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热带海洋学报 >

2023 , Vol. 42 >Issue 6: 101 - 110

DOI: https://doi.org/10.11978/2022266

海洋生物学

南海热带岛礁生物土壤结皮中细菌的分离及其固砂特性初步研究

  • 黄谕 , 1, 2 ,
  • 王琳 1 ,
  • 麦志茂 1 ,
  • 李洁 1 ,
  • 张偲 , 1, 3
展开
  • 1.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室(中国科学院南海海洋研究所), 广东 广州 510301
  • 2.中国科学院大学, 北京 100049
  • 3.南方海洋科学与工程广东省实验室(广州), 广东 广州 511458
张偲。email:

黄谕(1997—), 女, 海南省文昌市人, 硕士研究生, 从事岛礁生物土壤结皮微生物生态学研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2022-12-29

  修回日期: 2023-02-27

  网络出版日期: 2023-03-06

基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(42206155)

广东省自然科学基金面上项目(2022A1515011889)

广州市科技局基础与应用基础研究项目(202201010499)

收起

Isolation and characterization of sand fixation ability of bacteria in biological soil crusts of the tropical islands, South China Sea

  • HUANG Yu , 1, 2 ,
  • WANG Lin 1 ,
  • MAI Zhimao 1 ,
  • LI Jie 1 ,
  • ZHANG Si , 1, 3
Expand
  • 1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China
ZHANG Si. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2022-12-29

  Revised date: 2023-02-27

  Online published: 2023-03-06

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42206155)

Natural Science Foundation of Guangdong Province, China(2022A1515011889)

Guangzhou Basic and Applied Basic Research Foundation(202201010499)

Fold

摘要

南海热带岛礁生物土壤结皮中有大量可分泌胞外多糖的微生物, 这一特性对固砂具有重要的促进作用。本研究利用TSA、改良TSA、MA三种培养基对采自南海永暑礁及三亚鹿回头海岸带的生物土壤结皮进行可培养细菌的分离纯化。本研究共分离纯化70株细菌, 并进行基于16S rRNA基因序列的鉴定, 发现所分离的菌株属于3门5纲12目19科25属, 厚壁菌门(Firmicutes)为优势门, 芽孢杆菌属(Bacillus)为优势属。此外, 有22株菌与已知物种16S rRNA基因相似性低于98.65%, 为潜在的新物种。纯化菌株的胞外多糖采用乙醇沉淀法提取、苯酚硫酸法检测含量, 发现19株菌胞外多糖含量高于0.013mg·mL-1。选取其中胞外多糖含量最高的9株菌进行土壤团聚能力的测定, 发现将菌株SCSIO 17111(Lysobacter sp.)菌液喷洒于珊瑚砂表面能够使土壤团聚体保持稳定。针对粒径小于0.2mm的细砂, 菌株SCSIO 17111固结的砂土在经过干筛处理后, 保留量可达92.7%。本研究可为岛礁珊瑚砂的固定、减少土壤流失提供高产胞外多糖菌株资源, 还可以为促进岛礁生物土壤结皮的形成提供新的研究思路和方法。

关键词： 南海岛礁; 可培养细菌多样性; 胞外多糖; 固砂

本文引用格式

黄谕 , 王琳 , 麦志茂 , 李洁 , 张偲 . 南海热带岛礁生物土壤结皮中细菌的分离及其固砂特性初步研究[J]. 热带海洋学报, 2023 , 42(6) : 101 -110 . DOI: 10.11978/2022266

Abstract

There are many microbial resources present in biological soil crusts of tropical reefs in the South China Sea, and the extracellular polysaccharides secreted by these microorganisms play an important role in promoting sand consolidation. In this study, three media, TSA, modified TSA and MA, were used to isolate and purify culturable bacteria from biological soil crusts in the Yongshu Reef and Luhuitou, Sanya, South China Sea. A total of 70 bacterial strains were isolated and purified in this study. And based on 16S rRNA gene identification, these isolated strains belonged to 3 phyla, 5 classes, 12 orders and 19 families, 25 genera. The dominant phylum was Firmicutes and the dominant genus was Bacillus. In addition, 22 strains had less than 98.65%16S rRNA gene similarities with known species, which were potential novel species. The extracellular polysaccharide content of purified strains was measured by ethanol precipitation method and phenol sulfate method, and the contents of 19 strains were more than 0.013 mg·mL-1. Finally, 9 strains with the highest extracellular polysaccharide content were selected to determine the soil agglomeration ability. The results showed that strain SCSIO 17111 (Lysobacter) was the only strain which was able to maintain the stability of the biological soil crust clods by spraying. Our study provides high extracellular polysaccharide-producing strain resources for island reef management.

Key words： South China Sea reefs; culturable bacterial diversity; extracellular polysaccharide; sand fixation

南海是海上丝绸之路的起点, 也是最重要的一环, 南沙群岛的海洋工程建设在资源、环保、科研等方面均具有重要的意义。近年来国家稳步推进南海珊瑚礁的建设与开发, 使用由珊瑚、贝壳及藻类等海洋生物的残骸经过一系列理化作用形成的珊瑚砂填筑珊瑚岛礁。碳酸盐沉积物是珊瑚砂的主要成分, 95%以上是碳酸钙(王新志, 2008; 钱琨 等, 2017), 国内外学者称之为钙质砂(任玉宾, 2016)。与大陆上的自然土壤不同, 岛礁土壤由珊瑚砂构成, 从环境和生物要素来看, 这些珊瑚岛礁被视为海洋中的“荒漠”, 缺少真正的土壤及淡水资源, 且具有高盐、强碱、高温、强光等极端环境特点, 不利于植被进行自然定殖(张偲 等, 2021)。因此, 如何有效防治水土流失与改善岛礁生态环境, 促成岛礁的可持续自我发育, 是实现“荒漠”岛礁向生态宜居岛礁健康发展的关键, 同时也是我国南海资源开发亟待解决的问题之一。
物理固砂、化学固砂和植树造林一直都被认为是改善岛礁生态环境的主要方式。但近年来, 同为极端环境的荒漠生态系统中备受重视的生物土壤结皮(biological soil crusts), 为改变岛礁“荒漠”状态带来了极大的启发。由微生物、藻类、苔藓、地衣等生物与土壤共同形成的复合生物土壤结皮具有耐旱、耐盐碱、固碳氮能力、繁殖能力强等特点(任玉宾, 2016), 可广泛生存繁衍于恶劣的环境中, 并通过其生理代谢作用影响周围的微环境(Godinho et al, 2009)。与荒漠系统相似, 岛礁生物土壤结皮同样是岛礁生态系统的重要组成部分, 约占岛礁陆域面积的1.8%~4.3%(王琳, 2020)。已有研究表明, 微生物本身的参与及其分泌的多糖类物质对生物土壤结皮的形成有着积极的作用(Godinho et al, 2009)。在生物土壤结皮形成的早期, 微生物代谢过程中分泌的大量胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)能够胶结土壤颗粒, 使土壤形成团聚体, 减少侵蚀, 提高其稳定性, 有助于营养物质的留存(Chen et al, 2014; 张偲 等, 2018; Meng et al, 2019)。
鉴于南海热带珊瑚岛礁地理位置和环境特点都较为特殊, 利用从南沙永暑礁和三亚鹿回头附近采集的生物土壤结皮样品分离筛选EPS产量高的菌株, 并将菌液喷洒在珊瑚砂表面, 探讨其固砂作用。从热带珊瑚岛礁生境分离的菌株易适应高温、高盐、高辐射等岛礁极端环境, 可直接应用于后续岛礁珊瑚砂固定的研究, 同时也为促进岛礁生物土壤结皮的形成提供新的研究思路和方法。

1 材料与方法

1.1 采样区概况

南沙群岛位于南海, 接近赤道, 所处纬度较低, 即3°35′—11°55′N, 109°30′—117°50′E, 属于赤道气候和热带季风气候, 主要气候特征是日照时间长、终年高温、辐射强、风大、雾少、湿度大、雨量充沛。年平均气温为27℃~28℃, 年平均降水量为1500~2000mm(南沙海域环境质量研究专题组, 1996), 岛礁基质为珊瑚钙质砂(王琳, 2020)。
三亚位于海南岛的最南端, 介于18°09′—18°37′N, 108°56′—109°48′E之间。三亚属于热带海洋性季风气候, 年平均气温25.7℃, 气温最高月为6月, 平均28.7℃; 气温最低月为1月, 平均21.4℃, 年平均降水量1347.5mm; 鹿回头湾属于砂砾质海滩(毛龙江 等, 2006)。

1.2 样品的采集

生物土壤结皮及底层土样品均采集自南海热带岛礁, 一部分样品于2016年9月采集于三亚市鹿回头海岸带; 另一部分于2016年11月采集于南沙群岛永暑礁。使用无菌采样铲采集生物土壤结皮样品及其下方1~3cm底层土, 分别迅速装入无菌的采样袋中, 4ºC保存。

1.3 菌种分离和培养

1.3.1 培养基

Tryptose Soya Agar(胰蛋白大豆琼脂)培养基: 胰蛋白胨15.0g·L-1, 大豆蛋白胨5.0g·L-1, 氯化钠5.0g·L-1, 琼脂15.0g·L-1, 蒸馏水1000mL, pH 7.3±0.2。
改良Tryptose Soya Agar(胰蛋白大豆琼脂)培养基: 胰蛋白胨17.0g·L-1, 大豆蛋白胨3.0g·L-1, 葡萄糖2.5g·L-1, 氯化钠5.0g·L-1, 磷酸氢二钾 2.5g·L-1, 琼脂15.0g·L-1, 蒸馏水1000mL, pH 7.3±0.2。
Marine Agar(海生菌琼脂)培养基: 蛋白胨5.0g·L-1, 酵母膏1.0g·L-1, 柠檬酸铁0.1g·L-1, 溴化钾0.08g·L-1, 氯化钠19.45g·L-1, 氯化镁8.8g·L-1, 硫酸钠3.24g·L-1, 氯化钙1.8g·L-1, 氯化钾0.55g·L-1, 碳酸氢钠0.16g·L-1, 硝酸铵0.0016g·L-1, 磷酸氢二钠0.008g·L-1, 氯化锶0.034g·L-1, 硼酸0.022g·L-1, 硅酸钠0.004g·L-1, 氟化钠0.0024g·L-1, 琼脂15.0g·L-1, 蒸馏水1000mL, pH 7.6±0.2。

1.3.2 菌种的分离、纯化和保藏

称取永暑礁样品(生物土壤结皮层和结皮底层土)以及三亚鹿回头海岸带生物土壤结皮样品各2.0g, 分别进行充分研磨, 每份样品加入18mL无菌水, 振荡后取悬浊液进行梯度稀释, 取200μL稀释倍数为1000倍的生物土壤结皮及底层土样品悬浊液涂布于1.3.1所述三种培养基平板上, 在30℃条件下倒置培养。挑取不同形态的单菌落, 在上述三种培养基平板上划线纯化, 纯化后的菌株用30%(w/v)甘油保存, 放入-80℃冰箱。

1.3.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

细菌DNA提取使用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金)试剂盒。16S rRNA基因的PCR扩增引物采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。反应条件: 95℃预变性5min; 95℃ 30s, 54℃ 45s, 72℃ 90s, 32个循环; 72℃终延伸10min。PCR产物经Sanger法测序后所获得16S rRNA基因序列通过EZBioCloud网站进行在线比对, 确定分离菌株的近缘物种。

1.3.4 菌株的系统发育分析

根据16S rRNA基因序列比对结果, 以分离菌株相似度最高的菌株16S rRNA基因序列作为参照, 使用MEGA-X软件中的Clustal W方法进行多序列比对(Kumar et al, 2018), 比对后结果进行建树模型预测, 预测最佳模型为Tamura-Nei(TN93), 采用邻接法(neighbor-joining)进行聚类分析(Saitou et al, 1987), 构建系统发育树, 自展值为1000次, 并使用iTOL网站进行系统发育树的美化(Letunic et al, 2019)。

1.3.5 胞外多糖的提取与测定

将分离获得的菌株接种于TSB培养基中, 30℃进行振荡(180r·min-1)培养45h后, 采用乙醇沉淀法提取胞外多糖(Rimada et al, 2003), 采用硫酸-苯酚法测定多糖含量(Dubois et al, 1956; 董群 等, 1996)。具体操作如下。
乙醇沉淀法提取发酵液胞外多糖: 取一定体积培养液离心以去除菌体, 时间为20min, 离心力为11603g, 将离心后的上清液通过0.22µm的滤膜, 将上清液中残留的微生物细胞过滤除去。将培养液4倍体积的95%乙醇加入到已过膜的滤液中, 在4℃条件下过夜沉淀。将沉淀后的液体进行离心, 时间为20min, 离心力为2057g, 弃去上清液。剩下的沉淀物使用丙酮、无水乙醇依次洗涤, 洗涤后向沉淀物中加入体积分数为80%的三氯乙酸以去除蛋白质。弃去液体后将剩余沉淀物于60℃烘干, 获得胞外多糖样品并称重, 对胞外多糖含量进行粗测。
苯酚-硫酸法测定多糖含量: 准确称取10mg分析纯葡萄糖, 加入去离子水充分溶解后于250mL容量瓶中定容, 取溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于试管中, 各补水至1.0mL, 空白对照为1.0mL去离子水。先加入6%苯酚0.5mL, 再加入浓硫酸(分析纯, 95.5%)2.5mL, 混匀后静置10min, 在室温下放置20min, 利用酶标仪测量490nm波长下的吸光度值。进行标准曲线的绘制, 横坐标为葡萄糖质量, 纵坐标为吸光度。将制备的胞外多糖样品溶于去离子水制成样品溶液, 取0.8mL溶液按照上述测定方法测出吸光度, 根据标准曲线计算出多糖含量。

1.3.6 菌株固砂能力的测定

将采集于永暑礁的珊瑚砂依次过16目(1.25mm筛孔)和80目(0.20mm筛孔)筛具, 获得粒径大于0.20mm并小于1.25mm的珊瑚砂和粒径小于0.20mm的珊瑚砂, 每种规格珊瑚砂设置3个重复, 放置于玻璃培养皿中121℃灭菌25min, 于60℃烘干。用10μL接种环取两环实验菌接种到装有30mL TSB液体培养基的100mL三角瓶中, 培养24h, 取10mL培养液喷洒到装有已灭菌的珊瑚砂培养皿中, 空白对照喷洒等体积的TSB培养基, 放置恒温培养箱(30℃)内60d。沿着培养皿边缘切下整块土壤团聚体, 同时微微抖动培养皿, 取保持较为完整的三块土壤团聚体, 测量其厚度。
参考郑楠 等(2022)土壤团聚体干筛法测定土壤团聚体稳定性。具体方法为: 将培养后的土壤团聚体转移至孔径为1.25mm的筛子中, 轻轻地左右摇动筛子, 保持一致的动作频率, 直至筛子上的土壤团聚体不再透过筛子。然后收集土壤团聚体样品, 烘干称重。

2 实验结果

2.1 菌株分离与物种多样性

本研究共从样品中分离、鉴定、保藏70株细菌。鉴定比对结果表明, 这些菌株分别属于3门5纲12目19科25属, 亲缘关系与目前41个已知物种相近, 多样性水平较高。在门水平上, 28株(40%)属于厚壁菌门(Firmicutes), 23株(33%)属于放线菌门(Actinobacteria), 19株(27%)属于变形菌门(Proteobacteria)(图1); 在目水平上, 优势目为芽孢杆菌目(Bacillales, 28株, 40%)和微球菌目(Micrococcales, 17株, 24%)(图1); 在属水平上, 22株(31%)属于芽孢杆菌属(Bacillus), 11株(16%)属于微杆菌属(Microbacterium)(图2)。图3展示了70个菌株与其最相似已知物种典型菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育树。此外, 有22株菌(表1)与已知物种的16S rRNA基因相似性低于98.65%(Kim et al, 2014), 将鉴定到的最近缘物种相同的菌株进行序列比对和排重, 共有17种潜在的新物种。
图1 分离获得的菌株在门、目水平的分布情况

Fig. 1 Taxonomy of isolates at the level of phylum and order

图2 分离获得的菌株在属水平的分布情况

Fig. 2 Taxonomy of isolates at the genus level

图3 采用邻接法基于16S rRNA基因序列构建的70个菌株系统发育树

Fig. 3 Phylogenetic tree of 70 strains constructed by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

表1 潜在新物种

Tab. 1 Potential novel species

菌株编号 最近缘物种 16S rRNA基因相似性/%
SCSIO 17100 Microbacterium arborescens 98.55
SCSIO 17105 Microbacterium arborescens 98.55
SCSIO 17035 Microbacterium saccharophilum 98.48
SCSIO 17034 Bacillus zhanjiangensis 98.36
SCSIO 17007 Microbacterium pumilum 98.33
SCSIO 17026 Bacillus zhanjiangensis 98.29
SCSIO 17060 Devosia lucknowensis 98.28
SCSIO 17011 Microbacterium saccharophilum 98.26
SCSIO 17054 Bacillus oryzaecorticis 98.24
SCSIO 17069 Bacillus oryzaecorticis 98.23
SCSIO 17076 Microbacterium invictum 98.18
SCSIO 17016 Bacillus zhanjiangensis 98.15
SCSIO 17014 Skermanella aerolata 97.98
SCSIO 17004 Aquipuribacter nitratireducens 97.47
SCSIO 17099 Bacillus cohnii 97.21
SCSIO 17017 Bacillus salitolerans 97.02
SCSIO 17048 Nocardioides zeicaulis 96.94
SCSIO 17036 Mesorhizobium huakuii 96.93
SCSIO 17031 Bacillus herbersteinensis 96.85
SCSIO 17027 Devosia lucknowensis 96.66
SCSIO 17010 Bacillus abyssalis 96.56
SCSIO 17040 Kineosporia rhamnosa 95.90

2.2 高产胞外多糖菌株的筛选

将分离获得的70株菌进行发酵培养, 并采用乙醇沉淀法提取菌株的胞外多糖, 烘干称重后对胞外多糖产量进行粗测。检测结果显示, 其中19株菌的粗测胞外多糖产量相对较高(表2), 这些菌株属于Bacillus、Nocardioides、Halobacillus、Mesorhizobium等12个属(图4); 主要分离自三亚采集的生物土壤结皮样品, 约占63%。
表2 菌株胞外多糖粗测产量

Tab. 2 Extracellular polysaccharide productions by wide test

菌株编号 产量/(mg·mL-1)
SCSIO 17048 6.4533
SCSIO 17023 6.4067
SCSIO 17046 6.2300
SCSIO 17003 6.1800
SCSIO 17036 6.0767
SCSIO 17037 6.0467
SCSIO 17054 6.0200
SCSIO 17111 5.9833
SCSIO 17100 5.9733
SCSIO 17096 5.9633
SCSIO 17049 5.8067
SCSIO 17060 5.6267
SCSIO 17061 5.6233
SCSIO 17019 5.5200
SCSIO 17051 5.4067
SCSIO 17076 5.4033
SCSIO 17099 5.1933
SCSIO 17097
SCSIO 17010		 5.0767
5.0267
图4 胞外多糖产量较高的菌株属分布情况

Fig. 4 Strains with high extracellular polysaccharide production at the genus level

选取胞外多糖粗测中多糖产量较高的19株菌, 用硫酸-苯酚法精测这些菌株的胞外多糖产量。检测结果表明这些菌株的胞外多糖产量均超过0.01mg.mL-1, 产量最高的是Lysobacter属菌株SCSIO 17111, 产量为0.0754mg.mL-1。产量最高的两株菌SCSIO 17111及SCSIO 17003均分离自永暑礁样品(表3)。
表3 菌株胞外多糖产量

Tab. 3 Extracellular polysaccharide productions

菌株编号 产量/(mg·mL-1) 菌株来源 菌株属
SCSIO 17111 0.0754 永暑礁结皮底层砂 Lysobacter
SCSIO 17003 0.0539 永暑礁结皮层 Bacillus
SCSIO 17096 0.0403 三亚结皮层 Agromyces
SCSIO 17051 0.0307 三亚结皮层 Bacillus
SCSIO 17100 0.0305 三亚结皮层 Microbacterium
SCSIO 17049 0.0252 三亚结皮层 Bacillus
SCSIO 17010 0.0213 永暑礁结皮层 Bacillus
SCSIO 17061 0.0209 三亚结皮层 Pseudoxanthomonas
SCSIO 17048 0.0186 三亚结皮层 Nocardioides
SCSIO 17060 0.0185 三亚结皮层 Devosia
SCSIO 17097 0.0182 三亚结皮层 Brachybacterium
SCSIO 17023 0.0180 永暑礁结皮底层砂 Bacillus
SCSIO 17046 0.0170 三亚结皮层 Halobacillus
SCSIO 17076 0.0168 永暑礁结皮层 Microbacterium
SCSIO 17099 0.0165 永暑礁结皮底层砂 Bacillus
SCSIO 17036 0.0161 三亚结皮层 Mesorhizobium
SCSIO 17037 0.0158 三亚结皮层 Ornithinimicrobium
SCSIO 17054 0.0151 三亚结皮层 Bacillus
SCSIO 17019 0.0137 永暑礁结皮底层砂 Pseudomonas

2.3 菌株固砂能力测定

基于胞外多糖产量分析结果, 选取产量最高的9株菌进行固砂能力的测定。在珊瑚砂表面喷洒上述9株菌的菌液, 在培养箱内放置60d, 测量形成的土壤团聚体的厚度。研究结果显示, 当珊瑚砂粒径为0.2~1.25mm时, 所形成的土壤团聚体厚度介于3~6mm之间, 最厚的为菌株SCSIO 17111形成的土壤团聚体(图5)。干筛过程发现多数菌株形成的土壤团聚体结构较脆弱, 不稳定, 仅菌株SCSIO 17111形成的土壤团聚体能保持稳定, 即土壤团聚体的直径大于1.25mm(表4)。针对粒径小于0.2mm的细砂, 菌株SCSIO 17111固结的砂土几乎覆盖整个培养皿表面, 平均厚度达2.5mm, 且在干筛后有13.56g保留在1.25mm孔径的筛面上, 保留量为92.7%。空白对照喷洒的等体积TSB培养基无固砂效果, 呈松散结构。
图5 SCSIO 17111菌株在粒径0.2~1.25mm(a、b)和<0.2mm (c、d)的珊瑚砂里的固砂实验效果

Fig. 5 Sand fixation of strain SCSIO 17111 in fraction 0.2-1.25 mm (a, b) and < 0.2 mm (c, d) sand experimental

表4 菌株固砂能力

Tab. 4 Sand fixation capacity of strains

菌株编号 土壤团聚体厚度/mm 干筛结果/g
(粒径>1.25mm)		 菌株来源 菌株属
SCSIO 17111 6.00±0.13 13.56 永暑礁结皮底层砂 Lysobacter
SCSIO 17023 3.89±0.14 0 永暑礁结皮底层砂 Bacillus
SCSIO 17096 4.44±0.14 0 三亚结皮层 Agromyces
SCSIO 17049 3.67±0.07 0 三亚结皮层 Bacillus
SCSIO 17051 3.78±0.10 0 三亚结皮层 Bacillus
SCSIO 17003 3.33±0.13 0 永暑礁结皮层 Bacillus
SCSIO 17061 3.78±0.07 0 三亚结皮层 Pseudoxanthomonas
SCSIO 17100 2.00±0.19 0 三亚结皮层 Microbacterium
SCSIO 17010 2.11±0.20 0 永暑礁结皮层 Bacillus

3 讨论

3.1 生物土壤结皮中的可培养微生物多样性分析

微生物是生物土壤结皮中的重要成员, 生物土壤结皮微生物类群组成在草原、沙漠等生境中已有研究, 但多为基于非培养方式, 直接提取生物土壤结皮的总DNA进行测序和分析, 分析得出的优势类群也不尽相同(Blay et al, 2017; Schulz et al, 2016; Zhang et al, 2016)。对生物土壤结皮可培养微生物类群的研究较少, 仅如da Rocha等(2015)通过不同的预处理和分离方法, 从美国大峡谷国家公园附近的绿色小山遗址所采集的生物土壤结皮样品中分离获得402株细菌和一株真菌, 分离的类群包括放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门以及变形菌门。以上研究表明, 在生物土壤结皮中, 微生物是重要的组成部分, 且微生物多样性较高, 蕴藏着非常丰富的资源。在不同地区、生境采集的生物土壤结皮样品, 微生物类别存在明显差异。本实验结果显示, 生物土壤结皮中可培养的微生物主要属于厚壁菌门、放线菌门和变形菌门三个门, 与先前其他研究中的结果存在一定的相似性, 在不同环境类型的生物土壤结皮中, 微生物在门水平上的组成具有一定的相似性。

3.2 胞外多糖产量和固砂效果的关系

生物土壤结皮中的微生物是生物土壤结皮形成过程中的重要参与者, 具有系列的生态学作用(吴楠 等, 2004), 如在土壤生态过程、土壤水文过程、地球化学循环过程中发挥功能。一些在生物土壤结皮微生物群落里发现的细菌可产生多糖, 可使土壤颗粒黏结在一起, 增强土壤稳定性从而减少风蚀的危害及营养物质的丢失(Barger et al, 2006; Kuske et al, 2012)。从整体结构来说, 胞外多糖以颗粒、黏液等形态存在于生物土壤结皮中, 这些沙粒与初级结皮中的丝状蓝藻结合, 提高了土壤的稳定性(Yang et al, 2022)。胞外多糖也通过黏结的方式为营养物质的积累提供良好的微环境, 其中滞留的物质例如胞外酶可以促进胞外消化系统的形成, 该系统可以利用化合物作为营养和能量的来源(Flemming et al, 2010)。从分子结构来说, 胞外多糖结构上不同的官能团有不同的结合位点, 为土壤团聚体的形成提供了更强的黏性(Flemming et al, 2010)。因此, 高产胞外多糖微生物如何应用于土壤结构和营养改良正日益受到研究人员的关注(余劲聪, 2016)。艾雪(2015)从沙漠土壤结皮中分离并筛选出19株耐盐碱细菌, 并将其菌株发酵液喷洒于实验沙质中, 结果表明土壤结皮厚度、土壤团聚体稳定性与胞外多糖产量显著相关。Sandhya等(2015)研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida GAP-P45)的胞外多糖显著影响土壤团聚体形成及稳定。此外, 谢作明 等(2006)将从生物结皮中分离获得的爪哇伪枝藻、具鞘微鞘藻和纤细席藻接种于流动沙丘, 这些微生物可以分泌大量的胞外多糖, 经过一定时间的生长发育之后, 流动沙丘开始向半固定沙丘转变, 证明了这些微生物有固定流动沙的能力。本研究从南海岛礁分离获得的9株高胞外多糖产量的细菌均能形成一定厚度的土壤团聚体, 有一定的固砂效果, 但除菌株SCSIO 17111外, 其他高胞外多糖产量的菌株所形成的土壤团聚体结构强度较差, 易在外力作用下被破坏, 无法形成稳定的结构。在本研究中, 菌株SCSIO 17111与其他产胞外多糖菌株的多糖含量有显著差异(P<0.05), 固砂效果较其他菌株明显提高。本实验未考虑风、雨等自然因素的干扰, 后续可以就微生物潜在固砂在自然环境中的应用做进一步研究。

3.3 胞外多糖产量和微生物物种及采样地的关系

目前, 有许多与分离高产胞外多糖菌株相关的研究, 这些菌株的分离样本来源有一定的差别, 且分离到的高产菌株也属于不同的物种。如张文平等(2017)从土壤中筛选到一株产胞外多糖较高的芽孢杆菌DT-10, 并将其应用于土壤中, 结果显示该菌株产生的胞外多糖可以明显促进土壤团聚体形成。艾雪等(2015)筛选了19株来自柴达木沙漠结皮的耐盐碱细菌, 发现这些细菌均能使沙子凝结成团块状, 其中菌株AX10(Salinicoccus hispanicus)胞外多糖含量最高, 属于盐球菌属。从本研究的微生物分类结果来看, 在属水平上, 本实验中分离得到的70株菌中, Bacillus属是优势类群, 占分离菌株总数的31%。在粗测胞外多糖较高的19株菌中, Bacillus属同样是优势类群, 占19株高胞外多糖产量菌株总数的38%。这两个结果说明在岛礁生物土壤结皮中, 高胞外多糖产量的Bacillus属可能是维持促进该地区生物土壤结皮生长的主要类群。此外, 菌株SCSIO 17111是本研究中胞外多糖产量最高、固砂能力最强的菌株, 属于Lysobacter属, 该属菌株产胞外多糖也已有研究(Kim et al, 2022), 与本研究结果一致。从样本来源看, 胞外多糖产量高的两株菌均来自永暑礁, 这可能是由于永暑礁所处的砂质环境更为疏松, 更高胞外多糖产量的微生物更有利于土壤土壤团聚体的形成, 从而维持生物土壤结皮结构的稳定性, 提高生物土壤结皮适应岛礁极端环境的能力。
由于南海岛礁建设的需要, 岛礁上珊瑚砂的固定、减少土壤流失是目前亟待解决的环境问题。固砂有利于岛礁生物土壤结皮的形成, 从而有利于高等植物的定植, 但目前相关的研究仍然较少。因此, 构建高产胞外多糖细菌资源库并发掘其在固砂、促进岛礁生物土壤结皮形成方面的作用尤为重要, 可为岛礁生态系统的研究以及防止土壤流失技术的发展提供数据支持。

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