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热带海洋学报 >

2024 , Vol. 43 >Issue 6: 80 - 91

DOI: https://doi.org/10.11978/2023186

海洋生物学

粤东上升流区不同水层可培养细菌多样性

  • 张敬 , 1, 2 ,
  • 凌娟 1 ,
  • 石松标 1, 3 ,
  • 韦章良 1 ,
  • 范利可 , 1, 2
展开
  • 1.中国科学院南海海洋研究所粤东上升流区海洋生态系统综合观测研究站, 广东 汕头 515041
  • 2.中国科学院南海海洋研究所海洋环境检测中心, 广东 广州 510301
  • 3.中国科学院大学, 北京 100049
范利可(1998—), 女, 生物学硕士。海洋微生物资源与生态学。e-mail:

张敬(1983—), 女, 工程师, 硕士。海洋环境微生物学。email:

Editor: 林强

收稿日期: 2023-12-05

  修回日期: 2024-03-29

  网络出版日期: 2024-04-03

基金资助

广东省科技计划项目(2021B1212050023)

广东省“珠江人才计划”本土创新科研团队项目(2019BT02Y262)

收起

Diversity of culturable bacteria in different water layers in the upwelling area of eastern Guangdong

  • ZHANG Jing , 1, 2 ,
  • LING Juan 1 ,
  • SHI Songbiao 1, 3 ,
  • WEI Zhangliang 1 ,
  • FAN Like , 1, 2
Expand
  • 1. Guangdong Provincial Observation and Research Station for Coastal Upwelling Ecosystem, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shantou 515041, China
  • 2. Testing Center of Marine Environment, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
FAN Like. email:

Editor: LIN Qiang

Received date: 2023-12-05

  Revised date: 2024-03-29

  Online published: 2024-04-03

Supported by

Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China(2021B1212050023)

Local Innovative and Research Teams Project of Guangdong Pearl River Talents Program(2019BT02Y262)

Fold

摘要

上升流通过增强扩散和独特的环境驱动着近海生态系统中的物质循环和能量流动, 直接影响环境中生物的生长、繁殖和分布, 蕴藏了大量尚未培养和难培养的微生物和新基因资源。本研究从粤东上升流区表层、中层和底层共采集27份海水样品, 探究细菌多样性和分布模式及其与深度的相关性。采用纯培养方法共分离获得1928株细菌, 通过16S rRNA基因序列分析, 结果显示这些细菌分布在5门、9纲、32目、54科、121属中的262种。其中, 变形菌门(Proteobacteria)为优势门, 占46.9%; 放线菌纲(Actinomycetia)为优势纲, 占44.8%; Microbacteriales为优势目级类群, 占21.2%。总体来说, 中层海水分离得到的菌株多样性明显低于表层和底层海水环境, 但三个层级环境分离获得的优势种群基本相同, 最优类群均为Microbacteriales目。从不同水层海水中分离得到的潜在新菌数排序为: 底层>表层>中层。从不同培养基分离得到的潜在新菌率排序为2216E培养基>R2A培养基>ISP2培养基>MSM培养基>IMK培养基。通过细菌多样性与环境因子的典范对应分析 (canonical correspondence analysis, CCA)表明, 能显著影响细菌多样性变化的环境因子是叶绿素含量(chlorophyll content, Chl)、活性硅酸盐(active silicate salts, ASS)、活性磷酸盐 (active phosphate, AP)、氨及部分氨基酸(ammonia, Amm)和生化需氧量(biochemical oxygen demand, BOD)。本研究系统调查了粤东上升流区可培养海洋细菌多样性及其分布情况, 其结果为近海上升流区不同水层可培养细菌多样性研究积累了关键的资料和数据, 也为近海典型上升流环境生物物种和基因资源的发掘和利用提供了重要参考。

关键词： 粤东上升流; 可培养细菌多样性; 不同分离培养基; 不同水层

本文引用格式

张敬 , 凌娟 , 石松标 , 韦章良 , 范利可 . 粤东上升流区不同水层可培养细菌多样性[J]. 热带海洋学报, 2024 , 43(6) : 80 -91 . DOI: 10.11978/2023186

Abstract

Upwelling promotes material cycling and energy flow in offshore ecosystems through enhanced diffusion and unique environmental drivers, which directly affects the growth, reproduction, and distribution of organisms in the environment. In this environment there are a large number of uncultivated or difficult to cultivate microorganisms and new gene resources, which need to be cultured and explored in deeply. In this study, 27 seawater samples were collected from the surface, middle and bottom layers of the upwelling area in eastern Guangdong to explore the diversity and distribution patterns of bacteria and their correlation with the depth. A total of 1928 bacterial strains were isolated by pure culture method, and identified by 16S rRNA gene sequences. Results showed that these bacteria were distributed in 5 phyla, 9 classes, 32 orders, 54 families, 121 genera and 262 species. Among them, Proteobacteria was the dominant phylum, accounting for 46.9%. Actinomycetia was the dominant class, accounting for 44.8%. Microbacteriales was the dominant order, accounting for 21.2%. In general, the diversity of species from the mid-level seawater was significantly lower than that from the surface and bottom seawater environments, but the dominant populations obtained from the three levels were basically the same, and the most optimal group was Microbacteriales. The number of potential new bacteria isolated from different water layers was ranked as bottom layer> surface layer> middle layer. The rate of potential new bacteria isolated from different media was ranked as follows of 2216E medium> R2A medium> ISP2 medium> MSM medium> IMK medium. CCA (canonical correspondence analysis) showed that the environmental factors that significantly affected the changes of bacterial diversity were Chl (chlorophyll content), ASS (active silicate salts), AP (active phosphate), Amm (ammonia) and BOD (biochemical oxygen demand). In this study, we systematically investigated the diversity and distribution of culturable marine bacterial in the upwelling area of eastern Guangdong. These results showed the key microbial information and data for the further study on culturabble bacterial diversity in the offshore upwelling area, and also provided reference for the exploration and utilization of species and gene resources in the typical ocean environment.

Key words： East Guangdong upwelling; culturable bacterial diversity; different isolation medium; different water layers

海水上升流是海洋典型生态系统类型之一, 其中生物与环境因素之间的关系非常复杂(乐凤凤 等, 2015)。在上升流的作用下, 下层海水被带到表层或次表层, 使得上层水体呈现低温、高盐、低溶解氧和高营养盐等特点(李立 等, 1990), 为浮游植物的生长提供物质基础, 进而为浮游动物、鱼类和虾类等生物提供良好的生存条件, 对海洋生物的分布产生深远的影响(Ani et al, 2021)。细菌是海洋中数量最多、分布最广的一类生物, 具有极高的物种多样性, 是海洋生态系统的重要组成部分(Liu et al, 2023)。作为海洋中的“终极分解者”, 细菌在生物地球化学循环中也发挥关键作用(续子杰 等, 2021)。由于实验室培养条件的限制, 人工分离培养的微生物仅占环境中所有微生物类群的1%, 绝大多数微生物仍未获得纯培养(Salam et al, 2021), 这些未经培养的微生物在碳氮循环、新型天然产物发现以及维持环境平衡方面具有重要作用(Xian et al, 2020; 张坤 等, 2023)。
以往关于上升流区细菌的研究已经表明, 无论是在细菌细胞密度、生物量还是体积大小上, 上升流区均显著超过非上升流区域(Bak et al, 1997)。上升流也会影响细菌的代谢过程, 如上升流区的细菌在细胞专一性底物合成和群落组成方面与非上升流区存在差异, 具体表现为上升流区细菌的核酸含量更低(Longnecker et al, 2005)以及上升流区细菌丰度显著增加(Abdulaziz et al, 2018)。近年来, 随着微生物学技术的进步, 越来越多的研究开始关注上升流区细菌的多样性和生态学特征。例如, 一些研究显示, 细菌和微真核生物群落在沿海上升流的影响下, 均匀度显著下降, Shannon多样性略微下降(Liu et al, 2021)。沿海上升流降低了原核和真核微生物的多样性, 且随机过程主导细菌多样性变化(Zhao et al, 2017)。细菌生产力与浮游植物的丰度密切相关(Bergen et al, 2015), 与此同时, 在上升流区域, 二氧化碳浓度的升高以及营养物质的输入等, 均可以显著促进细菌初级生产力的提高(Rykaczewski et al, 2010; Hutchins et al, 2013)。此外, 也有一些研究者关注了上升流区微生物对人类活动和全球气候变化的响应, 如在巴西里约热内卢, 受热带上升流现象影响地区的水体中具有比受人为活动影响地区更高的细菌多样性(Cury et al, 2011)。在上升流微生物群落组成与多样性变化的动力学机制研究中发现, 水团与生物因素是造成上升流微生物群落组成与多样性变化的主要因素(Sun et al, 2022)。在垂向上, 随着采样水深增加, 细菌α多样性呈现先增加后降低的单峰分布趋势(周天旭 等, 2022)。
粤东上升流作为南海北部陆架海域主要的上升流区, 因受到南海开阔海域及珠江口等河流输入的影响, 具有复杂的物理和化学环境(洪启明 等, 1991)。水体垂向分层也是上升流海域一个极其重要的特征, 它不仅影响环境因子, 而且影响微生物组成的垂向分布(周天旭 等, 2022), 目前已经成为研究的热点之一。然而将海洋上升流环境和海水分层以及纯培养微生物多样性同时考虑在内的研究还比较欠缺。因此, 本研究以粤东上升流区不同水层水样为研究对象, 结合纯培养和16S rRNA基因鉴定技术, 分析了粤东上升流区不同水层的可培养细菌多样性及其分布特征与关键环境因子的关系, 以期为海洋微生物资源的开发与利用以及粤东地区海域的保护与可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海水样品

依托广东省粤东上升流区海洋生态系统综合观测研究站, 于2022年5月的春季航次采集粤东上升流区12个调查站点不同水层共27份海水样品, 其中表层海水样品12份, 中层海水样品4份, 底层海水样品11份(表1)。由于各站点水深存在差异, 导致不同站点采样水层的水深也存在差异, 表层样品均在调查站点的海面取得, 即距离海平面0m, 底层样品在调查站点测站水深最深处往上1~2m的水层中取得, 中层样品在调查站点测站水深中间位置的上/下1m内的水层中取得。
表1 样品采集的站位

Tab. 1 Sampling sites

调查站点 取样纬度 取样经度 测站水深/m 表层 中层 底层
S01 23˚33'17"N 117˚03'27"E 11 √ √
S02 23˚31'68"N 117˚03'55"E 8 √ √
S03 23˚28'40"N 116˚55'83"E 5 √
S04 23˚28'95"N 116˚59'46"E 14 √ √
S05 23˚29'01"N 117˚11'91"E 15 √ √
S06 23˚24'49"N 117˚09'32"E 29 √ √ √
S07 23˚23'26"N 117˚22'15"E 40 √ √ √
S08 23˚15'31"N 117˚18'35"E 39 √ √ √
S09 23˚18'39"N 117˚04'55"E 19 √ √
S10 23˚21'41"N 116˚50'58"E 8.5 √ √
S11 23˚11'27"N 116˚53'36"E 27 √ √ √
S12 23˚16'36"N 116˚47'94"E 9.2 √ √

1.1.2 分离培养基与配方

所选用的5种琼脂培养基, 配方如下。
1) 2216E培养基配方: 2216E液体培养基37.4g; 琼脂粉15g; 超纯水1000mL;
2) R2A(Reasoner’s 2A)培养基配方: R2A液体培养基3.7g; 琼脂粉15g; 超纯水1000mL;
3) MSM培养基(minimal salt medium)配方: KH2PO4 1.5g; Na2HPO4·12H₂O 10.55g; NH4Cl 0.3g; MgCl2 0.3g; 混合维生素贮存液1mL; 痕量元素1mL; 琼脂粉15g; 超纯水1000mL; pH 7.2±0.2;
4) IMK(Daigo’s IMK)培养基配方: NaNO3 200mg; Na2HPO4 1mg; K2HPO4 5mg; NH4Cl 2.68mg; Fe-EDTA 5.2mg; Mn-EDTA 0.332mg; Na-EDTA 37.2mg; ZnSO4·7H2O 0.014mg; CoSO4·7H2O 0.0073mg; Na2MoO4·2H2O 0.0073mg; CuSO4·5H2O 0.0025mg; H2SO3 0.0017mg; CH6ONCl 0.2mg; Biotin 0.0015mg; 维生素B12 0.0015mg; MnCl2·4H2O 0.18mg; 琼脂粉15g; 超纯水1000mL; pH 7.2±0.2;
5) ISP2培养基(ISP Medium No.2)配方: 酵母浸粉4g; 麦芽浸粉10g; 葡萄糖4g; 琼脂粉15g; 超纯水1000mL; pH 7.2±0.2。

1.2 菌株的分离、纯化与保藏

对采集的27份海水样品进行处理, 取100mL海水, 用隔膜真空泵(GM-0.33A, 天津津腾实验设备有限公司)过滤装置过滤, 孔径0.22µm。测定滤膜上的细菌, 加入10mL纯水溶解其中的无机盐和其他可溶性物质并调整样品的离子浓度和渗透压, 再加入纯水将样品稀释10倍并均匀混合, 取100μL稀释后的菌体悬浊液分别涂布在5种琼脂固体培养基上, 28℃倒置培养14天。对产生的单菌落进行计数, 并挑取不同形态的单菌落利用平板划线法进行纯化和富集收集。所有纯化的菌株使用30%(V/V)甘油于-80℃冰箱中保藏。

1.3 16S rRNA基因扩增测序分析

使用5%Chelex-100试剂提取细菌总DNA(Walsh et al, 1991), 采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGT TACGACTT-3′)进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应条件: 95℃ 5min; 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s进行25个循环, 72℃ 10mim延伸后于4℃保存。用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物, 样品送广州天一辉远测序公司进行16S rRNA基因测序。测序结果在SeqMan5.0软件中进行拼接, 经去除质量不佳的测序碱基后, 获得的有效序列(近1500bp)被提交至EzBioCloud(Yoon et al, 2017)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线BLAST比对。比对结果按照相似性98.65%作为区分物种的标准(Kim et al, 2014), 若与已知菌种相似度小于或等于98.65%, 则该菌株被认为是潜在新种。

1.4 系统进化分析

根据序列比对结果, 使用MEGA11(Kumar et al, 2018)软件结合Kimura2-parameter模型估算系统进化矩阵进行聚类分析(李存 等, 2022)。选择同源性较高的模式菌株的16S rRNA基因序列作为参考序列。在聚类分析中, 设定了bootstrap值为1000次, 以进行重采样检验系统发育树的可靠性。最终生成的系统发育树通过iTOL(Letunic et al, 2019)在线网站进行可视化。

2 结果与分析

2.1 不同水层菌落数统计

通过对采集的27份海水样品进行过滤处理, 将连续稀释至10-2的样品取100μL涂布于分离培养基上, 28℃倒置培养14天, 对菌落数进行计数。标准的2216E培养基分离结果显示, 表层海水样品中的菌落数量显著(P<0.05)高于中层海水样品中的菌落数量, 极显著(P<0.001)高于底层海水样品中的菌落数量; 中层海水样品中的菌落数量也高于底层海水样品中的菌落数量, 但差异并不显著。根据不同水层统计样品中的菌落数的分布, 发现表层海水样品中菌落数分布数据较为分散, 在S09站点取得的海水样品培养出的菌落数最多, 达到172个, 在S06站点取得的海水样品培养出的菌落数最少, 为68个, 12个样品获得的菌落数平均为126个; 中层海水样品在S08站点取得的海水样品培养出的菌落数最多, 达到105个, 在S11站点取得的海水样品培养出的菌落数最少, 为40个, 4个样品获得的菌落数平均为79个; 底层海水样品在S06站点取得的海水样品培养出的菌落数最多, 达到160个, 在S12站点取得的海水样品培养出的菌落数最少, 为36个, 11个样品获得的菌落数平均为62个。如图1所示。
图1 不同水层菌落数比较

圆点为每个水层原样海水稀释至10-2后100μL菌悬液培养出的菌落数, 配对样本t检验, ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS, P> 0.05

Fig. 1 Comparison of the number of colonies in different water layers.

The number of colonies cultured from 100μL bacterial suspension after dilution of the original seawater to 10-2, Paired-Samples t test, ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS, P>0.05

2.2 菌株多样性组成分析

从培养后的分离平板上挑取单菌落, 并进行纯化、培养和16S rRNA基因序列鉴定, 成功获得1928株细菌(GenBank登录号为PP423093—PP424985), 它们分布在5门、9纲、32目、54科、121属和262种。如图2所示, 门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)最多, 占总数的46.9%, 其次是放线菌门(Actinomycetota), 占总数的44.8%, 拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和红嗜热盐菌门(Rhodothermaeota)分别占总数的6.0%、2.3%和0.1%(图2a)。纲水平上, 9个纲中占比最多的是放线菌纲(Actinomycetia), 占44.8%, 其次是α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria), 分别占31.3%和15.6%(图2b)。目水平上, 微杆菌目(Microbacteriales)和鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)占主要地位, 都在15%以上。其中微杆菌目占比最高, 为21.2%(图2c)。在本研究中, 仅有1株菌属于红嗜热盐菌门(Rhodothermaeota), 在EzBioCloud(Yoon et al, 2017)进行在线BLAST比对得到该菌株的最相似菌株为Rubrivirga profundi, 相似性为97.14%。以上结果证明, 粤东上升流不同水层样品中可培养的微生物具有较高的多样性。
图2 粤东上升流可培养细菌群落的门(a)、纲(b)、目(c)组成

Fig. 2 Composition of culturable bacterial community in the upwelling of eastern Guangdong. Community composition at the levels of phylum, class, and order is depicted in (a), (b) and (c), respectively

2.3 不同水层细菌多样性

分别从门、纲、目、科、属水平上对不同水层分离得到的菌株进行分析, 其中, 表层海水样品中共分离出785株细菌, 分布在4门、6纲、26目、45科和88属; 中层海水样品中共分离出342株细菌, 分布在5门、8纲、25目、37科和58属; 底层海水样品中共分离出801株细菌, 分布在4门、8纲、28目、41科和85属(图3)。中层海水分离得到的菌株多样性仅在门水平上超过表层海水和底层海水的菌株多样性, 在纲水平上, 中层海水的菌株多样性超过表层海水的菌株多样性, 与底层海水的菌株多样性相等, 从目水平开始, 中层海水的菌株多样性均明显低于表层和底层海水的菌株多样性。
图3 不同分类水平上不同水层分离得到的细菌多样性

Fig. 3 Comparison of bacterial diversity isolated from different water layers at different taxonomic levels

不同水层分离得到的菌株优势种群大致相同。以目水平为例, 表层、中层和底层海水样品中分离菌株的优势目均为微杆菌目(Microbacteriales), 相对丰度分别占表层、中层和底层菌株总丰度的21.4%、19.6%和21.6%。其次是鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales), 分别占16.1%、16.4%和19.2%, 如图4所示。
图4 不同水层微生物目水平群落结构

Fig. 4 Community structure at the microbial order level in different water layers

虽然不同水层分离得到的菌株大部分相同, 但每个水层也有其独特的菌株。同样以目水平举例, 根据不同水层分离得到的微生物目水平韦恩图(图5)显示, 三个水层共同拥有20个可培养细菌目, 表层和中层共同拥有20个可培养细菌目, 表层和底层共同拥有24个可培养细菌目, 中层和底层共同拥有22个可培养细菌目, 表层海水中分离出1个与中层和底层海水微生物不重叠的目, 为Cellvibrionales目, 中层海水中分离出3个与表层和底层海水微生物不重叠的目, 分别是Streptomycetales目、Rhodospirillales目和Rhodothermales目, 底层海水中分离出2个与表层和中层海水微生物不重叠的目, 是Demequinales目和Cytophagales目。
图5 不同水层分离得到的微生物目水平韦恩图

Fig. 5 Venn diagram of microbial order level obtained from different water layers isolation

2.4 潜在新物种信息

本研究所分离的1928株细菌中有236株与其最相似物种的16S rRNA基因序列相似性低于98.65%(Kim et al, 2014), 为潜在新菌株, 占全部分离菌株数的12.3%, 相似性范围在94.37%~98.64%之间, 其中相似度低于95%的有1株, 最相似菌株为志贺菌Shigella flexneri, 相似性为94.37%。这些潜在新菌株分布在4门、7纲、18目、19科、46属, 变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinomycetota)为潜在新物种中的优势门, 分别为154株和45株, 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和微杆菌属(Microbacterium)为潜在新物种中的优势属, 分别为42株和37株。在236株潜在新菌中, 仅有1株菌属于红嗜热盐菌门(Rhodothermaeota), 最相似菌株为Rubrivirga profundi, 相似性为97.14%。按照水层划分, 89株分离自表层海水, 占全部潜在新菌数的37.6%; 49株分离自中层海水, 占全部潜在新菌数的20.7%; 99株分离自底层海水, 占全部潜在新菌数的41.8%。因此, 从不同水层海水中分离得到的潜在新菌率排序为: 底层>表层>中层。根据16S rRNA基因相似度比对出的236株潜在新菌最相似菌株信息, 进行重复项合并, 若多个菌株比对出相同的参考菌株, 则只保留一个, 共得到70个不同的最相似菌种的信息, 图6展示了潜在新菌合并后对应的70个已知菌种(已发表)的系统进化发育树和合并的菌株数、菌株号及16S rRNA基因相似度范围等信息。
图6 潜在新菌合并后对应的70个最相似菌种的系统进化发育树

Fig. 6 Phylogenetic tree of 70 new candidates and their most similar species corresponding to the combined potential new strains

2.5 不同培养基分离效果

为了评价不同培养基的分离效果, 对5种培养基分离的菌株数、潜在新菌数和菌株属级水平数进行了统计分析, 发现在获得的1928株细菌中, R2A培养基分离的菌株数最多, 为880株; 其次是2216E培养基, 为635株, 由R2A和2216E培养基分离得到的菌株数占全部分离菌株数的78.6%; MSM培养基分离的菌株数最少, 为94株。再对比5种不同培养基的潜在新菌数, 发现在237株潜在新菌中, 同样是2216E培养基和R2A培养基得到的潜在新菌数量最多, 两种培养基分别得到102株新菌和99株新菌, 占总潜在新菌数量的84.8%; IMK培养基仅得到1株潜在新菌株, 获得的潜在新菌数量最少(图7)。
图7 不同培养基的分离效果比较

Fig. 7 Comparison of the isolation effects of different media

2.6 细菌多样性与环境因子关系

在本次采样过程中, 我们还测量了部分环境数据, 如溶解氧含量(dissolved oxygen, DO)、叶绿素含量(chlorophyll content, Chl)、水温(water temperature, WT)、盐度(salinity, Sal)、悬浮体(suspended substance, SS)、浊度(turbidity, Tur)、pH、透明度(transparency, Tra)、 活性硅酸盐(active silicate salts, ASS)、 活性磷酸盐 (active phosphate, AP)、亚硝酸盐(subnitrate, Sub)、硝酸盐(nitrate, Nit)、氨及部分氨基酸(ammonia, Amm)、化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)和生化需氧量(biochemical oxygen demand, BOD)等可能对细菌多样性造成影响的环境变量。具体数据见表2。由于环境变量较多, 需要筛选出起作用的变量并剔除不起作用变量。利用IBM SPSS软件选择多元逐步回归分析(step-wise multiple regression analysis)方法建立预测模型检验众多环境变量对微生物多样性影响的相对重要性, 该方法通过逐步引入自变量和从回归方程中剔除自变量, 以建立最优的回归模型, 有助于解释因变量与多个自变量之间的线性关系, 并识别出对因变量影响显著的变量。从15个环境数据中, 共筛选出9个可显著影响微生物多样性的环境变量, 即Chl、WT、Sal、ASS、AP、Nit、Amm、COD和BOD, 其中, 能显著影响(P< 0.05)多样性变化的环境因子有Chl、ASS、AP、Amm和BOD(图8、表3)。轴1共解释可培养细菌多样性变化的25%, 轴2共解释可培养细菌多样性变化的19.5%。
表2 所有海水样品环境参数

Tab. 2 Environmental parameters of all seawater samples

站点 采样层 环境参数
DO/
(mg·L-1)		 Chl/
(μg·L-1)		 WT/℃ Sal/‰ SS/
(mg·L-1)		 Tur/
TU		 pH Tra /
m		 ASS /(mg·L-1) AP/
(mg·L-1)		 Sub/
(mg·L-1)		 Nit/
(mg·L-1)		 Amm/
(mg·L-1)		 COD/
(mg·L-1)		 BOD/
(mg·L-1)
S01 表 6.083 0.569 23.8 30.4 5.60 7.57 7.91 1.7 1.07 0.049 0.024 0.043 0.138 1.048 0.494
底 6.225 0.498 23.6 30.9 11.80 13.33 / / 0.54 0.030 0.025 0.034 0.125 0.944 0.497
S02 表 6.744 1.802 23.4 31.2 10.55 4.56 7.99 2.1 0.39 0.031 0.013 0.054 0.052 0.942 0.250
底 6.646 1.027 23.2 30.9 10.55 3.80 / / 0.56 0.043 0.013 0.039 0.056 1.142 0.184
S03 表 6.992 0.774 23.1 31.2 10.70 5.81 8.02 1.2 0.63 0.008 0.027 0.003 0.027 0.852 0.644
S04 表 6.604 0.322 23.0 31.1 12.15 8.71 8.00 1.3 0.82 0.017 0.019 0.014 0.057 0.978 0.115
底 6.706 0.409 23.0 30.8 13.60 12.71 / / 0.65 0.008 0.021 0.037 0.051 0.703 0.395
S05 表 7.161 0.340 22.6 33.4 4.60 1.96 8.13 2.9 0.35 0.007 0.003 0.003 0.008 1.003 0.344
底 6.898 0.607 22.6 33.5 5.53 4.57 / / 0.37 0.008 0.003 0.003 0.030 1.098 0.151
S06 表 6.722 0.559 22.7 33.3 4.20 2.20 8.14 2 0.44 0.009 0.007 0.003 0.055 0.796 0.312
中 6.630 0.605 22.7 33.3 8.65 7.32 / / 0.40 0.010 0.007 0.003 0.043 0.828 0.268
底 6.692 0.658 22.7 33.3 9.00 5.86 / / 0.35 0.008 0.006 0.003 0.023 0.849 0.302
S07 表 6.761 0.153 23.0 34.0 0.60 3.07 8.11 10.2 0.18 0.007 0.003 0.003 0.022 0.479 0.013
中 7.023 0.501 23.0 34.0 0.60 1.60 / / 0.16 0.006 0.003 0.003 0.006 0.950 0.096
底 6.813 0.600 23.0 34.0 0.95 1.13 / / 0.12 0.008 0.003 0.003 0.047 0.496 0.029
S08 表 6.926 0.499 23.3 34.1 0.95 3.35 8.15 11.2 0.08 0.008 0.003 0.003 0.003 0.772 0.010
中 6.893 0.414 23.3 34.1 1.15 2.24 / / 0.11 0.006 0.003 0.003 0.007 0.584 0.108
底 6.758 0.401 23.3 34.1 1.10 0.83 / / 0.19 0.008 0.003 0.003 0.010 0.772 0.027
S09 表 8.898 5.786 23.3 32.5 2.45 2.84 8.28 3.4 0.23 0.006 0.003 0.003 0.007 1.297 0.829
底 7.475 3.084 22.8 33.5 3.70 3.48 / / 0.24 0.007 0.003 0.003 0.003 1.149 0.383
S10 表 7.946 5.661 23.9 28.3 5.40 4.44 8.17 3.1 0.26 0.007 0.018 0.063 0.028 1.057 1.384
底 6.729 1.614 22.8 33.1 14.10 15.05 / / 0.49 0.007 0.016 0.131 0.046 0.801 0.693
S11 表 7.557 0.466 23.5 33.4 4.40 0.82 8.14 5.2 0.23 0.005 0.003 0.003 0.007 0.853 0.835
中 7.129 0.555 23.1 33.8 1.25 1.13 / / 0.24 0.006 0.003 0.003 0.012 1.331 0.244
底 6.911 0.766 23.2 33.5 2.95 4.99 / / 0.23 0.006 0.003 0.003 0.008 0.752 0.113
S12 表 7.429 1.206 23.8 27.5 3.40 4.82 8.08 2.7 0.67 0.008 0.024 0.003 0.041 1.429 1.333
底 7.412 0.914 22.9 33.3 6.45 7.69 / / 0.71 0.008 0.015 0.008 0.063 0.916 1.196

注: pH、Tra为根据站位监测站收集的固定数据，未分层

图8 可培养细菌多样性与叶绿素含量(Chl)、水温(WT)、盐度(Sal)、活性硅酸盐(ASS)、活性磷酸盐(AP)、硝酸盐(Nit)、氨及部分氨基酸(Amm)、化学需氧量(COD)和生化需氧量(BOD)的典范对应分析

Fig. 8 Canonical correspondence analysis(CCA) between diversity of culturable bacteria and chlorophyll content (Chl), water temperature (WT), salinity(Sal), active silicate salts (ASS), active phosphate (AP), nitrate (Nit), ammonia and some amino acids (Amm), chemical oxygen demand (COD) and biochemical oxygen demand (BOD)

表3 环境因子对可培养细菌多样性的ANOSIM检验结果(P-值)

Tab. 3 ANOSIM test results (P-value) of environmental factors on changes of diversity of cultured bacteria

环境因子 P
叶绿素含量(Chl) 0.026
水温(WT) 0.243
盐度(Sal) 0.068
活性硅酸盐(ASS) 0.011
活性磷酸盐(AP) 0.002
硝酸盐(Nit) 0.866
氨及部分氨基酸(Amm) 0.001
化学需氧量(COD) 0.150
生化需氧量(BOD) 0.001

3 结果与讨论

本研究对粤东上升流区采集的27份海水样品进行细菌多样性研究。对比不同水层在标准的2216E培养基上获得的菌落数, 发现表层海水样品中的菌落数量最多, 显著(P<0.05)高于中层海水样品中的菌落数量, 极显著(P<0.001)高于底层海水样品中的菌落数量, 总体而言, 越接近表层, 可培养细菌所获得的菌落数越多, 这可能是由于表层海水受到阳光的直接照射, 光照强度和温度变化影响了微生物的生长和繁殖(An et al, 2023; Tang et al, 2023)。其次, 上升流区域表层海水含有更多的营养物质, 如氮、磷等, 这些物质是许多微生物生长所必需的(张晓华, 2007)。当营养物质丰富时, 微生物的生长速度加快, 菌株数量增加。此外, 表层海水中的溶解氧含量也更高, 有利于某些光合微生物和好氧型微生物的生长和繁殖(Xu et al, 2022; 李涵 等, 2022)。中层海水样品中的菌落数量虽然高于底层海水样品中的菌落数量, 但是差异并不显著(P> 0.05)。这可能是由于测站水深的不一致导致取样的中层与底层海水在大的海洋垂直梯度上区分不明显。
其次, 各水层细菌群落组成具有相似性, 27个水样中变形菌门(Proteobacteria)为共同的优势类群, 占总数的44.8%, 这一结果与国内外海洋微生物多样性研究结果一致(Siam et al, 2012; Zeng et al, 2013; 商丽 等, 2017; 毛梦婷 等, 2023)。16S rRNA基因测序分析发现获得的1928株细菌分布在5门、9纲、32目、54科的121属。按照不同水层划分, 表层海水样品中有785株, 分布在4门、6纲、26目、45科的88属; 中层海水样品中有342株细菌, 分布在5门、8纲、25目、37科的58属; 底层海水样品中共分离出801株细菌, 分布在4门、8纲、28目、41科的85属。在本研究中, 中层海水分离得到的纯培养细菌多样性明显低于表层和底层, 这可能是因为分离培养基的选择性(孙创 等, 2021), 最有可能是上升流将底层海水中丰富的有机物质和微量元素带到表层, 为微生物生长提供充足的养分来源, 如溶解氧、氮、磷等, 近岸上升流底层的海水上涌后, 周围同水平海水或外海更深层冷水沿海底地形向岸爬升补充, 养分持续供给, 促进微生物生长(Mota et al, 2013; Jebbar et al, 2015; Xu et al, 2017)。而上升流的中层海水不管是在光照、温度和养分等方面, 均不具有明显优势, 因此微生物多样性最低。
本研究中, 叶绿素含量、活性硅酸盐、活性磷酸盐、氨及部分氨基酸和生化需氧量显著影响了粤东上升流细菌多样性变化。叶绿素作为光合作用的关键色素, 能够吸收太阳光能, 并将其转化为化学能, 以驱动二氧化碳和水转化为有机物质的过程。因此, 叶绿素含量的变化可能会影响上升流中的生产力和有机物产量, 从而增加细菌的多样性(Xia et al, 2023)。一些细菌也会利用叶绿素或其降解产物作为营养源, 来促进这些细菌的生长和繁殖(薛璐 等, 2023)。海洋中异养浮游细菌的生长还依赖于营养盐的种类和数量, Cotner等(1997)研究发现, 大西洋中部萨加索海区具有很高的溶解有机碳含量和与之不匹配的低细菌生产力, 在向实验海区的水体添加营养盐后, 异养浮游细菌的生物量和生产力均明显增加, 认为正是由于某些必要元素的限制, 才导致细菌二次生产力的下降。氮是细菌合成氨基酸和蛋白质所必需的元素, 而氨是大多数细菌可以利用的氮源(Coelho-Souza et al, 2015), 粤东海域隶属南海, 为寡营养盐海区, 因此, 初步推断粤东上升流海区细菌生长受氮和磷的限制(Shan et al, 2015)。生化需氧量通常用于衡量水体的污染程度, 生化需氧量的升高可能意味着水中有机物污染的增加, 这可能会对细菌的生存和多样性产生影响。但是, 这种影响的具体机制还需进一步研究。
粤东上升流区是一个复杂而重要的环境, 以往对微生物的研究多集中于微生物的生物量(Figueiras et al, 2006)、初级生产力(Ning et al, 2004)、丰度变化(Sun et al, 2020)等方面。海洋微生物中蕴藏着丰富的新资源, 但限于目前绝大多数海洋微生物不可培养的特点, 挖掘上升流生态系统中可培养的微生物资源, 对提高海洋微生物资源的利用具有重要意义。因此, 本研究采用纯培养方法, 通过16S rRNA基因序列鉴定, 探究与深度相关的细菌多样性和分布模式, 研究结果不仅丰富了特殊生境下的海洋微生物资源, 也为深入研究海洋上升流中微生物的生态学特征提供了重要参考, 具有一定的科学价值和现实意义。

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