127679872.1 0 0
Nitratiruptor sp. SB155-2 2 WP_012081746.1, WP_012081977.1 0 0
Sulfurimonas autotrophica 3 WP_013327874.1, WP_041675273.1,
WP_013327332.1		 0 0

注: *表示非深海菌株

CZB-like结构域中对应的H-C-H-H发生突变后, 是否还能结合Zn离子, 是否在趋化过程中发挥其他功能?我们通过序列分析发现, C. jejuni 81-176的Tlp6的C-末端是一个经典的CZB结构域, 而Tlp9的C-末端是一个CZB-like结构域(表3)。为检测CZB-like结构域的功能, 我们将Tlp6、Tlp9和敲除CZB-like结构域的Tlp9 (no CZB-like)克隆至pGEX-6P质粒上并转化进 E. coli BL21表达系统中进行异源表达。通过蛋白纯化、消解及ICP-Mass分析, 我们发现Tlp6检测到的Zn离子质量分数在1.00×10-7左右, 而Tlp9检测到的Zn离子质量分数在0.25×10-7以下(图5a)。但将Zn离子质量分数和蛋白质量分数进行计算结合比, 发现Tlp6蛋白与Zn的结合比值约为1.5, 证实了一个CZB结构域大约能结合一个Zn离子, 说明Tlp6蛋白具有一个真正的CZB结构域(图5b)。然而Tlp9的CZB-like结构域并没有结合Zn离子, 这说明CZB-like结构域虽然在二级结构上类似于DgcZ-CZB结构域, 但由于关键氨基酸突变, 已经不能结合Zn离子(图5b)。
图5 CZB-like结构域的Zn结合能力及潜在功能的研究

a. ICP-Mass检测CZB-like结构域的Zn离子结合能力; b. 根据3次质谱测定的平均离子浓度和平均蛋白浓度计算蛋白和Zn离子的结合比例; c和d. 细菌双杂交研究Tlp9的CZB-like结构域能否影响Tlp9与CheV和CheW的相互作用。图c和图d中不同颜色分别代表蛋白相互作用的强弱程度

Fig. 5 Study on Zn-binding capacity and potential function of CZB-like domain

(a) Zn concentration measure by ICP-mass; (b) Using the average Zn concentration and average protein concentration, the binding ratio of protein and Zn is calculated; (c and d) To investigate whether the CZB-like domain of Tlp9 can affect the interaction with CheV or CheW by bacterial two-hybrid experiments. The shade of color in Figure C and D represents the strength of protein interaction

趋化受体蛋白跟CheW或CheA的互作界面主要是在趋化受体蛋白的MA结构域, 而CZB-like结构域就在MA结构域的后边, 这种蛋白结构有可能介导蛋白互作。为进一步探究CZB-like结构域的功能, 我们构建了CheV或CheW跟Tlp9及其蛋白截短体的细菌双杂交系统菌株, 研究CZB-like结构域对Tlp9和CheV或CheW的互作影响。试验结果表明, 由于Tlp9的CZB-like结构域存在, Tlp9跟CheV的互作能力明显很强, 而将Tlp9的CZB-like结构域截掉, Tlp9则丧失与CheV互作的功能(图5c)。而且, T18标签如果加在Tlp9的C端(即Tlp9的CZB-like结构域的C端), 会严重影响Tlp9与CheV的互作(图5c)。CheW与Tlp9及其截除CZB-like结构域的蛋白杂交结果并没有显示出差别(图5d), 从图2d可以看出CheW在E. coli BTH101系统中存在问题, 从而影响CheW与Tlp9的互作结果, 因此无法下结论。但是从Tlp9与CheV的互作结果中可知CZB-like结构域能影响Tlp9与CheV的互作。

3 讨论与结论

我们研究发现大部分深海Epsilon-变形菌的CheV属于F3类型, 但CheV的数量在深海Epsilon-变形菌中是变化的, 大部分只有一个CheV, 少数菌株具有多个CheV, 如Sulfurimonas autotrophica各有一个F3-CheV和一个F8-CheV。计算深海Epsilon-变形菌和C. jejuni两两之间的物种进化距离和CheV分子进化距离发现F3-CheV与物种间的进化距离相近。据此可以推测深海Epsilon-变形菌与C. jejuni 的F3-CheV具有垂直传递关系和功能的相似性。
细菌双杂交的结果表明CheV可以和所有的Tlp互作, 但存在亲和力的差别。CheV和跨膜的Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10互作亲和力更大, 和胞内Tlp6、Tlp8亲和力较弱。虽然结果显示CheW与所有的Tlp都有弱相互作用, 但由于异源表达的CheW可能会参与E. coli BTH101的趋化系统复合体组装, 从而导致CheW与Tlp的互作结果不可信。有研究表明PAS结构域可以和HAMP结构域互作(Elliott et al, 2009), 而Aer1和Aer2都有PAS结构域, 因此可能是Aer1和Aer2结合到E. coli BTH101自身趋化受体的HAMP结构域上, 且CheW-T25参与E. coli BTH101趋化受体复合体的组装, 因此导致Aer1或Aer2与CheW产生间接性互作, 从而使CheW与Aer1、Aer2产生假阳性结果。此外, 细菌双杂交系统的基因是超表达状态, 而超表达的蛋白容易产生非特异性互作, 这可能是导致CheW与Aer1、Aer2产生假阳性的另一种原因。所以该蛋白互作系统不适用于研究CheW蛋白的互作, 从而无法对CheW与趋化受体蛋白的互作下结论。
E. coli的趋化受体复合体结构已经得到了解析, 是一个趋化阵列结构, 整个趋化阵列展现出一个非常完美的六元环结构, 两个三聚体形式的趋化受体蛋白与一个二聚体的CheA和两个CheW组成一个核心单元, 3个核心单元又组装成一个晶格单元, 晶格单元彼此相连形成一个很大的趋化阵列(Liu et al, 2012; Cassidy et al, 2015)。由于E. coli没有CheV, 目前还没有任何CheV蛋白的结构解析。CheV如何参与六元环的组装, CheV的REC结构域在趋化阵列中处于什么位置, REC结构域能否被磷酸化以及被磷酸化后在趋化阵列的信号传递过程中发挥什么样的功能, 这些都是相当有意义但又极具挑战的问题。随着冷冻电镜的发展, 可以通过体外重构趋化阵列, 然后用电镜直接观察CheV是否参与阵列组装, 以及如何影响趋化阵列的信号传递。而很多的Epsilon-变形菌具有单拷贝的CheV和CheW, 是研究CheV参与趋化阵列组装的理想对象。
此外, 我们发现所有的深海Epsilon-变形菌中都存在含CZB结构域的趋化受体蛋白, 且数量要比致病菌C. jejuni和H. pylori多, 这可能跟深海Epsilon-变形菌适应极端环境相关。我们还发现了一种新的结构域CZB-like结构域。通过ICP-Mass, 确定了Tlp6的CZB结构域能结合Zn离子, 是一个真正的CZB结构域; 而Tlp9的CZB-like结构域不能结合Zn离子, 说明H-C-H-H关键氨基酸的突变, 使CZB结构域结合Zn离子的能力丧失, 但是细菌双杂交试验结果表明C. jejuni 81-176的CZB-like结构域可以极大促进Tlp9与CheV的互作。关于CZB结构域和CZB-like结构域如何影响趋化受体的构象进而影响其与其他趋化蛋白的相互作用有待进一步研究。

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