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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 4: 184 - 194

DOI: https://doi.org/10.11978/2022208

海洋资源开发

海参抗菌肽的活性筛选与功效评价

  • 袁华标 , 1, 2, 4 ,
  • 黄靖彤 1, 2, 4 ,
  • 万鹏 1, 3, 4 ,
  • 蔡冰娜 1, 3, 4 ,
  • 潘剑宇 1, 3, 4 ,
  • 张煜航 1, 2, 4 ,
  • 凌娟 1, 3, 4 ,
  • 陈华 , 1, 3, 4
展开
  • 1.中国科学院南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
  • 3.南方海洋科学与工程广东省实验室(广州), 广东 广州 511458
  • 4.中国科学院南海生态环境工程创新研究院, 广东 广州 510301
陈华, 副研究员。email:

袁华标(1997—), 男, 广东湛江人, 硕士研究生, 从事海洋生物活性肽的分离纯化与活性研究。email:

Copy editor: 姚衍桃

收稿日期: 2022-09-30

  修回日期: 2022-11-09

  网络出版日期: 2022-12-05

基金资助

广东省海洋经济发展专项(粤自然资合[2022]036)

广东省海洋经济发展专项(粤自然资合[2020]036)

广东省海洋经济发展专项(粤自然资合[2020]041)

广东省自然科学基金项目(2022A1515010767)

广东省重点领域研发计划(2020B1111030004)

中国科学院南海生态环境工程创新研究院自主部署项目(ISEE2021PY05)

海南省重点研发计划(ZDYF2021SHFZ109)

收起

Screening and efficacy evaluation of antibacterial peptides from Holothuroidea

  • YUAN Huabiao , 1, 2, 4 ,
  • HUANG Jingtong 1, 2, 4 ,
  • WAN Peng 1, 3, 4 ,
  • CAI Bingna 1, 3, 4 ,
  • PAN Jianyu 1, 3, 4 ,
  • ZHANG Yuhang 1, 2, 4 ,
  • LING Juan 1, 3, 4 ,
  • CHEN Hua , 1, 3, 4
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China
  • 4. Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
CHEN Hua. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2022-09-30

  Revised date: 2022-11-09

  Online published: 2022-12-05

Supported by

Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC[2022]036)

Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC[2020]036)

Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC[2020]041)

National Natural Science Foundation of Guangdong, China(2022A1515010767)

Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province(2020B1111030004)

Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences(ISEE2021PY05)

Key Research and Development Program of Hainan Province(ZDYF2021SHFZ109)

Fold

摘要

本文将已有文献报道的海洋动物源抗菌肽(毒素除外)与海参蛋白组进行比对, 结合生物信息学软件, 设计、筛选海参抗菌肽, 并对其理化特性、抗菌活性与机制、生物相容性与细胞活性等进行研究。研究结果发现, 通过软件模拟与抗菌活性预测, 最终筛选并固相合成7条海参抗菌肽(H1—H7)。其中, H4(RVHRFLRR)可通过细菌膜电位去极化、膜透化等方式, 抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)生长, 在较低浓度(31.25µg·mL-1)时, 可使S. aureus细菌总数降至84.93%±4.21%(p<0.01), P. aeruginosa细菌总数降至95.92%±0.52%(p<0.01), V. vulnificus细菌总数降至77.14%±1.37%(p<0.01)。H4生物相容性好, 在<1000µg·mL-1时均未表现出溶血性或细胞毒性, 其可能通过与细胞膜表面受体(EGFR、VEGFR2、FGFR1等)发生相互作用进而促进细胞迁移。在浓度为62.50µg·mL-1和250µg·mL-1时, H4均可显著促进L929细胞发生迁移(p<0.05)。实验结果表明, 海参抗菌肽H4生物相容性好, 兼有抗菌、促愈合功效, 可望作为一种潜在功能物质用于感染创面的修复与再生。

关键词： 海参; 抗菌肽; 生物信息学; 细胞迁移

本文引用格式

袁华标 , 黄靖彤 , 万鹏 , 蔡冰娜 , 潘剑宇 , 张煜航 , 凌娟 , 陈华 . 海参抗菌肽的活性筛选与功效评价[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(4) : 184 -194 . DOI: 10.11978/2022208

Abstract

In this paper, we compared the existing marine animal origin antibacterial peptides reported (Toxin except) with the holothurian proteome, combined with bioinformatics software to design, screen holothurian antibacterial peptides, and to investigate their physicochemical properties, antibacterial activity, mechanism, biocompatibility and cellular activity. It was found that through software simulation and antibacterial activity prediction, 7 holothurian bacteriostatic peptides (H1~H7) were finally screened and solid-phase synthesized. Among them, H4 (RVHRFLRR) could inhibit the growth of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio vulnificus through bacterial membrane potential depolarisation or membrane permeabilisation. At a lower concentration (31.25 µg·mL-1), it reduced the total bacterial count of S. aureus to 84.93%±4.21%(p<0.01), P. aeruginosa to 95.92%±0.52%(p<0.01) and V. vulnificus to 77.14%±1.37%(p<0.01). It was also found that H4 was biocompatible and did not exhibit haemolytic or cytotoxic properties at < 1000 µg·mL-1. In addition, H4 may interact with cell membrane receptors (EGFR, VEGFR2, FGFR1, etc.) to promote cell migration. H4 significantly promoted the migration of L929 cells at both 62.50 µg·mL-1 and 250 µg·mL-1 (p<0.05). The above experimental results indicate that holothurian antibacterial peptide H4 is biocompatible, has both antibacterial and pro-healing effects, and can be used as a potential functional active substance for the repair and regeneration of infected wounds.

Key words： Holothuroidea; antibacterial peptide; bioinformatics; cell migration

抗菌肽是一类自然界广泛存在的小肽类物质, 是机体先天免疫的重要组成部分(李冠楠 等, 2014), 其主要通过与带负电荷细胞膜直接作用造成细菌膜损伤, 或进一步与胞内核酸、酶等作用抑制细菌生理活动(侯晓艳, 2019)。抗菌肽除直接的抗菌活性外, 还具有促进伤口愈合, 刺激血管通透性增加, 调节吞噬细胞活性等(Hancock et al, 2000)多种功能。
海参属于棘皮动物, 具有先天免疫系统, 缺乏适应性免疫系统, 而抗菌肽对于其先天免疫至关重要(Li et al, 2015)。海参还拥有强大的再生自愈能力, 在受到强烈刺激或处于不良环境时会排出全部内脏, 环境合适时则会再生(聂竹兰 等, 2006)。对海参抗菌肽的探索, 不仅能够补充对棘皮动物包括海参抗菌肽的研究, 以及更好地对海参免疫功能进行描述, 同时也能寻找到抗菌性能较好的多肽序列, 并尝试应用于创伤修复等多种领域。
包括基因组、蛋白质组和功能信息的数据库和生物信息学工具已成为抗菌肽类药物中不可或缺的一部分, 其中计算方法包括基因组学、分子模拟和动力学、分子对接、结构和功能预测以及定量结构-活性关系等(Hammami et al, 2010)。采用生物信息学的方法对抗菌肽进行设计和筛选, 不仅能够加快筛选效率, 降低成本, 辅助数据信息挖掘, 同时也能够对抗菌肽的活性、构效关系和理化特性获得更好的理解。
本研究将已有文献报道的抗菌肽与海参蛋白组进行比对, 结合生物信息学软件, 设计、筛选出抗菌肽序列, 并对其理化特性、抗菌活性与机理、生物毒性、细胞活性等进行研究, 以期获得具有较好生物相容性、抗菌、促愈合功效的海参抗菌肽, 最终为促进感染创面修复提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) GDMCC1.221、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)GDMCC1.175、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)GDMCC1.733, 购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

CAMHB肉汤培养基(北京酷来搏), MH琼脂培养基(广东环凯微生物), DMEM培养基(gbico), 胎牛血清(gbico), 乳酸环丙沙星注射液(洛阳惠中兽药), 枸橼酸钠抗凝兔血(广州蕊特生物), 生理盐水(四川科伦), PBS缓冲液(cytiva), D-(+)-葡萄糖(阿拉丁), N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)(阿拉丁), TritonX-100(BioFroxx), 碘化丙碇(BBI), 3,3'-二丙基硫杂二羰花青碘化物(阿拉丁), CCK-8(碧云天), 活死染色剂(凯基生物)。

1.1.3 仪器

酶标仪(BioTek), 恒温恒湿培养箱(宁波江南), CO2细胞培养箱(STIK), 台式高速冷冻离心机(可成仪器), 微孔板离心机(天根生化科技)。

1.2 方法

1.2.1 海参抗菌肽高通量筛选

利用NCBI Protein Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein), 从文献报道的海洋动物源抗菌肽(毒素除外)中(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)获得这些同源序列主要重叠区。利用CAMPR3(http://www.camp.bicnirrh.res.in/index.php)随机森林(RF)、向量机(SVM)、判别分析(DA)、人工神经网络(ANN)等算法, 对这些重叠序列的抗菌活性进行预测, 最终优选出具有较好抗菌活性的肽序列H1—H7。委托上海强耀生物科技有限公司固相合成, 并采用PEPTIDE 2.0 (http://peptide2.com/)、PepCalc.com(https://pepcalc.com/)工具, 对其理化特性(疏水性、酸碱性、净电荷等)进行分析。

1.2.2 抗菌活性评价

细菌于35℃恒温孵育20h后, 用CAMHB肉汤培养基配成菌悬液(OD600nm=0.50~0.64)。将菌悬液稀释50倍后, 取50µL加入96孔板中, 随后加入50µL肉汤培养基(空白对照)、环丙沙星(S. aureus、P. aeruginosa: 0.59µg·mL-1; V. vulnificus: 9.37µg·mL-1)和海参抗菌肽H1—H7(溶剂为肉汤培养基)(终浓度31.25、62.50、125、250、500、1000µg·mL-1), 于35℃恒温培育20h(S. aureus、P. aeruginosa)或37℃培育24h(V. vulnificus), 用酶标仪检测OD600nm。

1.2.3 抗菌机制研究

参考Shen等(2022)文献并修改, 研究海参抗菌肽对细胞膜通透性的影响。细菌(S. aureus、P. aeruginosa、V. vulnificus)于35℃培养20h, 用PBS缓冲液(0.01mol·L-1, pH7.2~7.4)制成菌悬液, 3500r·min-1离心5min, 弃上清, 用PBS重悬, 再离心, 重复3次, 最后用PBS缓冲液制成菌悬液(OD600nm =0.50~0.64)。黑色96孔板中, 依次加入10µL碘化丙碇(终浓度20µg·mL-1)、40µL细菌悬液、50µL海参抗菌肽H4(终浓度1000µg·mL-1)。以酶标仪检测(激发波长535nm, 发射波长614nm), 每1min记录一次。其中, 空白对照为PBS缓冲液, 阳性对照为0.50% TritonX-100。
参考Zhang等(2022)文献并修改, 研究海参抗菌肽对细胞膜电位去极化的影响。细菌(S. aureus、P. aeruginosa、V. vulnificus)于35℃培养20h, A缓冲液(5mmol·L-1 HEPEs, 20mmol·L-1葡萄糖)制成菌悬液, 3500r·min-1离心5min, 弃上清, 用A液重悬, 再离心, 反复3次, 最后用B缓冲液(5mmol·L-1 HEPEs, 20mmol·L-1葡萄糖, 100mmol·L-1 KCl)制成菌悬液(OD600nm=0.50~0.64)并稀释30倍。黑色96孔板中, 加入10µL的DiSC3(5)染色液(终浓度0.4µmol·L-1)、40µL的细菌悬液。在荧光值稳定后, 加入50µL海参抗菌肽H4(终浓度1000µg·mL-1)。以酶标仪检测(激发波长622nm, 发射波长670nm), 每70s记录一次。其中, 空白对照为缓冲液B, 阳性对照为0.50% TritonX-100。

1.2.4 细胞毒性评价

参考张婷婷等(2018)文献并修改, 对H4溶血性进行评价。抗凝兔血液中加1倍体积生理盐水, 1500r·min-1离心15min, 弃上清, 用生理盐水重悬, 再离心, 反复3次, 最后用生理盐水制成2%红细胞悬液。取100µL红细胞悬液加入96孔板中, 随后加入100µL海参抗菌肽H4(终浓度15.63、31.25、62.50、125、250、500、1000、2000µg·mL-1), 37℃孵育1h, 平板转子1000r·min-1离心, 取150µL上清于新的96孔板中, 酶标仪检测OD540nm。其中, 空白对照为生理盐水, 阳性对照为0.50% TritonX-100。
参考Ahmad等(2022)文献并修改, 对H4细胞毒性进行评价。L929细胞复苏稳定传代后, 以1.0×104 个·孔-1的密度接种于48孔板中, 37℃、5%CO2孵育24h, 空白培养基饥饿处理24h, 加入300μL海参抗菌肽H4(终浓度62.50、250、1000µg·mL-1), 培养24h。PBS缓冲液洗涤, 加入PI、Calcein AM染色剂, 染色10~15min, 吸弃染色剂, 更换PBS缓冲液后, 荧光显微镜拍照。其中, 空白对照为完全培养基。

1.2.5 细胞活性评价

参考Mi等(2018)文献并修改, 对H4细胞增殖活性进行评价。L929细胞复苏稳定传代后, 以5.0×103个·孔-1的密度接种于96孔板中, 37℃、5%CO2孵育24h后, 加入100μL海参抗菌肽H4(终浓度62.50、250、1000µg·mL-1), 培养24h, 光学显微镜拍照。吸弃孔内液体, 加入100µL CCK8工作液, 37℃、5%CO2孵育1h, 酶标仪检测OD450nm。其中, 空白对照为完全培养基。
参考Sakthiguru等(2021)文献并修改, 对H4细胞迁移活性进行评价。L929细胞复苏稳定传代后, 以3.0×104个·孔-1的密度接种于48孔板中, 37℃、5%CO2孵育24h, 空白培养基饥饿处理24h。用20µL移液枪头, 于孔板底部划出细胞划痕, PBS缓冲液洗涤漂浮细胞、碎片, 加入400μL海参抗菌肽H4(终浓度62.50、250、1000µg·mL-1), 在6、24、30、48h时, 光学显微镜拍照。

1.2.6 分子对接模拟H4与细胞膜表面受体相互作用

参考Shi等(2018)、Mateluna等(2022)文献并修改。根据海参抗菌肽H4序列, 采用Chem3D 20.0绘制其3D结构, 并进行能量最小化。利用Discovery Studio 2019 Client软件, 以细胞膜表面受体EGFR(PDB ID:1IVO), VEGFR2(PDB ID: 3V2A)、FGFR1(PDB ID:1EVT)为受体, H4为配体, 借助CDOCKER模块, 进行对接模拟。其中, EGFR位置为XYZ(124.40, 75.63, 51.31), 半径21.20Å; VEGFR2位置为XYZ(40.62, 7.62, 9.41), 半径20.00Å; FGFR1位置为XYZ(14.23, 35.77, 30.05), 半径20.00Å。

1.2.7 数据处理

使用IBM SPSS statistics 22对数据进行统计, 采用单因素方差分析ANOVA的假定方差齐性Bonferroni函数和Dunnett函数中的双侧检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 海参抗菌肽高通量筛选

通过对99篇文献报道的162条海洋动物抗菌肽(毒素除外)的比对和分析, 发现部分抗菌肽与海参胸腺素β4、泛素、组蛋白H1β、H2A、H3、H4、H5和核糖体L30蛋白序列同源。将这些同源的抗菌肽进行多序列比对, 从最大重叠区域中, 筛选和设计出27条肽序列, 并利用CAMPR3工具中的4种算法(RF、SVM、DA、ANN), 分别对其抗菌活性进行预测(表1)。其中大部分肽序列抗菌性能预测良好。
表1 肽序列抗菌活性预测

Tab. 1 Prediction of peptide sequences for bacteriostatic activity

序号 序列 SVM RF ANN DA 蛋白来源
1 RVHRFLRR 1.00 0.61 AMP 0.89 组蛋白H2A
2 KKPSKKPATKKAAKKKPAAKPKKAVKPKKPAAKKPAKKTSPKKKTAKKPAKKA 1.00 0.68 AMP 0.99 组蛋白H1β
3 PGKKTPQKKKPAAKKTKKPV 1.00 0.67 AMP 0.99 组蛋白H5
4 AKKPVRRLLQRRRRLRRRER 1.00 0.67 AMP 0.98 组蛋白H5
5 KPKKAVKPKKP 1.00 0.62 AMP 0.97 组蛋白H1β
6 KKAAKKKPAAKPKKAVKPKKP 1.00 0.69 AMP 1.00 组蛋白H1β
7 KKAAKKKPAAKPKKAVKPKKPAAKKPAKK 1.00 0.71 AMP 1.00 组蛋白H1β
8 KPAIRRLARR 1.00 0.62 AMP 0.77 组蛋白H4
9 RSARAGLQFPVGRVHRFLRR 0.99 0.81 AMP 0.98 组蛋白H2A
10 RGKGGKAWAKAKSRSARAGLQFPVGRVHRFLRR 0.99 0.92 AMP 1.00 组蛋白H2A
11 KKAAKKK 0.98 0.57 AMP 0.53 组蛋白H1β
12 FLGIKQTLKSLRQGKAKLII 0.98 1.00 AMP 1.00 核糖体L30
13 KAWAKAKSRSARAGLQFPVGRVHRFLRR 0.96 0.97 AMP 1.00 组蛋白H2A
14 KKKPVAAKKPVRRLLQRRRR 0.95 0.71 AMP 1.00 组蛋白H5
15 ILRLAVGLKGLPSVNPAWLV 0.93 0.97 AMP 0.99 组蛋白H3
16 ANFITHPYKRILRLAVGLKG 0.92 0.98 AMP 0.99 组蛋白H3
17 IKVELKRLAANNVLVHTKGT 0.90 0.86 AMP 0.84 组蛋白H5
18 IFVKTLTGKT 0.81 0.40 AMP 0.82 海参泛素
19 KYFLGIKQTLKSLRQGKAKLIIL 0.81 0.95 AMP 0.99 核糖体L30
20 RGKGGKAWAKAK 0.74 0.47 AMP 0.41 组蛋白H2A
21 MQIFVKTLTGKTITL 0.38 0.23 NAMP 0.25 海参泛素
22 MTGRGKGGKAWAKAKSRSARAGLQFPVGRVHRFLRRGNY 0.36 0.51 AMP 0.92 组蛋白H2A
23 FDKGKLKTVETQEKNTLPTKDTIDQEK 0.21 0.11 NAMP 0.03 胸腺素
24 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKSKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLR 0.21 0.26 NAMP 0.04 海参泛素
25 MSDKPDVSEVTK 0.06 0.07 NAMP 0.01 胸腺素
26 MSDKPDVSEVTKFDKGKLKTVETQEKNTLPTKDTIDQEKAAS 0.02 0.04 NAMP 0.00 胸腺素
27 STLHLVLRLR 0.00 0.33 NAMP 0.15 海参泛素

注: AMP表示抗菌肽, NAMP表示非抗菌肽; SVM>0.50即为AMP, RF>0.50即为AMP, DA>0.50即为AMP。表中加粗字体表示挑选出的7条抗菌肽序列

从中挑选出7条抗菌肽(H1—H7, 预测抗菌活性好, 与文献已发表的海洋抗菌肽多序列比对的共同重叠区域多, 序列长度<30个氨基酸)固相合成, 通过Peptide 2.0分析(表2), 发现这7条抗菌肽在pH7时均带正电荷(净电荷数量为4.10~11.10C), 且呈两亲性(疏水性>28.00%, 最高达47.62%)和碱性(pI> 11.00)。Chem3D模拟发现, 这些抗菌肽呈α-螺旋结构。
表2 H1—H7理化性质分析

Tab. 2 Analysis of the physical and chemical properties of H1~H7

抗菌肽 肽序列 疏水性/% 净电荷/C pI 分子量/Da
H1 RGKGGKAWAKAK 33.30 +5.00 11.83 1257.51
H2 RSARAGLQFPVGRVHRFLRR 45.00 +11.10 13.18 2379.81
H3 KAWAKAKSRSARAGLQFPVGRVHRFLRR 46.43 +9.10 13.19 3250.86
H4 RVHRFLRR 37.50 +4.10 12.96 1139.38
H5 KPKKAVKPKKP 45.45 +6.00 11.21 1248.63
H6 KKAAKKK 28.57 +5.00 11.11 801.05
H7 KKAAKKKPAAKPKKAVKPKKP 47.62 +11.00 11.51 2270.93

2.2 抗菌活性评价

通过体外抗菌实验(图1), 研究发现H1无抗菌活性。H2对P. aeruginosa有一定的抗菌活性, 在62.50µg·mL-1时可使细菌数降至93.92%±1.58% (p<0.01)。H3对S. aureus、V. vulnificus的抗菌活性较好, 在31.25µg·mL-1时即可使S. aureus细菌数显著降至70.00%±4.77%(p<0.01), V. vulnificus细菌数降至57.90%±1.48%(p<0.01), P. aeruginosa细菌数降至94.48%±0.92%(p<0.01)。H4可显著抑制S. aureus、V. vulnificus、P. aeruginosa生长, 在31.25µg·mL-1时可使S. aureus细菌数降至84.93%±4.21%(p<0.01), V. vulnificus细菌数降至77.14%±1.37%(p<0.01), P. aeruginosa细菌数降至95.92%±0.52%(p<0.01)。H5、H6不仅无抗菌活性, 还可促进P. aeruginosa、V. vulnificus生长。H7可在一定程度上抑制S. aureus生长, 在31.25µg·mL-1时可使其细菌数降至87.38%±4.24%(p<0.01); 然而却可促进P. aeruginosa、V. vulnificus生长。综上所述, 7条肽中H4抗菌活性较好, 后续将继续研究其抗菌机理、生物相容性和生物活性。
图1 H1—H7对S. aureus、P. aeruginosa、V. vulnificus细菌总数的影响

与空白对照组比较, *表示p<0.05, **表示p<0.01

Fig. 1 Effect of H1~H7 on total bacterial counts of S. aureus, P. aeruginosa, V. vulnificus. Compared with control group, * stands for p<0.05, and ** stands for p<0.01

2.3 抗菌机制研究

通过膜渗透实验发现(图2a—2c), H4可显著增加P. aeruginosa膜的通透性, 使进入细胞膜PI荧光信号迅速升高(与空白对照组相比, p<0.01), 在30 min时趋于平缓(与Triton组相比, 无显著差异)。然而, H4对S. aureus、V. vulnificus细胞膜的通透性无明显影响。
图2 H4对细胞膜的通透性(a—c)和电位去极化(d—f)的影响

Fig. 2 Effect of H4 on cell membrane permeability (a~c) and depolarization of cell membrane potential (d~f)

DiSC3(5)进入细胞膜后因聚集而发生荧光猝灭, 膜电位降低时则会重新释放到基质中使荧光强度增加, 利用该特性可测定膜电位的变化。通过膜去极化实验发现(图2d—2f), H4可使S. aureus、P. aeruginosa、V. vulnificus细胞膜内的荧光信号迅速升高(与空白对照组相比, p<0.01), 而后趋于稳定, 说明H4具有显著的促进膜电位去极化的作用。

2.4 细胞毒性评价

通过Calcein-AM/PI染色实验发现(图3a、3b、3c), H4在浓度62.5µg·mL-1时, 可使L929活细胞数量略微增加, 而降低死细胞数量; 在浓度250µg·mL-1时, 可使活细胞数量进一步增加, 而死细胞数量略微降低; 在浓度1000µg·mL-1时, 处理组活细胞数量轻微减少(与空白对照组相比, 无显著差异), 而死细胞数量变化不大。由此可见, 在给药剂量为0~1000µg·mL-1时, H4不会造成细胞凋亡或死亡, 即无任何毒性。
图3 H4与L929细胞共孵育24h后的荧光染色照片(a)、死细胞数量计数(b)和活细胞数量计数(c), 以及H4溶血性测定(d)

与空白对照组比较, *表示p<0.05, **表示p<0.01

Fig. 3 Photograph of live-dead cell staining (a), number of live cells (b), number of dead cells (c) and hemolytic properties of H4 (d). Compared with control group, * stands for p<0.05, and ** stands for p<0.01

通过溶血实验发现(图3d), H4在浓度<1000µg·mL-1时, 均不引起溶血; 而浓度过高则会引起一定程度的溶血(1000µg·mL-1时, 溶血率为6.91%±2.73%; 2000µg·mL-1时, 溶血率为43.26%± 0.89%)。由此可见, 当给药剂量<1000µg·mL-1时, H4均不引起溶血, 具有良好的生物相容性。

2.5 海参抗菌肽细胞活性评价

通过CCK8实验发现(图4), 在浓度为62.5、125、250、500、1000µg·mL-1时, H4对L929细胞活性无明显变化(与空白对照组相比, 无显著差异), 说明H4没有促进细胞增殖的作用。通过细胞划痕实验发现(图5), 浓度为62.5µg·mL-1和250µg·mL-1的H4有促进伤口愈合的作用, 相较于空白组有显著性差异。
图4 H4与L929细胞共孵育24h后光镜(100×)照片(a)和细胞存活率(b)

Fig. 4 Results of CCK8 assay for cell proliferation viability. Photographs under 100x light microscope after 24 h incubation (a) and cell viability (b)

图5 H4与L929细胞共孵育后光镜(100×)照片(a)和伤口愈合率(b)

与空白对照组比较, *表示p<0.05, **表示p<0.01

Fig. 5 Light microscopic (100×) photographs of H4 and L929 cells after co-incubation (a) and wound healing rate (b). Compared with control group, * stands for p<0.05, and ** stands for p<0.01

在6h时, 250µg·mL-1的H4组细胞迁移率为21.81%±1.07%, 高于空白对照组的18.04%±1.57% (p<0.05)。在24h时, 62.5µg·mL-1的H4组迁移率为75.56%±3.18%, 250µg·mL-1的H4组为76.06%±3.22%, 均高于空白对照组的63.86%±0.74%(p<0.01)。在30h时, 62.50µg·mL-1的H4组迁移率为90.13%±2.84% (p<0.01), 250µg·mL-1的H4组迁移率为86.15%±2.94% (p<0.05), 高于空白对照组的77.62%±1.92%。在48h时, 各组划痕都基本愈合。在浓度为1000µg·mL-1时, H4组在各时间段与空白对照组均没有显著性差异。

2.6 分子对接模拟H4与细胞膜表面受体的相互作用

利用生物信息学软件, 模拟H4与细胞膜表面受体的相互作用。研究发现, H4可与EGFR氨基酸残基ASN12、LYS13、GLN16、LEU17、GLY18、ASP22、GLU90形成氢键, 与THR15形成unfavorable donor-donor化学键, 其-CDOCKER ENERGY为114.051kcal·mol-1(图6a)。H4可与VEGFR2氨基酸残基GLY220、ASN253、GLY255、ASP276、LYS286、SER311形成氢键, -CDOCKER ENERGY为123.10kcal·mol-1(图6b)。H4可与FGFR1氨基酸残基ARG250、ASP282、PRO283、GLN284形成氢键, -CDOCKER ENERGY为101.12kcal·mol-1(图6c)。因此, H4可能通过与膜表面EGFR、VEGFR2、FGFR1相互作用而促进细胞迁移。

3 讨论

当海参受到病原体攻击时, 它们依靠其有效的细胞和体液先天免疫反应来识别和排除入侵的微生物并修复伤口, 这些免疫分子中包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶等(Zhuang et al, 2015), 其中抗菌肽发挥着重要的作用。海参还具有强烈的再生能力, 可进行吐脏、体壁、呼吸树、幼虫无性繁殖等再生方式(马健, 2010), 本文推测其体内含有一些抗菌、促修复效果显著的功能活性物。
基于此, 本文通过将已有文献报道的海洋动物源抗菌肽(毒素除外)与海参蛋白组进行比对, 结合生物信息学软件, 进行设计并高通量筛选海参抗菌肽。其中, H4来源于海参组蛋白H2A的N末端碱性氨基酸序列。目前, 已有多篇文献报道从不同物种中分离出H2A衍生抗菌肽, 如蟾蜍Buforins(Cho et al, 2009)、圆盘鲍鱼Abhisin(De Zoysa et al, 2009)、大西洋比目鱼Hipposin(Bustillo et al, 2014)等。组蛋白H2A是核小体重要组成部分, 参与遗传信息的调节(Osakabe et al, 2022), 通过特异性剪切其N末端产生新颖抗菌肽, 参与宿主免疫应答(李成华, 2007)。因此, 本文推测海参组蛋白H2A在完成调节遗传信息任务后, 可能发生了降解、特异性剪切, 产生N末端氨基酸序列, 进而参与海参免疫应答与创伤修复过程。
据文献报道, 影响抗菌肽活性的因素主要有净电荷、两亲性、疏水性和二级结构等。因大多数抗菌肽带正电荷, 其可与带负电荷的微生物膜相互结合(Ciumac et al, 2019)。此外, 疏水性、两亲性也是抗菌肽具备跨膜能力的重要因素。亲水端让肽与带负电荷的细菌表面、双层磷脂头基相互作用(Chen et al, 2002)。疏水端则插入膜脂质双层中, 引起细胞质渗透、膜去极化、膜裂解和细胞死亡(Ong et al, 2014)。α-螺旋结构对抗菌肽的抗菌活性也至关重要(Lima et al, 2021)。研究发现, 本文设计的H1—H7均带正电荷, 疏水性大于28%, 呈两亲性、ɑ-螺旋特征, CAMPR3上预测H4有显著抗菌活性。
图6 H4与EGFR(a) 、VEGFR2(b)、FGFR1(c)互作可视图(肽以黑色显现)

Fig. 6 H4 interacts with EGFR (a), VEGFR2 (b) and FGFR1 (c). Peptides are shown in black

抗菌肽的正电荷取决于其精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)数量(Tan et al, 2021), 电荷聚集于肽链N端对抗菌活性有利, 并可降低细胞毒性(朱宁艺, 2021)。Koo等(2008)的研究发现, 蛋白H2A衍生肽parasin I的N末端碱性残基对其与细胞膜相互结合是必不可少的。同时, 正电荷Arg可与两个脂质头基磷酸部分形成强双配位基H键, 从而促进更强的细胞膜破坏能力(Shao et al, 2018)。而抗菌肽H4(RVHRFLRR)由于富含Arg、His, 带有较高正电荷, 在N末端含有碱性残基Arg, 因而抗菌活性较好。
抗菌肽可通过破坏细胞质成分(如蛋白质、酶、RNA、DNA)或亚细胞区周围的膜结构(Ciumac et al, 2019), 进而实现膜透化, 破坏细菌膜结构。本文研究发现, H4可通过增加膜通透性和引起细菌膜电位去极化的方式实现抗菌目的, 而高浓度H4具溶血性与其ɑ-螺旋抗菌肽作用机理相吻合。
抗菌肽除抗菌活性外, 还可能具有促愈合、刺激血管通透性、增强吞噬细胞等活性(Hancock et al, 2000)。目前, 已发现多个抗菌肽具有促创伤修复功能, 例如人抗菌肽LL-37(Ramos et al, 2011)、人类β-防御素(Niyonsaba et al, 2007)、阳离子肽RBP-LRR(Taniguchi et al, 2019)等。抗菌肽可通过激活受体信号通路, 进而促进细胞增殖、迁移、伤口愈合与再上皮化(Thapa et al, 2020)。研究发现, H4可能通过与细胞膜表面受体EGFR、VEGFR2、FGFR1发生相互作用, 浓度为62.50µg·mL-1、250µg·mL-1的H4可显著促进L929细胞发生迁移。因H4具有膜去极化和增加膜通透性的特性, 高浓度时可能会影响L929细胞的增殖迁移效果, 从而导致其迁移率比低浓度的差。

4 结论

海参抗菌肽H4可通过增加细菌膜通透性或引起膜电位去极化等方式, 抑制S. aureus、P. aeruginosa、V. vulnificus生长。H4在浓度为31.250µg·mL-1时, 即可使S. aureus细菌总数降至84.93%±4.21%(p<0.01), P. aeruginosa细菌总数降至95.92%±0.52%(p<0.01), V. vulnificus细菌总数降至77.14%±1.37%(p<0.01)。除抗菌活性外, H4的生物相容性好, 在浓度<1000µg·mL-1时均没有溶血性或细胞毒性, 它可能通过与细胞膜表面受体(EGFR、VEGFR2、FGFR1等)发生相互作用, 进而促进细胞迁移。在浓度为62.50µg·mL-1和250µg·mL-1时, H4均可显著促进L929细胞发生迁移(p<0.05)。综上, 海参抗菌肽H4的生物相容性好, 兼有抗菌、促愈合功效, 可望作为一种潜在功能物质用于皮肤感染创面的修复与再生。然而, 海洋抗菌肽H4对动物皮肤感染创面修复的实际效果还未验证, 对细胞促迁移的详细机制也未阐明, 后续还需通过动物实验和细胞实验对其功效和机制开展更进一步的研究。

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