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热带海洋学报 >

2024 , Vol. 43 >Issue 6: 181 - 189

DOI: https://doi.org/10.11978/2023198

海洋生物学

广西红树林放线菌 Streptomyces olivaceuss 10127 次级代谢产物及降糖降脂活性研究

  • 肖阳 , 1 ,
  • 严静 1 ,
  • 杨淑玉 2 ,
  • 章唐桀 1 ,
  • 翁杰 1 ,
  • 李奇林 1 ,
  • 刘洪存 2 ,
  • 孟娟 3 ,
  • 杨立芳 , 1
展开
  • 1.广西民族大学化学化工学院, 林产化学与工程国家民委重点实验室, 广西林产化学与工程重点实验室, 广西林产化学与工程协同创新中心, 广西 南宁 530006
  • 2.广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西多糖材料与改性重点实验室, 广西 南宁 530008
  • 3.广西民族大学预科教育学院, 广西 南宁 530008
杨立芳。email:

肖阳(1999—), 女, 四川省德阳市人, 硕士研究生, 从事天然产物研究。email:

Editor: 林强

收稿日期: 2023-12-20

  修回日期: 2024-01-23

  网络出版日期: 2024-01-29

基金资助

国家自然科学基金资助项目(81960164)

广西科技重大项目(AB21196020)

2023年度广西少数民族预科教育基地科研项目(YJJDA202301)

收起

Study on the secondary metabolites and hypoglycemic and lipid lowering activities of actinomyces Streptomyces olivaceuss 10127 from the Guangxi mangrove sediments

  • XIAO Yang , 1 ,
  • YAN Jing 1 ,
  • YANG Shuyu 2 ,
  • ZHANG Tangjie 1 ,
  • WENG Jie 1 ,
  • LI Qilin 1 ,
  • LIU Hongcun 2 ,
  • MENG Juan 3 ,
  • YANG Lifang , 1
Expand
  • 1. Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, State Ethnic Affairs Commission, Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Minzu University, Nanning 530006, China
  • 2. Guangxi Key Laboratory of Polysaccharide Materials and Modification, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi Minzu University, Nanning 530008, China
  • 3. College of Preparatory Education, Guangxi Minzu University, Nanning 530008, China
YANG Lifang. email:

Editor: LIN Qiang

Received date: 2023-12-20

  Revised date: 2024-01-23

  Online published: 2024-01-29

Supported by

National Natural Science Foundation of China(81960164)

Guangxi Major Science and Technology Project(AB21196020)

2023 Research Project of Guangxi Minority Preparatory Education Base(YJJDA202301)

Fold

摘要

红树林生态环境特殊, 具有丰富的放线菌资源, 是天然活性物质的来源之一。为获得更多具有良好生物活性的化合物, 对一株来源于广西茅尾海红树林老鼠簕(Acanthus ilicifolius)根际土壤的链霉菌属放线菌Streptomyces olivaceuss 10127的次级代谢产物以及降糖降脂活性进行研究。采用硅胶柱色谱、高效液相色谱和半制备液相色谱等技术, 对该菌株的次级代谢产物进行分离。通过PCR扩增和16S rRNA基因测序对菌株进行鉴定, 借助核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)、质谱(mass spectra, MS)以及旋光(optical rotatory dispersion, ORD)等波谱学方法和文献数据对单体化合物进行结构鉴定。通过试剂盒测定化合物的降糖降脂活性。从Streptomyces olivaceuss 10127的次级代谢产物中共分离得到12个单体化合物, 分别为: (6-(3-methylbut-2-enyl)-1-indol-3-yl)methanethiol(1)、methyl indole-3-acetate(2)、methyl 4-hydroxyphenylacetate(3)、2-hydroxybenzamide(4)、germicidin B(5)、germicidin A(6)、isogermicidin A(7)、4′-hydroxy-5, 7-dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-isoflavone(8)、2, 3-dihydroxybenzoic acid(9)、phenyl acetic acid(10)、germicidin N(11)、piloquinonea(12)。其中, 化合物8和12为首次从该放线菌中分离得到。首次测定了分离得到的化合物的降糖降脂活性。化合物1在降低脂质方面表现出较好的效果; 化合物7不仅具有降脂效果, 还具有降糖效果, 且效果均优于阳性药组。放线菌Streptomyces olivaceuss 10127具有生产降糖降脂活性先导化合物的潜在研究价值。

关键词： Streptomyces olivaceuss; 次级代谢产物; 降糖活性; 降脂活性

本文引用格式

肖阳 , 严静 , 杨淑玉 , 章唐桀 , 翁杰 , 李奇林 , 刘洪存 , 孟娟 , 杨立芳 . 广西红树林放线菌 Streptomyces olivaceuss 10127 次级代谢产物及降糖降脂活性研究[J]. 热带海洋学报, 2024 , 43(6) : 181 -189 . DOI: 10.11978/2023198

Abstract

Mangrove has a special ecological environment and abundant actinomycetes resources, which is one of the sources of natural active substances. To obtain compounds with potent biological activity, this study was conducted on the secondary metabolites and hypoglycemic and lipid lowering activities of an actinomyces, Streptomyces olivaceuss 10127. The strain was derived from the rhizosphere soil of mangrove Acanthus ilicifolius L. in Guangxi. The strains were identified by PCR amplification and 16S rRNA gene sequencing, and the secondary metabolites of this strain were isolated by silica gel column, high performance liquid chromatography (HPLC) and semi-preparative liquid chromatography. The structures of monomer compounds were identified using nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectra (MS) and optical rotatory dispersion (ORD). The hypoglycemic and lipid-lowering activity of the compound was tested by the kit. From the secondary metabolites of Streptomyces olivaceuss 10127, 12 compounds were isolated. These include (6-(3-methylbut-2-enyl)-H-indol-3-yl) methanethiol (1), methyl indole-3-acetate (2), methyl 4-hydroxyphenylacetate (3), 2-hydroxybenzamide (4), germicidin B (5), germicidin A (6), isogermicidin A (7), 4′-hydroxy-5, 7-dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-isoflavone (8), 2, 3-dihydroxybenzoic acid (9), phenyl acetic acid (10), germicidin N (11), piloquinonea (12). Compounds 8 and 12 were isolated from this actinomyces for the first time. The hypoglycemic and lipid-lowering activity of the isolated compounds were assayed for the first time. Compound 1 showed a good effect on lipid reduction. Compound 7 showed both the lipid lowering effect and the glucose lowering effect, surpassing the efficacy of the positive control group. The actinomyces Streptomyces olivaceuss 10127 has potential research value in producing lead compounds with hypoglycemic and lipid lowering activities.

Key words： Streptomyces olivaceuss; secondary metabolites; hypoglycemic activity; lipid-lowering activity

放线菌(Actinomycetes)是一类鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的革兰氏阳性需氧菌, 拥有1 000多个种和变种。放线菌的次级代谢产物在医药、农业和生态学等领域展现出卓越的潜力, 是一座天然产物的宝库, 已经从中分离得到一批活性优异的药物, 如链霉素、红霉素、卡那霉素、放线菌素D以及他克莫司等(孔璐琦 等, 2023)。近些年, 随着天然产物研究技术的不断发展, 发现放线菌能够通过不同的生物合成途径合成多种抗生素、抗肿瘤物质以及其他生物活性化合物(Sharifi et al, 2019)。这些生物活性物质不仅为人类提供了重要的药物来源, 同时也在调控微生物群落结构、促进植物生长等方面发挥着重要的生态功能。
红树林放线菌作为海洋放线菌研究方向之一, 因其生存环境的特殊性(低温、低氧、高盐、强辐射) (林鹏, 1997), 造就了其独特的代谢途径, 可以产生大环内脂类、生物碱类、倍半萜类、苯并吡喃、环戊烯酮等结构丰富、生物活性优良的次级代谢产物(许家慧, 2015)。近几十年的研究表明, 从红树林系统中分得的放线菌被认为是新的生物活性天然产物的巨大储存库(Han et al, 2016)。李俊杰 等(2023)评估了湛江雷州沿海地区红树林放线菌菌种资源的多样性和新颖性, 并讨论了其潜在的药用开发价值。Xu等(2014)认为红树林放线菌是大量具有新型结构的抗肿瘤、抗病毒或抗菌药物的潜在来源。例如, Yuan等(2013)从红树林链霉菌Streptomyces sp. 211726中分离得到7个新的阿扎霉素类化合物, 其生物活性包括广谱抗菌性和抗肿瘤细胞增殖活性。Hu等(2021)从一株产自澳门红树林的链霉菌S. olivaceus中首次发现了抗生素validamycin A, 这种抗生素在水稻纹枯病菌的防治上尤为重要(钱生辉, 2022)。随着陆地来源放线菌的深入研究, 分离出新颖化合物的机会越来越小(Fischbach et al, 2009)。因此, 红树林放线菌成为目前研究海洋微生物的一大热点, 具有更为广阔的开发前景。
代谢综合征(metabolic syndrome, MS)是一种以肥胖、高血压、高血糖、血脂异常等因素导致的严重危害身体健康的临床综合征(吴建杰, 2023)。随着我国经济发展和人口老龄化的加快, 糖脂代谢异常患病率明显增加。吴铁良(2010)论述了治疗糖脂代谢紊乱的一种手段是可以改善胰岛素抵抗, 比如用二甲双胍和噻唑烷二酮类等药物; 其次是纠正血脂代谢紊乱, 主要用到他汀类、贝特类或烟酸等药物。据文献报道, 美伐他汀是由日本生物学家远藤章从一株桔青霉中发现的(Endo et al, 1976), 国内生产洛伐他汀主要是利用红曲霉菌(李滔滔, 2013)。二甲双胍是由化学家Werner和Bell在1922年首次进行了合成(Annette et al, 2018)。还有一些降糖降脂药物是从植物中提取出来的, 如陈耀章 等(2014)论述了玉米须提取物的降血糖和降血脂作用, Kumar等(2011)研究了五桠果提取物的降血糖及降血脂作用。目前, 从放线菌中挖掘具有降糖降脂效果药物的研究较少, 因此本研究对所分得的化合物进行降糖降脂测试, 并发现了一个降糖降脂效果较好的化合物, 具有一定的创新性。
本研究对来自广西茅尾海红树林老鼠簕(Acanthus ilicifolius)根际土壤的链霉菌属放线菌Streptomyces olivaceuss 10127次级代谢产物进行分离与鉴定, 以期获得更多具有良好生物活性的化合物, 为开发利用海洋药物资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器: ZHJH-C1112B超净工作台(上海智诚公司)、ZXSD-B1160生化培养箱(上海智诚公司)、Agilent InfinityLab LC/MSD质谱仪(美国Agilent公司)、MQZ-632大容量落地式摇床(上海旻泉公司)、ME204T电子天平(上海梅特勒-托利多公司)、X-5显微熔点测定仪(巩义市予华公司)、SCL-10AVP半制备型高效液相色谱仪(日本岛津公司)、LC-10AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)、Brucker AVANCE 400MHz核磁共振仪(德国Brucker公司)、WZZ-2SS自动旋光仪(上海申光公司)、Nacalai tesque 5C18-MS-Ⅱ分析型色谱柱(4.6mm×250mm, 5µm, 日本YMC公司)、Nacalai tesque 5C18-MS-Ⅱ制备型色谱柱(10mm×250mm, 5µm, 日本YMC公司)。
主要试剂: 柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)、YMC Gel ODS-A反相色谱硅胶(日本YMC公司)、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(上海源叶公司); 分析纯级有机试剂: 甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等(成都市科隆化学品公司); 色谱级有机试剂: 甲醇、乙腈、异丙醇(诺尔施)。

1.2 菌株来源

菌株Streptomyces olivaceuss 10127样品于2019年采自广西茅尾海红树林老鼠簕根际土壤, 保藏于广西民族大学海洋与生物学院菌种库(菌种保藏号为: GX0000696)。

1.3 培养基

YIM 38#种子液培养基: 葡萄糖4g, 酵母粉4g, 麦芽糖2.5g, 复合维生素0.005g, 蒸馏水1L, pH 7.2。
312#发酵培养基: 葡萄糖10g, 蛋白胨5g, 甘油10g, 酵母粉2g, 可溶性淀粉2.5g, CaCO3 3g, 蒸馏水1L, pH 7.3。
LB肉汤: 胰蛋白胨10.0g, 酵母浸粉5g, 氯化钠10g, pH 7.0~7.2。

1.4 菌株发酵培养

用无菌竹签将保藏有菌株Streptomyces olivaceuss 10127的甘油管中的菌液接种到装有150mL的YIM 38#液体培养基中, 28℃, 180r·min-1摇床培养3d, 得到种子液。取50mL种子液加入到装有450mL 312#发酵培养基的锥形瓶(2L)中, 28℃, 180r·min-1摇床培养11d, 共得到207L发酵液。

1.5 化合物的提取分离

将发酵获得的粗提物, 用等体积乙酸乙酯萃取3次, 合并萃取液, 减压浓缩得到乙酸乙酯粗浸膏共69.09g。用90%甲醇-水/石油醚(1:1, V/V)对粗浸膏进行萃取, 减压浓缩分别得到47.17g的甲醇层萃取物和21.92g的石油醚层萃取物。甲醇层粗提物经正相硅胶色谱柱洗脱, 以石油醚、石油醚/乙酸乙酯(10/1、8/1、6/1、4/1、2/1、1/1、1/2, V/V)、乙酸乙酯和甲醇为洗脱剂, 共得到24个不同的馏分。经过薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)综合分析, 将具有相似成分的馏分进行合并, 最终得到Fr.1~Fr.10共10个馏分。其中, Fr.2(石油醚:乙酸乙酯=6:1, 1.1 g)经反相柱层析(ODS)(甲醇:水=60:40~100:0)梯度洗脱, 得到Fr.2.1~Fr.2.12共12个子馏分, Fr.2.4(25.9mg)经半制备型高效液相色谱(甲醇:水=67:33)分离纯化得到化合物1(λ=270nm, tR=23min, 20.3mg), Fr.2.7(27.1mg)通过半制备型高效液相色谱(甲醇:水=85:15)分离纯化(λ=230nm, tR=15min), 再经Sephadex LH-20凝胶柱层析(二氯甲烷:甲醇=1:1)进一步纯化得到化合物12(3.7mg)。Fr.3(石油醚:乙酸乙酯=6:1, 249.6mg)经半制备高效液相色谱(甲醇:水=70:30)纯化得到化合物2(λ=221nm, tR=7min, 10.3mg)。Fr.4(石油醚:乙酸乙酯=6:1, 183.8mg)经半制备型高效液相色谱(甲醇:水=45:55)制备得到化合物3(λ=274nm, tR=11min, 17.9mg)。Fr.5(石油醚:乙酸乙酯= 4:1、2:1, 4.24g)经反相ODS色谱柱(甲醇:水=20:80~100:0)梯度洗脱, 得到Fr.5.1~Fr.5.27共27个子馏分, 其中Fr.5.4(55.4mg)通过半制备型高效液相色谱(甲醇:水=30:70, V/V)进一步纯化得到化合物4(λ=221nm, tR=24min, 19.2mg)。经过TLC和HPLC综合分析, 合并Fr.5.10(274.4mg)和Fr.5.11(110.3mg), 使用半制备高效液相(甲醇:水= 55:45)分离纯化得到化合物5(λ=287nm, tR=12min, 29.4mg)。Fr.5.13(81.5mg)经过半制备型高效液相色谱(甲醇:水=45:55)分离得到化合物6(λ=287nm, tR=32 min, 34.5 mg)、化合物7(λ=287 nm, tR=36 min, 9.8 mg)。Fr.5.19(20.3mg)经过半制备型高效液相色谱(甲醇:水= 85:15)分离得到化合物8(λ=255 nm, tR=8.5min, 8.5mg)。Fr.6(石油醚:乙酸乙酯=2:1, 2.6g)经半制备型高效液相色谱(甲醇:水=40:60)制备得到化合物9(λ=243nm, tR=6min, 31.3mg)。Fr.9(石油醚:乙酸乙酯=1:1、1:2, 3.9g), 经反相ODS柱色谱(甲醇:水= 30:70~100:0)梯度洗脱, 得到Fr.9.1~Fr.9.21共21个子馏分, 其中Fr.9.4(464.2mg)通过半制备型高效液相色谱(乙腈:水=20:80)分离纯化得到化合物10(λ=233nm, tR=8.5min, 379.5mg)。Fr.9.7(62.6mg)通过半制备型高效液相色谱(甲醇:水=35:65)分离纯化得到化合物11(λ=272nm, tR=22.5min, 14.5mg)。

1.6 降糖降脂活性评价

1.6.1 降脂活性测定

测定12个化合物对油酸诱导的高脂HepG2细胞中甘油三酯(triglyceride, TG)的影响(伍卫红 等, 2023)。细胞分组如下: (1)正常组(样品): 细胞+10%DMEM完全培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium); (2)模型组(样品): 细胞+油酸(0.4mmol·L-1)+10%DMEM完全培养基; (3)阳性药组(样品): 洛伐他汀(25μmol·L-1)+细胞+油酸(0.4mmol·L-1)+10%DMEM完全培养基; (4)给药组(样品): 待测化合物(100µmol·L-1, 50µmol·L-1, 25µmol·L-1)+细胞+油酸(0.4 mmol·L-1)+10%DMEM完全培养基。采用商业试剂盒测试TG含量, 每组设置3个平行孔, 混匀试剂, 37℃孵育10min后, 酶标仪510nm波长下测定各孔吸光度值, 计算TG含量(T)和降脂率(L)。计算公式如下。
$T=\frac{{{A}_{1}}-{{A}_{0}}}{{{A}_{2}}-{{A}_{0}}}\text{ }\!\!\times\!\!\text{ }{{C}_{0}}$
式中, T为甘油三酯的含量; C0为标准品浓度(mmol·L-1), 试剂盒提供; A0为蒸馏水的吸光度值; A1为待测化合物的吸光度值; A2为标准品的吸光度值。
$L(\%)=\frac{{{T}_{1}}-{{T}_{2}}}{{{T}_{1}}}\times 100\%$
式中, L为降脂率的百分数大小(%); T1为模型组的TG含量; T2为给药组的TG含量。

1.6.2 降糖活性测定

测定12个化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(戴卫波 等, 2016)。实验分组为: (1)正常组(样品): 加入3%低糖完全培养基; (2)模型组(样品): 加入3%高糖完全培养基; (3)阳性药组(样品): 加入3%含60µmol·L-1二甲双胍的DMEM高糖完全培养基; (4)给药组(样品): 加入含终浓度为100µmol·L-1不同单体化合物的3%DMEM高糖完全培养基。每组设6个复孔, 按照商业试剂盒说明书, 使用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量, 波长505nm处测定吸光度值, 计算葡萄糖含量和各组细胞的葡萄糖消耗量。计算公式如下。
$G=\frac{{{A}_{1}}-{{A}_{0}}}{{{A}_{2}}-{{A}_{0}}}\text{ }\!\!\times\!\!\text{ }{{C}_{0}}$
式中, G为葡萄糖含量; C0为标准品浓度(mmol·L-1), 试剂盒提供; A0为蒸馏水的吸光度值; A1为待测化合物的吸光度值; A2为标准品的吸光度值。
$C=D-G$
式中, C为葡萄糖消耗量; D为DMEM完全培养基葡萄糖含量; G为葡萄糖含量。

2 结果与讨论

2.1 单体化合物结构鉴定

研究所分得的12个单体化合物, 如图1所示。
图1 化合物1—12的化学结构

Fig. 1 Chemical structures of compounds 1-12

化合物1: 棕褐色油状物, 分子式为C15H16N2, ESI-MS m/z: 247.3 [M+Na]+。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 8.12(brs, 1H, NH), 7.49(d, J=8.1Hz, 1H, H-4), 7.19(s, 1H, H-7), 7.14(m, 1H, H-2), 7.04(dd, J=8.2Hz, 1.44Hz, 1H, H-5), 3.46(d, J=7.3Hz, 2H, H-1′), 5.38(tm, J=7.5Hz, 1H, H-2′), 1.77(s, 6H, 3′-CH3), 3.81(s, 2H, H-1ʺ); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 137.1(C-6), 136.9( C-7a), 132.5(C-3′), 124.3(C-3a), 123.8(C-2′), 122.4(C-2), 121.5(C-5), 118.4(C-3), 118.0(C-4), 110.9(C-7), 104.7(C-2ʺ), 34.6(C-1′), 25.9(3′-CH3), 18.0(3′-CH3), 14.6(C-1ʺ)。以上数据与文献López等(2003)对照基本一致, 故鉴定其为(6-(3-methylbut-2-enyl)-1-indol-3-yl)methanethiol。
化合物2: 深褐色粉末, 分子式为C11H11NO2, ESI-MS m/z: 212.2 [M+Na]+。1H-NMR(400MHz, CDCl3) δH: 8.12(brs, 1H, NH), 7.62(d, J=7.9Hz, 1H, H-4), 7.36(d, J=8.1Hz, 1H, H-7), 7.12-7.23(overlap, 1H, H-2), 7.12~7.23(overlap, 1H, H-6), 7.12~7.23(overlap, 1H, H-5), 3.79(s, 2H, H-10), 3.71(s, 3H, 11-OCH3); 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δC: 172.7(C-11), 136.2(C-8), 127.4(C-9), 123.2(C-2), 122.4(C-6), 119.9(C-5), 119.0(C-4), 111.3(C-7), 108.6(C-3), 52.1(11-OCH3), 31.3(C-10)。以上数据与文献Kang等(2018)对照基本一致, 故鉴定其为methyl Indole-3-acetate。
化合物3: 棕黄色油状物, 分子式为C9H10O3, ESI-MS m/z: 189.2 [M+Na]+。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 7.07(d, J=8.4Hz, 2H, H-3, H-5), 6.72(d, J=8.6Hz, 2H, H-2, H-6), 3.65(s, 3H, H-10), 3.52(s, 2H, H-7); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 174.6(C-8), 157.5(C-1), 131.3(C-3, C-5), 126.3(C-4), 116.3(C-2, C-6), 52.4(C-10), 40.9(C-7)。以上数据与文献江蔚新 等(2017)对照基本一致, 故鉴定其为methyl 4－hydroxyphenylacetate。
化合物4: 无色片状固体, 分子式为C7H7NO2, ESI-MS m/z: 160.1 [M+Na]+, 熔点为132.3℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 7.76(d, J=7.9Hz, 1H, H-6), 7.38(m, J=7.7Hz, 1H, H-4), 6.88(m, 2H, H-3, H-5); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 174.0(C-7), 162.0(C-2), 135.2(C-4), 129.4(C-6), 120.0(C-3), 118.5(C-5), 116.1(C-1)。以上数据与文献Shaaban等(2017)对照基本一致, 故鉴定其为2-Hydroxybenzamide。
化合物5: 淡黄色针状晶体, 分子式为C10H14O3, ESI-MS m/z: 205.2 [M+Na]+, 熔点为140.7℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 5.89(s, 1H, H-4), 2.71(m, 1H, H-8), 2.39(q, J=7.6Hz, 2H, H-6), 1.22(d, J=6.9Hz, 6H, H-9, H-10), 1.03(t, J=7.3Hz, 3H, H-7); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 169.6(C-1), 168.6(C-3), 167.7(C-5), 105.2(C-2), 98.9( C-4), 33.6(C-8), 20.4(C-9), 17.2(C-6), 12.8(C-7)。以上数据与文献王永江 等(2018)对照基本一致, 故鉴定其为germicidin B。
化合物6: 橙黄色固体粉末, 分子式为C11H16O3, ESI-MS m/z: 219.1 [M+Na]+, [α]D20 + 57°(c=0.2, MeOH), 熔点为156.4℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 5.99(s, 1H, H-5), 2.47(m, 1H, H-7), 2.40(q, J=7.4Hz, 3H, H-11), 1.67, 1.55(m, 2H, H-8), 1.20(d, J=7.0Hz, 3H, H-10), 1.03(t, J=7.4Hz, 3H, H-12), 0.89(t, J=7.4Hz, 3H, H-9); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 168.7(C-6), 168.5(C-2), 167.6(C-4), 105.2(C-3), 100.3(C-5), 40.9(C-7), 28.5(C-8), 18.2(C-11), 17.2(C-10), 12.8(C-12), 11.9(C-9)。以上数据与文献Ma等(2017)对照基本一致, 故鉴定其为germicidin A。
化合物7: 淡黄色固体粉末, 分子式为C11H16O3, ESI-MS m/z: 219.1 [M+Na]+, 熔点为102.6℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 5.98(1H, s, H-5), 2.33(d, J=7.2Hz, 1H, H-7), 2.40(q, J=7.5Hz, 2H, H-11), 2.03(m, 1H, H-8), 0.96(d, J=6.7Hz, 3H, H-9), 0.96(d, J=6.7Hz, 3H, H-10), 1.03(t, J=7.4Hz, 3H, H-12); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 168.7(C-2), 167.5(C-4), 164.2(C-6), 105.2(C-3), 102.1(C-5), 43.4(C-7), 28.1(C-8), 22.5(C-9, C-10), 17.3(C-11), 12.8(C-12)。以上数据与文献Du等(2018)对照基本一致, 故鉴定其为isogermicidin A。
化合物8: 白色无定形粉末, 分子式为C22H22O5, ESI-MS m/z: 389.2 [M+Na]+, 熔点为107.5℃。1H-NMR(400MHz, CDCl3) δH: 7.80(s, 1H, H-2), 7.35(d, J=7.4Hz, 1H, H-2′), 7.35(d, J=7.4Hz, 1H, H-6′), 6.85(d, J=7.4Hz, 1H, H-3′), 6.85(d, J=7.4Hz, 1H, H-5′), 6.65(s, 1H, H-8), 5.16(t, J=7.0Hz, 1H, H-8′), 3.92(s, 3H, 7-OCH3), 3.86(s, 3H, 5-OCH3), 3.41(d, J=6.9Hz, 2H, H-7′), 1.79(s, 3H, H-11′), 1.67(s, 3H, H-10′); 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δC: 175.6(C-4), 162.4(C-7), 158.3(C-5), 158.1(C-8a), 156.2(C-4′), 150.7(C-2), 132.0(C-9′), 130.7(C-2′), 130.7(C-6′), 126.2(C-3), 124.2(C-1′), 122.6(C-8′), 122.6(C-6), 115.8(C-3′, C-5′), 113.1(C-4a), 95.3(C-8), 62.5(5-OCH3), 56.1(7-OCH3), 25.9(C-10′), 22.6(C-7′), 18.0(C-11′)。以上数据与文献Zhang等(2014)对照基本一致, 故鉴定其为4′-hydroxy-5, 7-dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-isoflavone。该化合物首次在该放线菌中分离得到。
化合物9: 黑色片状晶体, 分子式为C7H6O4, ESI-MS m/z: 155.1 [M+H]+, 熔点为133.6℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 6.95(d, J=8.1Hz, 1H, H-4), 6.71(t, J=8.2Hz, 1H, H-5), 7.24(d, J=8.1Hz, 3H, H-6); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 115.9(C-1), 150.9(C-2), 147.3(C-3), 120.0(C-4), 119.5(C-5), 119.4(C-6), 174.5(C-7)。以上数据与文献Ai等(2014)对照基本一致, 故鉴定其为2, 3-Dihydroxybenzoic acid。
化合物10: 透明片状晶体, 分子式为C8H8O2, ESI-MS m/z: 159.2 [M+Na]+, 熔点为148.1℃。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 7.21-7.31(m, 5H, H-4, H-8), 3.50(s, 2H, H-7); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 177.0(C-1), 136.9(C-3), 130.1(C-4, C-8), 129.6(C-5, C-7), 127.9(C-6), 43.4(C-2)。以上数据与文献Gutierrez-Lugo等(2005)对照基本一致, 故鉴定其为phenyl acetic acid。
化合物11: 黄色油状物, 分子式为C11H16O4, ESI-MS m/z: 235.1 [M+Na]+, [α]D20 + 32°(c=0.2, MeOH)。1H-NMR(400MHz, CD3OD) δH: 6.04(s, 1H, H-5), 3.93(m, 1H, H-8), 2.50(m, 1H, H-7), 2.40(q, J=7.5Hz, 7.38Hz, 2H, H-11), 1.25(d, J=7.1Hz, 3H, H-10), 1.15(d, J=6.4Hz, 3H, H-9), 1.03(t, J=7.4Hz, 3H, H-12); 13C-NMR(100MHz, CD3OD) δC: 168.6(C-2), 167.5(C-4), 166.6(C-6), 105.5(C-3), 101.6(C-5), 69.9(C-8), 46.8(C-7), 21.4(C-9), 17.3(C-11), 13.6(C-10), 12.8(C-12)。以上数据与文献Douchi等(2020)对照基本一致, 并综合该化合物的NOESY图谱, 鉴定其为germicidin N(7S, 8R)。
化合物12: 紫红色油状物, 分子式为C21H20O5, ESI-MS m/z: 352.1 [M+Na]+。1H-NMR(400MHz, CDCl3) δH: 12.83(s, 1H, H-1-OH), 12.36(s, 1H, H-8-OH), 7.62(t, J=8.1Hz, 1H, H-6), 7.48(d, J=7.7Hz, 1H, H-5), 7.40(s, 1H, H-4), 7.03(d, J=8.4Hz, 1H, H-7), 2.85(t, J=7.3Hz, 2H, H-2′), 2.27(s, 3H, H-2), 1.58~1.65(overlap, H-3′), 1.58~1.65(overlap, H-4′), 0.95(d, J=6.3Hz, 6H, H-5′); 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δC: 205.9(C-1′), 182.8(C-9), 182.4(C-10), 166.3(C-1), 165.2(C-8), 150.2(C-3), 139.6(C-6), 135.2(C-4b), 133.1(C-4a), 126.3(C-2), 119.7(C-7), 116.1(C-5), 115.5(C-10a), 115.0(C-8a), 113.2(C-4), 41.3(C-2′), 32.7(C-3′), 27.9(C-4′), 22.5(C-5′), 12.2(C-2)。以上数据与文献Jokela等(1997)对照基本一致, 故鉴定其为piloquinonea。该化合物首次在该放线菌中分离得到。

2.2 菌株鉴定

综合菌株生长形态和16S rRNA基因序列的对比结果显示, 与菌株10127关系最近的是Streptomyces olivaceuss, 其系统发育树如图2所示。
图2 菌株10127的系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree of strain 10127

2.3 降糖降脂活性测定结果

2.3.1 降脂活性测定结果

对化合物1—12进行降脂活性测定发现, 化合物1和7有一定降脂效果。化合物1和7对油酸诱导的高脂 HepG2细胞中TG的影响见表1, 降脂率(%)和EC50值见表2。
表1 化合物1和7的降TG作用

Tab. 1 TG-lowering activity of compounds 1 and 7

样品 TG含量/(mmol·L-1)
正常 模型 高 中 低
化合物1 0.06±0.01** 0.43±0.01## 0.13±0.01** 0.28±0.01** 0.40±0.01**
化合物7 0.04±0.00** 0.43±0.01## 0.21±0.01** 0.23±0.01** 0.26±0.01**
阳性药 0.05±0.02** 0.43±0.01## - - 0.26±0.01**

注: 与正常组相比, #P<0.05, ##P<0.01; 与模型组相比, *P<0.05, **P<0.01

表2 化合物1和7的降脂率和EC50值

Tab. 2 Lipid-lowering rate and EC50 value of compounds 1 and 7

样品 降脂率/% EC50±SD/(μmol·L-1)
高 中 低
化合物1 68.93±1.68 36.41±2.06 6.80±1.68 68.02±1.83
化合物7 49.50±1.71 46.53±1.71 39.60±2.97 90.22±15.27
阳性药 - - 39.53±2.32 46.88±2.23
从表1可以看出, 化合物组及模型组TG含量均极显著高于正常组, 表明造模成功。化合物1、7的高、中、低剂量组和阳性药组均可极显著降低TG含量, 说明化合物1和7可以下调油酸诱导的高脂 HepG2 细胞中TG水平, 从而能够有效调节血脂、缓解高脂血症症状。从表2可以看出, 通过计算降脂率和EC50值发现, 化合物1、7的降脂效果均较好。其中化合物1的高、中剂量组降脂率分别达到68.93%、36.41%, 均高于阳性药组, 且降脂效果呈现剂量依赖性, 随着剂量降低, 降脂率依次骤减。化合物7的高、中、低剂量组降脂率分别为49.50%、46.53%、39.60%, 降脂效果也均优于阳性药组, 其EC50值为90.22µmol·L-1。

2.3.2 降糖活性测定结果

对所有化合物进行降糖活性测定, 结果显示, 化合物7的降糖效果较好。化合物7对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响结果见表3。
表3 化合物7的降糖活性

Tab. 3 Glucose-lowering activity of compound 7

组别 葡萄糖消耗量/(mmol·L-1)
正常 1.34±0.15**
模型 1.87±0.09##
阳性 2.19±0.02**
化合物7 2.25±0.04**

注: 与正常组相比, #P<0.05, ##P<0.01; 与模型组相比, *P<0.05, **P<0.01。

表3结果显示, 与正常组相比, 模型组均极显著升高葡萄糖消耗量(P<0.01); 与模型组相比, 阳性药二甲双胍组使HepG2细胞对葡萄糖的摄取量极显著增加(P<0.01), 化合物7也极显著升高葡萄糖消耗量, 使葡萄糖消耗量达到2.25mmol·L-1, 效果优于阳性药组, 说明化合物7降糖效果较好。据文献报道, 化合物7在浓度为50ppm时能抑制莴苣根的生长(魏景, 2017); Zhang等(2020)从一株来源于泥蜂(Streptomyces sp.)中的链霉菌内分离得到化合物7, 并对其进行生物活性测试, 发现化合物7对己糖激酶II具有显著的抑制活性, IC50值为8.45µmol; 吴巧灵 等(2022)对化合物7进行抑菌活性测试发现, 该化合物对7种革兰氏阳性病原菌和7种革兰氏阴性菌均无抑制活性。目前, 对化合物7还未有降糖活性的报道, 本研究首次评价了该化合物的降糖活性, 发现其降糖效果优于阳性药, 为寻找降血糖药物提供了一种有效的途径, 丰富了降糖药物的候选文库。

3 结论

本研究从广西红树林来源海洋放线菌Streptomyces olivaceuss 10127的次级代谢产物中分离鉴定得到12个单体化合物。其中化合物1和2是吲哚类化合物, 化合物4是酰胺类化合物, 化合物5—7是聚酮类化合物, 化合物8是异黄酮类化合物, 化合物3、9、10为小分子酚酸类化合物, 化合物11为萜内酯类化合物, 化合物12为菲醌类化合物。化合物8和化合物12是首次从该放线菌中分离得到。
据文献报道, 化合物8对大部分微生物菌株均具有抑菌活性, 其中对牙龈念珠菌、白色念珠菌和陀螺假球菌的抑菌活性最好, 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为12.5µg·mL-1(Zhang et al, 2014); 化合物9在DPPH(2, 2-二苯-1-吡啶酰基)自由基清除试验中表现出较强的抗氧化活性(Sugiyama et al, 2009)。本研究首次通过降糖和降脂活性测定发现, 化合物1和化合物7的降脂效果较好。值得一提的是, 化合物7的降糖效果也较好, 且其降脂、降糖效果均优于阳性药组, 这为未来研发降糖降脂药物提供了新的候选药物。
目前, 本研究从Streptomyces olivaceuss 10127中只是分离到了12个化合物, 仍有多个馏分有待继续分离。同时我们也发现, 红树林海洋放线菌次级代谢产物极其丰富, 其活性也极其显著, 可为探索结构独特并具备较好药理活性的新型化合物提供启发。

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