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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 3: 158 - 168

DOI: https://doi.org/10.11978/2022142

海洋生物学

广西北部湾可培养黏细菌资源初探及其抗菌活性研究

  • 卢天梅 , 1 ,
  • 官佳松 1, 2 ,
  • 覃诗敬 1 ,
  • 刘永宏 1, 3 ,
  • 苏志维 , 1
展开
  • 1.广西中医药大学海洋药物研究院, 广西 南宁 530200
  • 2.广西大学农学院, 广西 南宁 530004
  • 3.热带海洋生物资源与生态重点实验室(中国科学院南海海洋研究所), 广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301
苏志维。email:

卢天梅(1994—), 女, 广西壮族自治区桂平市人, 硕士研究生, 从事海洋药用微生物资源挖掘与利用研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2022-06-23

  修回日期: 2022-08-24

  网络出版日期: 2022-09-01

基金资助

广西中医药大学海洋药物研究院团队科研专项经费(2018ZD005-A08)

国家自然科学基金(32060098)

广西八桂学者专项经费(05019055)

广西中医药大学研究生教育创新计划项目(YCSZ2022024)

大学生创新项目(S202110600122)

广西科技计划项目(桂科AB19259010)

收起

Preliminary study on the culturable myxobacteria resources from the Beibu Gulf, Guangxi and their antibacterial activity

  • LU Tianmei , 1 ,
  • GUAN jiasong 1, 2 ,
  • QIN Shijing 1 ,
  • LIU Yonghong 1, 3 ,
  • SU Zhiwei , 1
Expand
  • 1. Institute of Marine Drugs, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China
  • 2. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China
  • 3. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology (South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences), Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, Guangzhou 510301, China
SU Zhiwei. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2022-06-23

  Revised date: 2022-08-24

  Online published: 2022-09-01

Supported by

Scientific Research Foundation of Institute of Marine Drugs, GUCM(2018ZD005-A08)

National Natural Science Foundation of China(32060098)

Special Fund for Bagui Scholars to Yonghong Liu(05019055)

Innovation Project of Guangxi Graduate Education of GXUCM(YCSZ2022024)

University Student Innovation Project(S202110600122)

Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region(AB19259010)

Fold

摘要

采用大肠杆菌诱导法和滤纸诱导法对广西北部湾不同海洋生境采集的样品进行黏细菌的分离纯化, 基于菌落形态特征结合16S rRNA基因序列分析对黏细菌纯培养物进行初步鉴定。从21份海洋生境样品中共分离纯化得到38株黏细菌, 隶属于4属10种, 其中黏球菌属和珊瑚球菌属分别占菌株总数的63.16%和26.32%, 属于优势菌属。采用VY/2培养基进行固体培养发酵, 利用丙酮提取浓缩获得提取物, 进一步利用滤纸片琼脂扩散法对菌株粗提物进行抗菌活性初步筛选。结果发现24株黏细菌提取物对9种指示菌具有不同程度的抑制作用, 抗菌阳性率达63.16%, 其中Myxococcus macrosporus (1H01)的提取物对肺炎克雷伯菌的抑制活性显著, 优于阳性药(氨苄青霉素钠, 1mg·mL-1)。研究结果表明广西北部湾特殊海洋生境黏细菌多样性丰富, 分离出的黏细菌具有良好的抗菌活性, 为新型抗生素应用研究奠定了物质基础。

关键词： 北部湾; 黏细菌; 分离鉴定; 抗菌活性

本文引用格式

卢天梅 , 官佳松 , 覃诗敬 , 刘永宏 , 苏志维 . 广西北部湾可培养黏细菌资源初探及其抗菌活性研究[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(3) : 158 -168 . DOI: 10.11978/2022142

Abstract

The objective of this study is to isolate myxobacteria from different types of marine biotopes in the Guangxi Beibu Gulf, on the base of living-Escherichia coli and filter paper methods. 38 strains were isolated from 21 samples, and were preliminary identified based on colony morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis. The purified strains belong to 4 genera and 10 species, in which Myxococcus and Corallococcus were dominant genera, accounting for 63.16% and 26.32% of the total strains, respectively. Then the purified strains were subjected to the small-scale fermentations through the VY/2 medium, and the extracts were obtained by the extraction and concentration of acetone. The crude extracts were further screened for antimicrobial activity by filter paper agar diffusion. The results showed that the metabolites of 24 myxobacterial strains had different degrees of inhibition on 9 indicator bacteria, and the positive rate was 63.16%. Among them, the metabolites of Myxococcus macrosporus (1H01) showed significant inhibitory activity against Klebsiella pneumoniae, which was superior to the positive drugs (ampicillin sodium, 1 mg·mL-1). The results explain that the diversity of myxobateria is rich in different types marine sediment from the Guangxi Beibu Gulf, and the isolated myxobacteria has a prominent antibacterial activity, laying a foundation for the application of new antibiotics.

Key words： Beibu Gulf; myxobacteria; isolation and identification; antibacterial activity

近年来, 抗生素的广泛使用乃至滥用, 导致病原菌的耐药性不断增强, 尤其是多重耐药菌株的不断涌现, 已对人类健康构成重大威胁(沙国萌 等, 2020)。最新研究表明质粒携带的耐药基因NMD、mcr-1能显著消抗碳青霉烯类药物及粘菌素的效力, 这标志着人类治疗多重耐药细菌感染的最后一道防线已被攻破(Liu et al, 2016)。英国权威报告《全球抗菌素耐药回顾》预测, 到2050年, 因抗生素耐药性导致的死亡人数将达1000万人/年, 死亡率远超癌症, 将成为全球人类死亡的主要原因之一(Gradisteanu-Pircalabioru et al, 2021)。国内近年因滥用抗生素导致多重耐药菌感染而引起的临床死亡病例也日益增多(Jinks et al, 2016), 因此, 挖掘高效抑制耐药菌的抗生素刻不容缓。
微生物源天然产物是新型抗生素最重要的来源之一, 目前70%的临床抗生素来源于微生物天然产物及其衍生物(鞠建华 等, 2021)。黏细菌(Myxobacteria)属于多变细菌的δ分支(Mulwa et al, 2018), 土壤、树皮、腐木、树叶、食草动物的粪便等各种自然资源中均有报道(王雪寒, 2019), 是一类具有复杂多细胞行为的高等原核生物, 能通过独特的狼群式群体行为(wolf-pack)和滑行运动渗透到猎物群体细胞之间(Konovalova et al, 2010; 王婷, 2018; Pérez et al,2020), 分泌高浓度的水解酶和丰富的代谢物质来猎杀捕食目标微生物van Geelen et al, 2018; Vasse et al, 2018)。目前, 研究者已从黏细菌中发现100多种母核结构及600多种新的结构衍生物, 具有显著的抗菌、抗病毒、抗癌等多种生物活性(Mohr, 2018; 王春玲 等, 2019), 是继放线菌之后又一个重要的药源微生物新类群, 在挖掘新型抗生素方面具有巨大的应用前景。
近年来, 从海洋环境中分离新菌株已成为开发新型天然产物的有效来源(Jensen et al, 1991; Goodfellow et al, 2010; Jensen, 2010), 虽然目前发现的海洋黏细菌数量有限, 但其代谢产物结构新颖性优于陆生黏细菌, 是未来挖掘新型抗生素的重要资源(Albataineh et al, 2018; Gemperlein et al, 2018)。广西北部湾海域地处热带、亚热带, 蕴涵着丰富的海洋微生物资源(蒋莲秀 等, 2017)。目前有关广西北部湾海域海洋微生物资源及生物活性潜力的研究多聚焦在放线菌方面(王聪 等, 2019; 李艳群 等, 2021; 马丽丽 等, 2021; 杨少娟 等, 2021), 而关于黏细菌资源挖掘和开发利用的研究却鲜见报道。因此, 本文以广西北部湾红树林、海草床、海岛、盐田等海洋生境中采集的样品为研究对象, 采用大肠杆菌诱导和滤纸诱导两种方法从中分离纯化黏细菌, 同时对分离到的黏细菌进行小规模发酵获得发酵产物并进行抗菌活性初筛, 挖掘具有高效抑菌活性的黏细菌菌株, 为新型抗生素应用研究奠定物质基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

参考Wang等(2020)的方法, 采集广西防城港、北海等地区的21份北部湾海洋生境样品(表1)。采集沉积物样品时, 去除表层杂质后在5~15cm处进行取样, 采集的红树植物样品分别为剪下的腐化枝条、胚轴、外层树皮, 地衣样品即采自礁石表层。为防止霉菌的污染, 立即自然室温风干, 放入4℃冷库保存备用。
表1 样品信息表

Tab. 1 Details of samples

样品编号 样品名称 采样区域 经纬度
1H 木榄根际沉积物 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
2H 木榄腐木 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
3H 木榄胚轴 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
4H 木榄树皮 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
5H 木榄根际沉积物 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
6H 白骨壤根际沉积物 珍珠湾 108°13′55″E, 21°36′27″N
1D 海蚀坑沉积物 涠洲岛 109°05′52″E, 21°00′04″N
2D 滩岩老鼠簕根际沉积物 涠洲岛 109°05′58″E, 21°00′42″N
3D 礁石地衣 涠洲岛 109°05′56″E, 21°00′39″N
4D 滩岩仙人掌根际沉积物 涠洲岛 109°05′55″E, 21°00′15″N
1Y 盐田淤泥 银海区 109°16′39″E, 21°26′35″N
2Y 盐田淤泥 银海区 109°16′22″E, 21°26′35″N
3Y 盐田淤泥 银海区 109°16′23″E, 21°26′35″N
1C 海草床沉积物 山心村 108°12′06″E, 21°34′14″N
2C 互花米草根际沉积物 山心村 108°11′10″E, 21°35′11″N
3C 互花米草根际沉积物 山心村 108°10′57″E, 21°34′33″N
4C 贝壳喜盐草根际沉积物 山心村 108°11′29″E, 21°34′59″N
5C 贝壳喜盐草根际沉积物 山心村 108°11′21″E, 21°34′53″N
6C 贝壳喜盐草根际沉积物 山心村 108°11′20″E, 21°34′51″N
7C 贝壳喜盐草根际沉积物 山心村 108°11′36″E, 21°34′58″N
8C 贝壳喜盐草根际沉积物 山心村 108°11′24″E, 21°34′51″N

1.1.2 主要培养基

诱导菌培养基为LB培养基。参考Li等(2002)方法, 按30%比例稀释海水后, 分别配制CNST、WCX分离培养基、VY/2培养基、CAS培养基, 每升稀释海水中加入各培养基的配方及含量如下。
LB固体培养基: 21g LB肉汤, 15g琼脂粉, 加蒸馏水定容到1L。
LB液体培养基: 21g LB肉汤, 加蒸馏水定容到1L。
微量元素溶液: MnCl2·4H2O 100mg, CoCl2 20mg, CuSO4 10mg, Na2MoO4·2H2O 10mg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2·2H2O 5mg, H3BO3 10mg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTA ferric sodium salt 8mg, 加无菌双蒸水定容到1L, 过滤除菌。
CNST培养基: KNO3 0.5g, Na2HPO4·12H2O 0.84g, MgSO4·7H2O 1g, FeCl3·7H2O 0.018g, 琼脂粉20g, 20mg·mL-1酵母液1mL, 灭菌后加微量元素1mL。
WCX培养基: CaCl2 1.5g, 琼脂粉15g, KOH调节pH至7.2。
VY/2培养基: MgSO4·7H2O 0.5g, 酵母粉10g, CaCl2·2H2O 0.5g, 琼脂粉15g, KOH调节pH至7.2, 灭菌后加500µL 1mg·mL-1 VB12。
CAS培养基: Casitone 10g, MgSO4·7H2O 1g, KOH调节pH至7.2。

1.1.3 抗菌活性测定菌株

革兰氏阳性菌: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC43300, MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC12228)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC29213)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus GDMCC1.132)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus GDMCC1.381)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GDMCC1.222), 革兰氏阴性菌: 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC13883)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii GDMCC1.609)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa GDMCC1.175)。
其中, 菌株MRSA、S. epidermidis、S. aureus、K. pneumoniae均由华南农业大学张晓勇课题组惠赠, 其余指示菌均购于广东微生物研究所。

1.2 黏细菌的分离、纯化

1.2.1 样品预处理

参考蚁烁星等(2020)方法, 称取样品约30g, 植物等块状固体样品先用无菌水清洗表面多次、剪碎, 后用研磨棒将样品研磨成均匀的细末, 置于无菌培养皿内, 用100µg·mL-1放线菌酮充分混匀、浸没过夜, 次日6000r·min-1离心5min, 弃去上清液。

1.2.2 黏细菌的分离

参考吴姝鸽(2021)的分离方法。大肠杆菌诱导法: 挑取大肠杆菌单菌落到LB液体培养基中, 于37℃过夜培养, 高速离心后取菌体加入液体培养基制成菌悬液; 在超净工作台内, 将菌悬液于WCX培养基中均匀铺上直径2cm的圆形菌垫, 每皿4菌垫, 晾干备用; 将经处理的样品均匀铺于菌垫上, 封口后放置于30℃恒温培养箱培养; 5d后在体视显微镜下观察, 用无菌注射针头挑取子实体顶部或刮取菌膜边缘至VY/2培养基中培养, 反复转接直至纯化, 连续观察一个月, 每个样品做10个重复。
滤纸片诱导法: 在超净工作台内, 于CNST固体培养基铺上2cm2的灭菌滤纸片, 每皿4张; 挖取适量样品均匀铺于滤纸上, 封口后放置于30℃恒温培养箱培养, 5d后开始在体视显微镜下观察是否有滤纸被侵蚀; 用无菌注射针头挑取黏细菌的子实体、菌膜或被腐蚀的纤维丝至VY/2培养基中培养, 反复转接直至纯化, 连续观察一个月, 每个样品做10个重复。

1.2.3 菌株的验纯与保藏

参考Reichenbach等(1992)方法, 取转接纯化后的黏细菌于CAS液体培养基内, 于30℃, 180r·min-1摇床培养36h。若液体澄清表明菌株已纯, 若液体浑浊, 则说明该菌株中还有杂菌, 仍需进一步纯化。将已纯化的黏细菌用25%甘油管于-80℃保存。进一步将获得的黏细菌菌株分别点接到不同海盐浓度的VY/2平板上, 培养5d后观察其子实体及菌落生长情况, 评价菌株的耐盐能力(邱智军 等, 2003)。

1.2.4 菌株鉴定

形态鉴定记录黏细菌子实体的颜色、形态, 营养细胞及粘孢子的形态大小, 菌落形态, 依据《伯杰氏细菌鉴定手册》将其大致分类到属(Reichenbach et al, 1992; Reichenbach, 2005)。
分子鉴定 参考韩敏敏 等(2020)、周秀文 等(2013)的方法提取菌株DNA, 并以细菌通用引物27F与1492R进行16S rRNA基因PCR梯度扩增, 扩增程序为: 94℃预变性5min, 94℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸90s, 30个循环, 72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 凝胶成像仪观察电泳结果, 条带合格后委托生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司进行测序。测序结果利用DNA Star软件处理, 将所得到16S rRNA序列置于数据库EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行同源序列比对, 然后用MEGA-X软件按照Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.3 黏细菌发酵提取物的抗菌活性筛选

1.3.1 黏细菌发酵提取物的制备与色谱分析

将活化好的黏细菌菌株接种于VY/2固体培养基中, 30℃培养, 待菌体长满平板后用竹签刮取到锥形瓶中, 加入丙酮超声提取至提取液无色, 真空回收获得粗提物。将菌株粗提物用甲醇溶解配成20mg·mL-1的溶液, 使用0.22μm滤膜过滤, 然后采用HPLC进行分析。分析条件为: 色谱柱 YMC-Pack ODS-A, 250×4.6mm, 5μm; 洗脱程序: 0~30min, 5%~95%乙腈梯度洗脱, 30~50min, 95%乙腈等度洗脱, 流速: 1mL·min-1, 柱温: 35℃; 检测器: PDA光电二极管阵列检测器, 波长: 190~800nm; 进样量: 20μL。

1.3.2 发酵提取物的抑菌实验

参考宋腾飞(2019)的方法, 采用滤纸片琼脂扩散法进行抑菌实验。将指示菌接入LB液体培养基内, 于37°C、180r·min-1震荡培养至对数生长期, 加入温度适宜的LB固体培养基将指示菌稀释成为每1mL含菌数为106cfu的菌悬液, 摇匀, 倒制平板备用。接着用无菌镊子将含0.15mg粗提物的无菌干燥滤纸片(6mm)贴在含有指示菌的培养基上, 分别以3μL DMSO为空白对照、1mg·mL-1氨苄青霉素钠为阳性对照。设置三组平行实验, 置于37℃培养箱中倒置培养18~24h, 观察并记录抑菌活性。以ds≥1/2dp (ds为粗提物样品的抑菌圈直径, dp为阳性药的抑菌圈直径)的粗提物样品对应的菌株为具有抗菌活性的菌株。

2 结果与分析

2.1 黏细菌的分离鉴定

本研究从广西北海、防城港等地区不同海洋生态环境中采集样品共21份, 采用大肠杆菌诱导法和滤纸诱导法进行分离纯化, 共分离获得38株纯培养黏细菌。根据菌落形态、子实体大小及形态等特征(表2、图1), 结合16S rRNA基因序列分析, 最终将这些菌株初步鉴定为10个种, 4个属, 分别是黏球菌属(Myxococcus) 24株、珊瑚球菌属(Corallococcus) 10株、原囊杆菌属(Archangium) 3株、蜂窝囊菌属(Melittangium) 1株, 详细物种组成如表3所示。黏球菌属和珊瑚球菌属分别占菌株总数的63.16%、26.32%, 属于优势菌属。耐盐实验结果表明, 38株黏细菌中有33株黏细菌的耐盐能力≥1%, 10株黏细菌的耐盐能力≥1.5%, 其中菌株1Y01、3Y01、3H01、8C02、1Y02、2H01等能够生长在海盐浓度为2%的培养基中。
表2 黏细菌形态特征的初步鉴定

Tab. 2 Preliminary identification of myxobacteria according to morphological characteristics

菌属 菌株数 子实体形态 菌落形态
Myxococcus 24 球状、卵球状, 单生, 多为橙色、白色或红粉色, 表面光滑柔软 圆形, 菌膜薄且呈同心圆扩展
Corallococcus 10 波浪状、肠状或珊瑚状, 单生或簇生, 多为淡黄色、粉色或乳白色,
表面不光滑、较硬		 圆形, 菌膜薄且呈波浪纹扩展
Archangium 3 颗粒状, 簇生, 多为橘红色或棕色, 表面不光滑、较黏稠难挑 圆形, 菌膜薄、黏稠且呈放射状扩展
Melittangium 1 球状或扁平, 似蘑菇的菌伞, 分支生长, 黄褐色,表面不光滑 圆形, 菌膜薄、黏稠且呈放射状扩展
图1 部分样品中诱导出的子实体

Fig. 1 The fruiting body of some myxobacteria strains from samples. (a) Corallococcus aberystwythensis; (b) Corallococcus interemptor; (c) Corallococcus exiguus; (d) Corallococcus exercitus; (e) Melittangium boletus; (f) Archangium gephyra; (g) Myxococcus macrosporus; (h) Myxococcus fulvus; (i) Myxococcus virescens; (j) Myxococcus stipitatus

a. Corallococcus aberystwythensis; b. Corallococcus interemptor; c. Corallococcus exiguus; d. Corallococcus exercitus; e. Melittangium boletus; f. Archangium gephyra; g. Myxococcus macrosporus; h. Myxococcus fulvus; i. Myxococcus virescens; j. Myxococcus stipitatus

为进一步确定所分离得到的黏细菌纯培养菌株之间的亲缘关系, 本实验选取了10株不同种黏细菌菌株, 并在EzBioCloud数据库中下载与其相似性最高且为有效发表的模式菌株基因序列, 用Neighbor-Joining法构建系统发育树, 进而阐明种属间的亲缘关系。结果如图2所示, 这10株黏细菌可大致分为4个分支, 第一分支为珊瑚球菌属, 第二分支为黏球菌属, 第三分支是原囊菌属, 第四分支是蜂窝囊菌属。但属内物种之间亲缘关系较近, 区分度不高, 因此黏细菌菌株的系统分类地位仍要依靠子实体形态与16S分子手段相结合来确定。
图 2 基于N-J法对10种黏细菌的16S rRNA 基因序列构建的系统发育树

标尺0.05为进化距离, 分支上的数值为重复1000次所得自展值, 括号内为菌株登录号

Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of 10 species of myxobacteria based on the 16S rRNA gene sequences

表3 菌株的相关信息及耐盐能力

Tab. 3 Relevant information and salt-tolerance abilities of strains

种名 菌株编号 相似度/% 耐盐能力/%
Corallococcus aberystwythensis 3C01 99.61 1
Corallococcus exercitus 3D01 98.97 1
Corallococcus exiguus 6C01 98.85 1
Melittangium boletus 2D03 99.49 <1
Archangium gephyra 2D01 100.00 1
1Y01 99.74 2
4D01 99.15 1
Corallococcus interemptor 1C01 100.00 1
1D01 100.00 1
2D02 100.00 1
6C02 99.87 1
8C01 99.87 1.5
1C02 99.74 1
4H01 99.35 1
Myxococcus fulvus 2C01 99.87 1
1H02 99.74 <1
5C01 99.36 1
6H01 99.36 1
1C04 98.85 1
1D02 98.59 1
Myxococcus macrosporus 2Y01 100.00 1.5
5H01 99.87 1.5
1H01 99.74 1
4H02 99.36 <1
3Y01 99.10 2
3H01 98.97 2
1C03 98.87 1
Myxococcus stipitatus 4C01 99.87 1
7C01 99.74 <1
1C06 99.74 <1
3D02 99.62 1
1H03 99.50 1
5H02 99.49 1
1C05 99.49 1
Myxococcus virescens 8C02 99.49 2
1Y02 99.36 2
2H01 99.36 2
1C07 99.10 1.5

2.2 不同类型海洋生态环境中黏细菌分布情况

本研究对广西北海、防城港等不同海洋生境中的黏细菌分布进行统计(表4)。从红树林生境的6份样品中分离得到10株黏细菌, 隶属于2属5种; 从海草床的8份样品中分离得到16株黏细菌, 隶属2属7种; 从海岛的4份样品中分离得到8株黏细菌, 隶属4属6种; 从盐田生境的3份样品中分离得到的4株黏细菌隶属于2个属、3种。由实验结果可知, 在四种不同海洋生态环境中, 从海草床生境样品中分离得到的黏细菌物种数量最多, 其次为海岛和红树林生境, 物种数量最少的为盐田淤泥。从分离的种群来看, 分离得到的黏球菌属(Myxococcus)菌株数量最多, 达63.16%; 其次为珊瑚球菌属(Corallococcus), 为26.32%。推测是因为黏球菌属和珊瑚球菌属的黏细菌, 在大肠杆菌/滤纸片方法诱导下容易形成明显的子实体, 易被挑取纯化。此外, 从海岛生境样品中分离得到的黏细菌物种数量虽比海草床少, 但其菌属多样性均比其他生境更丰富; 盐田淤泥样品的出菌率虽然最低, 但其菌株重复性最低。
表4 不同类型海洋生境中黏细菌分布情况

Tab. 4 The distribution of myxobacteria in different types of marine biotopes

采样生境 样品份数 菌种数 黏细菌菌株数 总计
黏球菌属Myxococcus 珊瑚球菌属Corallococcus 原囊菌属Archangium 蜂窝囊菌属Melittangium
红树林 6 5 9 1 - - 10
海草床 8 7 10 6 - - 16
海岛 4 6 2 3 2 1 8
盐田 3 3 3 - 1 - 4
总计 21 - 24 10 3 1 38

2.3 黏细菌发酵提取物的抗菌活性

38株海洋黏细菌的丙酮提取物, 对9种致病细菌的活性检测发现有24株黏细菌代谢产物具有不同程度的抗菌作用(表5)。统计分析发现, M. stipitatus、M. fulvus、C. interemptor这三种黏细菌的发酵提取物具有广谱抑制作用, 对革兰氏阳性/阴性细菌均具有明显的抑制活性, 其最大抑菌直径约为19.74mm; 四种黏细菌(A. gephyra、C. aberystwythensis、C. exiguus、M. virescens)的发酵提取物仅能特异性地抑制革兰氏阳性细菌的生长, 其最大抑菌直径约为15.66mm; M. macrosporus的发酵产物对革兰氏阴性细菌的抑制作用优于革兰氏阳性细菌, 能显著抑制肺炎克雷伯菌, 其抑菌直径达18.16mm。此外, M. stipitatus (1H03、1C06、3D02)、M. virescens (2H01、1Y02)、M. fulvus (1C04)等菌株同时对6种以上指示菌表现出不同程度的抑制活性, 平均抑菌直径为12.14mm, 其中对MRSA的平均抑菌直径为9.79mm。结合HPLC数据分析发现, 不同菌株的发酵提取物具有菌株特异性, 活性物质组成丰富的菌株的抗MRSA活性更为明显(图3)。
表5 黏细菌发酵提取物的抑菌活性

Tab. 5 Antibacterial activity of extracts from fermentation of myxobacteria

菌种 编号 抑菌圈直径/mm
G+ G-
A B C D E F G H I
C. aberystwythensis 3C01 - - - - 12.03±0.32 12.58±0.44 - - -
C. exiguus 6C01 - - - - - 9.28±0.14 - - -
A. gephyra 1Y01 - - - - 12.07±0.04 - - - -
C. interemptor 1C01 - - - - 11.95±0.01 - - - -
1D01 - - - - 13.43±0.40 8.64±0.09 12.25±0.29 - -
2D02 - - 9.53±0.25 - 11.83±0.25 11.10±0.16 - - -
6C02 - - - - - 9.97±0.05 - - -
1C02 - - - 10.57±0.05 15.97±0.06 - - - -
M. fulvus 2C01 - - - 10.33±0.32 14.93±0.11 11.54±0.44 - - -
5C01 - 7.67±0.42 - - - 12.79±0.18 - - -
1C04 10.82±0.04 7.34±0.02 12.03±0.65 12.23±0.24 15.79±0.05 14.05±0.20 10.91±0.17 11.14±0.07 13.78±0.06
1D02 - - 8.40±0.30 - - 13.76±0.08 - - -
M. macrosporus 1H01 - - - - - - 18.16±0.24 - 9.65±0.03
4H02 - - - - - - - - 10.39±0.51
1C03 - - - - 14.19±0.05 - - - -
M. stipitatus 7C01 - - - 14.77±0.15 - 9.89±0.62 - - -
1C06 9.76±0.47 9.14±0.03 - 13.70±0.02 12.24±0.04 10.22±0.05 9.75±0.08 8.01±0.04 -
3D02 14.33±0.14 13.87±0.12 11.90±0.10 14.57±0.60 19.74±0.29 16.61±0.04 13.74±0.08 8.43±0.08 -
1H03 11.22±0.05 12.15±0.18 11.86±0.09 10.75±0.02 17.36±0.07 8.65±0.06 12.94±0.09 - -
1C05 12.90±0.36 - - - - 15.99±0.27 12.38±0.22 - -
M. virescens 8C02 - - - - - 14.00±0.26 - - -
1Y02 13.90±0.36 8.72±0.08 10.50±0.30 13.10±0.44 11.31±0.27 15.66±0.47 - - -
2H01 10.03±0.09 7.54±0.13 10.15±0.13 11.59±0.03 12.25±0.03 10.09±0.12 - - -
1C07 - - - - 15.59±0.03 - - - -
氨苄青霉素钠 - 19.46±0.30 10.40±0.15 14.33±0.38 20.17±0.23 22.10±0.19 17.11±0.56 17.02±0.03 15.72±0.02 18.39±0.12
空白对照 - - - - - - - - - -

注: A: B. subtilis; B: MRSA; C: S. epidermidis; D: S. aureus; E: M. luteus; F: A. viscosus; G: K. pneumoniae; H: A. baumannii; I: P. aeruginosa

图3 不同黏细菌菌株代谢产物分析

Fig. 3 Analysis of metabolites of different myxobacterial strains

3 讨论

本研究对采自广西北部湾红树林、海草床、海岛及盐田等地的21份海洋样品进行了黏细菌的分离纯化, 获得1个亚目, 2个科, 4个属的38株纯培养黏细菌。初步鉴定为黏球菌属24株, 珊瑚球菌属10株, 原囊菌属3株, 蜂窝囊菌属1株。进一步考察所得菌株的耐盐能力, 发现所得黏细菌基本能在1%盐浓度中生长, 不同菌株的耐盐生长能力也不同。其中, 10株黏细菌的耐盐能力≥1.5%, 菌株1Y01、3Y01、3H01、8C02、1Y02、2H01等能够生长在海盐浓度为2%的培养基中, 仍能保持完整的子实体形态, 为耐盐黏细菌。不少研究表明典型的陆生黏细菌在超过1%的盐浓度下通常不能生长, 而耐盐度超过1.4%即可视为耐盐菌株(Zhang et al, 2005; Wang et al, 2007; 骆宁宁, 2015; Moghaddam et al, 2016; Zhang et al, 2019)。目前文献报道的耐盐和嗜盐黏细菌仅来自侏儒囊菌亚目(Nannocystineae), 除Kofleria flava 分离自陆生环境之外, 其他6个属Haliangium, Paraliomyxa, Nannocystis, Enhygromyxa, Plesiocystis, Pseudenhygromyxa的黏细菌均分离自海洋环境(Albataineh et al, 2018; 王春玲 等, 2021)。本研究从北部湾海洋环境中分离得到的耐盐黏细菌M. macrosporus, M. virescens, C. interemptor, A. gephyra均属于孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae), 丰富了耐盐黏细菌的分类群, 可见北部湾海洋环境中蕴藏着丰富的耐盐黏细菌资源, 亟待进一步挖掘。
李越中教授团队通过10000份来源于不同生境的EMP数据和公开信息对比分析发现, 黏细菌更偏好土壤生境, 极少依赖于宿主共存(Wang et al, 2021)。本研究从涠洲岛的4份泥质样品中分离得到6种黏细菌隶属于4个属, 黏细菌物种多样性较红树林、海草床、盐田等海洋生境更丰富, 可见北部湾海岛生境样品是挖掘海洋黏细菌资源的重要来源之一。此外, 本实验从药用红树木榄的胚轴、树皮等样品中分离得到3株2种(C. interemptor、M. macrosporus)共附生黏细菌, 可进一步关注红树林生态环境中宿主依赖型黏细菌类群的分离纯化。
迄今为止发现的所有嗜盐黏细菌都能溶解各种革兰氏阴性细菌, 对革兰氏阴性菌起特异性抑制作用(Iizuka et al, 2013; Albataineh et al, 2018)。本研究发现24株海洋来源的黏细菌代谢产物对9种不同指示菌具有不同程度的抑制能力, 抗菌阳性率达63.16%, 为进一步挖掘新型抗生素提供了更为丰富的菌种资源。研究表明其代谢提取物对革兰氏阳性病原菌的抑制作用优于革兰氏阴性病原菌, 仅8株黏细菌对革兰氏阴性病原菌有活性。究其原因有二: (1) 革兰氏阴性病原菌的耐药谱较广、耐药性更强、耐药机制复杂多样等特点, 增加了防治困难; (2) 目前的分离方法有限, 导致本实验未能分离得到海洋专性嗜盐黏细菌, 也未能获得更多特异性抑制革兰氏阴性病原菌的活性菌株。尽管如此, 研究过程中, 我们发现一株黏细菌M. macrosporus (1H01)的代谢产物能显著抑制肺炎克雷伯菌的生长, 其抑菌直径为18.16mm, 活性效果优于阳性药(抑菌直径为17.02mm)。后续将进一步研究该菌株代谢产物中抗肺炎克雷伯菌活性成分的组成及其结构, 并深入探讨其抗菌机制, 以期为抗菌药物的开发提供参考。
本研究首次对广西北部湾海洋生境中的黏细菌资源进行探索, 为广西北部湾海洋微生物资源库增添了一批具有抗菌活性的黏细菌资源, 为进一步深入挖掘及抗生素研发奠定物质基础。但受限于常规的海洋黏细菌分离纯化方法, 目前所得黏细菌仅为北部湾黏细菌资源的“冰山一角”, 仍有大量的海洋黏细菌未能获得纯培养物。如何推动海洋黏细菌这一重要药源微生物资源的开发和利用, 挖掘更多的新型抗生素, 仍任重道远。一方面, 应加大难培养海洋黏细菌的获得技术的创新研发力度; 另一方面, 应加快突破海洋黏细菌发酵培养技术的现有瓶颈, 以提高实验室培养条件下黏细菌的化学多样性, 获得更多结构新颖、活性显著的天然结构。显然, 这些都是未来黏细菌挖掘工作中的重大挑战。

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