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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 4: 146 - 154

DOI: https://doi.org/10.11978/2022197

海洋生物学

基于RNA-Seq高通量测序技术的法螺差异表达基因分析

  • 刘文广 , 1 ,
  • 张格格 1, 2 ,
  • 岑希彤 1, 2 ,
  • 何毛贤 , 1
展开
  • 1.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省应用海洋生物学重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
何毛贤。email:

刘文广(1978—), 山东省聊城市人, 副研究员, 主要从事贝类育种及环境适应性研究。email:

Copy editor: 姚衍桃

收稿日期: 2022-09-20

  修回日期: 2022-10-17

  网络出版日期: 2022-10-13

基金资助

国家自然科学基金项目(42176129)

广东省自然科学基金项目(2022A1515010779)

收起

Analysis of differential expressed genes from Charonia tritonis based on transcriptome sequencing

  • LIU Wenguang , 1 ,
  • ZHANG Gege 1, 2 ,
  • CEN Xitong 1, 2 ,
  • HE Maoxian , 1
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
HE Maoxian. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2022-09-20

  Revised date: 2022-10-17

  Online published: 2022-10-13

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42176129)

Natural Science Foundation of Guangdong Province(2022A1515010779)

Fold

摘要

法螺是珊瑚礁“杀手”长棘海星为数不多的自然捕食者之一, 是珊瑚礁生态系统的重要保卫者。但是, 由于海洋环境变化、人类的过度捕捞、珊瑚礁栖息地被破坏等因素, 法螺的自然资源遭受严重破坏, 已长期处于濒临灭绝的状态。尽快开展法螺基础研究迫在眉睫, 但是该物种的基因组资源有限, 阻碍了如生物矿化等分子机制的深入研究。本研究借助于Illumina HiSeqTM2000测序平台完成了法螺两种组织(肌肉与外套膜)的高通量测序工作。测序所得原始序列经筛选、组装之后比对到NR、NT、Swissprot、KEGG、GO和InterPro数据库中获得注释结果, 并进行差异基因聚类分析。结果表明, 测序共获得109722个Unigene, 其中有46239个Unigene得到功能注释, 共获得7994个差异表达基因, 其中在法螺外套膜组织中有 3196个上调, 4798个下调。对差异表达基因(differentially expressed genes, DEG)的GO注释和KEGG富集分析显示, 高表达的DEG显著富集在典型的生物矿化相关通路中, 如糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素通路(glycosaminoglycan biosynthesis chondroitin sulfase dermatan sulfate)、磺基转移酶活性(sulfotransferase activity)、钙离子结合(calcium ion binding)等。通过实时定量荧光聚合酶链反应(RT-qPCR)对8个与矿化相关的DEG基因的表达情况进行验证表明, 其表达趋势与转录组测序结果一致。本研究中所获得丰富的转录本和全面的转录组信息, 增加了法螺基因信息的同时, 还为法螺矿化机制的解析提供了一定的数据支持。

关键词： 法螺; 转录组; 差异表达基因

本文引用格式

刘文广 , 张格格 , 岑希彤 , 何毛贤 . 基于RNA-Seq高通量测序技术的法螺差异表达基因分析[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(4) : 146 -154 . DOI: 10.11978/2022197

Abstract

The giant triton snail (Charonia tritonis), an endangered gastropod species of ecological and economic importance, is widely distributed in coral reef ecosystems of the Indo-West Pacific region and the tropical waters of the South China Sea. Research on molecular mechanisms is limited due to the lack of complete genomic data for this species. In the present work, transcriptome sequencing of foot muscle and mantle in C. tritonis were obtained by Illumina HiSeq sequencing platform, from which 7994 (3196 upregulated and 4798 downregulated) differentially expressed genes (DEGs) containing biomineralization sequences were identified. The top 20 GO terms in the molecular function category were considered to be related to biomineralization. In KEGG classifications, DEGs are primarily enriched in some pathways that may be involved in biomineralization. The results of qPCR showed that three of the eight genes examined are significantly up-regulated in the mantle. Our results improve the understanding of biomineralization in C. tritonis and provide fundamental transcriptome information to study other molecular mechanisms, such as reproduction.

Key words： Charonia tritonis; transcriptome; DEG

法螺(Chanoria tritonis)是迄今为止已知的珊瑚礁生态系统中最大的肉食性腹足纲软体动物, 多栖息于在印度-西太平洋一带的热带珊瑚礁海域(Zhang et al, 2013; Bose et al, 2017a)。法螺是珊瑚礁“杀手”长棘海星为数不多的天敌之一, 在珊瑚礁生态系统中扮演着“守护神”的角色。但是, 由于海洋环境的改变、人类持续的过度捕捞及珊瑚栖息地的破坏等原因, 法螺的自然资源已严重退化至濒临灭绝的状态(Klein et al, 2021)。出于保护法螺这一独特又极具生态价值物种的考虑, 全方位开展法螺的基础研究工作迫在眉睫。然而, 法螺的基因组序列尚未公布, 遗传背景模糊, 严重阻碍了法螺功能基因(如与生长、繁殖和生物矿化等重要性状相关的基因)的挖掘(Zhang et al, 2021), 更制约了其基因组学方面的研究。因此, 采用转录组测序技术对法螺组织进行高通量检测具有重要的意义(Bose et al, 2017a; Bose et al, 2017b)。
转录组高通量测序技术, 即RNA-seq, 无需被测物种的完整基因组序列, 就能够完整且迅速地取得特定细胞或者组织中的大部分转录本特定状态下的序列信息及表达信息(Moreira et al, 2015; Kim et al, 2017; Malachowicz et al, 2019)。该技术因为具备通量高、灵敏度强、检测范围广、成本低且无需被测物种的基因组序列信息等优点, 已经成为研究非模式生物的不可或缺的手段, 更是在批量筛选挖掘无参考基因组物种的功能基因上发挥着独特的优势(Ghiselli et al, 2018; Wang et al, 2018; Yuen et al, 2019)。
本研究借助Illumina HiSeqTM2000平台完成了法螺两个组织(外套膜和肌肉组织)高通量的转录组测序, 通过对获得的高质量转录本进行拼接与组装、基因功能注释以及功能基因挖掘等研究, 不仅获得了丰富的法螺转录本和更为全面的转录组信息, 为后续法螺重要功能基因的发掘、相关基因克隆与表达提供参考基础, 更为我们了解法螺生物矿化的分子机制提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

该研究中所用测序组织均取自于中国南海南沙群岛水域所收集的3只法螺样本。将法螺的外套膜组织及肌肉组织从法螺个体上剪下来后迅速放置于液氮罐中急冻, 随后转移至-80℃冰箱中冷藏备用。

1.2 总RNA的提取

按照Invitrogen 公司的Trizol Reagent 试剂操作说明对法螺组织样本分别进行总RNA的提取。提取获得的总RNA浓度、RNA integrity number(RNA完整值, 即RIN值)、28S与18S的比值均由Agilent 2100 Bioanalyzer仪器来测定; 使用1.2%琼脂糖凝胶电泳来衡量RNA片段的完整度; 与此同时, 利用NanoDropTM来评估总RNA的纯度, 确保后续转录组测序中用来建库的RNA的质量是合格的。

1.3 构建cDNA文库及测序

提取样品总RNA, 利用Oligo (dT) 磁珠分离并纯化出mRNA, 将mRNA 打断为片段, 碎片化的mRNA作为模板合成第一链cDNA, 然后在适当的反应体系中合成第二链cDNA, 同时利用试剂盒纯化回收合成的cDNA, 修复黏性末端在其3’端加载“A”和连接接头等一系列操作后, 选择正确的片段进行PCR。对通过以上操作成功构建的文库进行质量控制, 质量合格的文库被用于后续的高通量测序。测序部分由华大基因(深圳)基于Illumina HiseqTM2000测序平台完成, 并对所获得的序列进行拼接组装与注释。

1.4 从头组装与功能注释

经过上述操作获得的原始序列中包含一些低质量序列和接头, 去除掉这些不合格的部分才能获得clean reads。质检合格的clean reads由Trinity(v2.0.6)软件来完成De novo组装, 以期获得转录本。利用Tgicl (v2.0.6)将转录本进行聚类去冗余, 得到Unigene; 二次使用Tgicl(v2.0.6)对法螺外套膜组织和肌肉组织得到的Unigene执行聚类去冗余步骤得到All-Unigene, 并且后续的注释、分析工作均基于All-Unigene来完成。分别使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载的Blastn与Blastx来完成Unigene序列在NT及NR、Swissprot、KEGG数据库中的比对及注释工作。Unigene序列的GO数据库注释则是基于NR数据库的注释结果使用Blast2GO进行再次比对及注释, Unigene序列的InterPro注释信息则由InterProScan5软件来获得。选择阈值条件为E<10-10, 通过序列相似性进行功能注释。

1.5 差异表达基因分析与功能注释

采用Bowtie2(Langmead et al, 2012)将样本获得的clean reads比对到Unigene, 之后使用RSEM(Li et al, 2011)计算各个样本的基因表达水平, 与此同时, 每个Unigene的表达丰度由相对应的FPKM值来衡量。Unigene表达量的高低直接表征不同样本之间Unigene表达上的差异。本研究基于PossionDis 算法(Claverie et al, 1997)进行不同样本之间的差异表达基因的检测, 获得法螺不同组织样本之间的基因表达模式的差异。随后通过FDR(false discovery rate)校验方法对差异表达基因(differentially expressed genes, DEG)的P值进行假阳性检验。在筛选过程中, 将符合FDR≤0.001且FC(fold change)≥2的基因定义为DEG。根据GO数据库和KEGG数据库官网的分类及注释结果, 将DEG进行功能上的划分, 同时采用R软件中的phyper函数对基因的富集情况进行计算与分析。P值计算公式如下:
P = 1 − ∑ i = 0 m − 1 M i N − M n − i N n
式中: N为GO term或KEGG Pathway注释到的Unigene数目; n代表DEG在N中所占的个数; M则意味着全部Unigene中注释到某特定GO term或KEGG Pathway中的Unigene个数; m为注释为某特定GO term或Pathway的DEG数目。然后对P值进行 FDR 校正, 符合FDR≤0.01则被认定为显著富集。

1.6 QPCR

按照逆转录试剂盒ReverTraAce qPCR RT master mix with gDNA Remover所给步骤进行操作, 将1.2节中所提到的RNA反转录为cDNA。采用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo)和LightCycler480 (Roche, Switzerland)仪器, 以18S rRNA 为内参基因来完成实时荧光定量PCR。反应体系为: SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 5.0μL, 双蒸馏水3.4μL, cDNA 模板1μL, 上、下游引物各0.3μL, 共10μL。反应程序设置如下: 95℃高温条件下进行10s的预变性, 57℃下退火15s, 72℃下延伸15s, 如此进行45个循环; 最后设置95℃下, 10s的溶解曲线。程序结束后, 根据靶标基因和参照扩增子基因18S的Cp值, 使用2^-(∆∆Ct)法转换计算靶标基因的相对表达量(Livak et al, 2001)。所有数值的统计与计算均由SPSS软件来完成, 数值以均值±标准差(SD)来表示, P值用来衡量基因表达量数值是否具有统计学意义, P<0.05意味着基因之间差异显著, P<0.01则代表基因表达量之间的差异极其显著。

2 结果

2.1 测序数据组装与分析

本研究中, 法螺肌肉组织转录组测序共得到44.07Mb的高质量clean reads, 包含6.61Gb核苷酸序列信息, 96.84%的碱基质量值Q≥20, 92.83%的碱基质量值Q≥30。外套膜组织转录组测序共得到44.12Mb的高质量clean reads, 包含6.62Gb核苷酸序列信息, 96.86%的碱基质量值Q≥20, 92.79%的碱基质量值Q≥30。上述数据表明, 法螺两种组织的测序结果质量较高, 满足后续数据分析要求。通过De novo组装, 法螺肌肉组织共获得了183823个转录本和87443个Unigene。其中, 转录本总长度为77194101bp, 平均长度为419bp, N50长度为476bp, GC含量为43.27%。而法螺外套膜组织共获得了168326个转录本和 81100个Unigene, 其中转录本总长度为72504764bp, 平均长度为430bp, N50长度为501bp, GC含量为43.84%。经二次拼接后, 共获得109722个用于后续分析的All-Unigene(表1)。其中, All-Unigene总长度为70289861bp, 平均长度为640bp, N50长度为995bp, GC含量为43.43%, 长度主要分布在300~3000bp之间, 大于3000bp的有2718个(图1)。以上这些结果说明数据组装效果较为理想。
表1 转录组数据组装结果统计

Tab. 1 Assembly result of transcriptome data

样本名称 总数/个 总长度/bp 平均长度/bp N50长度/bp N70长度/bp GC碱基对数量/%
法螺肌肉 87443 50845674 581 799 426 43.26
法螺外套膜 81100 48450379 597 843 442 43.78
All-Unigene 109722 70289861 640 995 485 43.43
图1 转录组All-Unigene的序列长度分布

Fig. 1 Sequence length distribution of assembled All-Unigene from Illumina HiSeq 2000 reads for the foot muscle and mantle transcriptome of Charonia tritonis

2.2 功能注释

将组装获得的109722个Unigene注释到七大功能数据库 (NR、NT、GO、KOG、KEGG、Swissprot和InterPro)中, 最终获得46239个有注释信息的Unigene, 具体注释结果见表2。
表2 基因注释数量统计

Tab. 2 Number of Unigene annotated in NR, NT, Swissprot, KEGG, GO and InterPro database

总数 NR NT Swissport KEGG KOG InterPro GO Intersection Overall
基因个数 109722 26050 27059 16944 18705 15319 17617 9788 2712 46239
注释比例 100% 23.74% 24.66% 15.44% 17.05% 13.96% 16.06% 8.92% 2.47% 42.14%

注: Intersection指的是7个数据库中同时存在的Unigene的数量和比例; Overall为7个数据库中所有数据库注释上的Unigene总数及比例

将得到的Unigene与NR数据库中的基因进行同源性对比时, 有26050个(23.74%)Unigene与已知基因同源。相似序列匹配的近缘物种中, 相似序列所占比例最高的是海兔(aplysia californica)(26.16%), 随后依次为光滑双脐螺(biomphalaria glabrata)(11.97%)、霸王莲花螺(lottia gigantea)(11.51%)、虾夷扇贝(mizuhopecten yessoensis)(9.32%)。另外, 总共有41.04%的Unigene没有获得注释结果(图2)。
图2 NR库注释物种分布图

Fig. 2 Distribution of species annotation of sequences matching unigenes from Charonia tritonis

将所有比对上NR数据库的Unigene结果注释到GO数据库中, 共有 9788个(8.92%)Unigene在3个大类56个亚类类别上取得了功能性的同源性注释。在生物过程、细胞成分和分子功能中分别有13206个、18698个和10383个Unigene。其中, 生物过程这一大类别的“细胞”和“代谢”亚类类别中, 聚集的Unigene最多; 在细胞组成这一大类中, 富集在“细胞”亚类类别上的Unigene明显是最多的, 其次是“细胞部分”及“膜”, 分别是3371个、3314个和3313个; 而在分子功能这一大类别的“结合和催化活性”亚类中, 所富集的Unigene是最多的。采用KEGG数据库对法螺转录组数据中所包含的Unigene潜在参与的生理及生化反应途径进行分析及注释, 共有18705个Unigene得到具体的注释结果。这些Unigene共参与在包含细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢、有机系统这6个大类共44个亚类的336个通路中。其中, 在信号转导通路中获得注释的Unigene最多, 共有3353个(图3)。在该大类中, 获得注释的Unigene较多的通路分别为钙信号通路(782个, 占4.18%)、Apelin信号通路(619个, 占3.31%)、PI3K-Akt 信号通路(475个, 占2.54%)等。
图3 Unigenes的GO注释(a)和KEGG注释(b)

Fig. 3 GO annotation of unigenes (a) and KEGG annotation of unigenes (b)

2.3 差异表达基因注释

基于样本中各个基因的表达水平, 检测出法螺肌肉组织和外套膜组织之间共有7994个差异表达基因(DEG), 其中上调表达基因3196个, 下调表达基因4798个。将筛选到的DEG注释到GO数据库中, 结果显示, 在3个主要类别中, 富集基因最多的是细胞组分这一大类别, 共富集了2445个基因; 其次是生物过程这一类别中富集了1529个基因; 最后是分子功能这一类别中富集到1434个基因。在分子功能这一大类中, “结合功能”和“催化活性”这2个亚类所富集到的基因最多, 分别是623个(43.44%)和522个(36.40%)。而在细胞成分这一大类别中, 相当多的基因集中富集在“膜”(544个, 占22.25%)、“膜馏分”(501个, 占20.50%)与“细胞”(378个, 占15.46%)亚类类别中。另外, 在生物过程这一大类别中, “细胞过程”、“代谢过程”、“生物调节”这3个亚类类别中富集的基因最多, 分别是423个(27.67%)、321个(21%)和155个(10.14%)。聚焦于在分子功能类别下, 富集基因最多的前20个通路如图4所示, 其中磺基转移酶活性(sulfotransferase activity)、转移含硫基团的转移酶活性(transferase activitytransferring sulfur-containing groups)、钙离子结合(calcium ion binding)这些通路被认为是与生物矿化功能密切相关的功能性通路。
图4 GO二级分类分子功能下DEG富集最多的20个GO term (a)和KEGG二级分类分子功能下DEG富集最多的20个通路(b)

Fig. 4 The 20 most enriched GO terms related to DEG in the Molecular Function Category (a) and Top 20 enriched Pathway related to DEG in the Molecular Function Category (b)

2.4 qPCR验证

在DEG显著富集的生物矿化相关通路中筛选出了8个典型的生物矿化基因, 如骨形成蛋白、碳酸酐酶、几丁质酶样凝集素等。随后借助qPCR来表征以上差异表达基因的实际表达情况, 结果如图5所示。由图可知, BMP1-1与BMP1-3基因在法螺外套膜组织中显著高表达, 但是BMP1-2却在足部肌肉组织中极显著高表达。
图5 差异表达基因的qPCR验证结果

各子图标题中: CA表示carbonic anhydrase(碳酸酐酶), BMP表示bone morphogenetic protein(骨形成蛋白), BAMBI表示BMP and activin membrane bound inhibitor(BMP和激活素膜结合抑制剂), CHIL表示chitinase-like lectin(几丁质酶样凝集素), CHI3L表示chitinase-3-like protein(壳多糖酶3样蛋白); 括号中注明的是相关基因的ID

Fig. 5 Relative mRNA expression profiles of biomineralization-related genes of C. tritonis

结合高通量测序结果中基因的表达量和qPCR实验中目的基因的表达量来看, 生物矿化相关基因表达量在二者中具有相同的变化趋势。这意味着本研究中基于Illumina HiseqTM2000测序平台所获得的法螺肌肉组织和外套膜组织的测序数据具有较高质量, 且可信度极高, 同时也意味着后续的基因注释结果同样比较可靠。随后对BMP基因做进化分析, 结果显示, 在法螺外套膜组织中高表达的BMP1-1与 BMP1-3在遗传距离上更为接近(图6), 而在法螺肌肉组织中高表达的BMP1-2与上述两个基因并未聚为明显的一支, 未形成BMP1-1和BMP1-3的集群。
图6 法螺BMP基因的系统进化分析

Fig. 6 A Phylogenetic tree obtained from the bone morphogenetic protein (BMP) gene families

3 讨论

高通量测序技术因自身具备的测序范围广、灵敏高、价格低廉、不需要被测生物的基因组序列信息等不可替代的优势, 已经发展为研究模式与非模式生物的关键性首选技术, 在挖掘与生物重要性状相关联的通路及基因方面呈现出显著优势(Shi et al, 2019; Xu et al, 2019; Yan et al, 2019; Nie et al, 2020)。
在没有法螺的完整基因组序列的前提下, 本研究成功构建了法螺肌肉与外套膜组织的cDNA文库, 并最终获得109722个Unigene序列。一般情况下, 二代测序中N50的长度大于800bp, Q20大于90%, Q30在80%以上, 就意味着获得的测序数据的质量很高(Moreira et al, 2015; Ghiselli et al, 2018; Lavelle et al, 2018; Zhang et al, 2021)。而本研究中, 各样本的N50为995bp, Q20均处在高于96%的水平, Q30则在92%以上, 说明法螺组织样本的测序和组装质量都是极其不错的, 所得的Unigene序列可信度较高, 完全满足进一步对Unigene序列进行分析及功能注释的需求, 证明利用Illumina HiseqTM2000平台对法螺这种无参考基因组生物的组织进行测序是非常具备优势的。测序所得基因序列在公共数据库中进行同源性比对时, 只有42.14%的基因序列可以获得注释结果, 其余的序列没有被注释上, 原因如下: (1)法螺的分子研究基础仍旧处在一个较为薄弱的阶段, 导致缺乏法螺遗传背景方面的信息, 用于基因注释的各个数据库中涵盖的腹足纲生物的相关基因信息不足以为法螺的Unigene序列注释提供足够的参考序列(Moreira et al, 2015)。(2)片段化的序列在组装为Unigene时不够长, 会导致组装的Unigene出现一定程度的碎片化, 这会大大减少基因注释成功的个数。其中, 在法螺转录组数据被注释到NR数据库中时, 与海兔(Aplysia californica)拥有最多的相似基因序列, Unigene占有的比例最高(26.16%)。这可能是因为二者同为腹足纲生物, 在亲缘关系上较为相近, 且海兔的基因组序列早已被公开。同源基因序列的功能注释提供了关于代谢途径和其他方面的信息, 这将为进一步挖掘法螺的功能基因提供有价值的数据支撑(Li et al, 2016; Ghiselli et al, 2018; Ma et al, 2019)。
转录组测序数据的注释结果显示, 许多基因被注释为与生物矿化相关, 并且其中部分基因在肌肉和外套膜之间存在差异表达, 如作用于糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素通路的基因, 影响磺基转移酶活性的基因, 与钙离子结合途径相关的基因等(Zhang et al, 2021)。糖胺聚糖属于在各种生物体内均有发现的一类蛋白聚糖, 主要被分为四大类: 硫酸软骨素类、硫酸角质素类、硫酸乙酰肝素类及透明质酸类(郝瑞娟 等, 2015)。已有研究表明, 糖胺聚糖与脊椎动物和无脊椎动物的生物矿化功能息息相关(姜铁民 等, 2017; 李琛 等, 2017)。碳酸钙是软体动物外壳的主要成分之一, 其中硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)在调节碳酸钙的形态方面发挥着重要的作用, 与软体动物的生物矿化密切相关(王庆恒 等, 2017)。随后, 采用qPCR技术检验分子通路中与生物矿化功能相关的基因的表达情况时, 发现有 3个基因(BMP1-1、BMP1-3、CA2)在法螺外套膜组织中的表达呈现显著上调的趋势, 这与该组织的转录组测序结果中这些基因具备一样的表达趋势, 说明这3个基因均有可能参与了法螺的生物矿化过程(Jozef et al, 2013; Yan et al, 2019; Zhang et al, 2020)。基于BMP1基因所构建的系统进化树可知, 法螺的BMP1基因同源物之间存在相当大的差异, 并认为BMP1基因的功能在法螺进化的过程中出现了一定程度的分化现象。基因差异表达的模式也就意味着BMP1基因在法螺中可能不仅承担生物矿化功能, 还承担着其他与法螺生命活动相关的生物学功能, 但该结果还有待进一步探究。
本研究不仅增加了数据库中法螺的基因序列信息, 为解析其生物矿化机制提供了理论依据, 还为进一步挖掘法螺重要生物学性状相关基因提供了信息基础。

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