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热带海洋学报 >

2025 , Vol. 44 >Issue 1: 133 - 145

DOI: https://doi.org/10.11978/2024059

海洋资源开发

珊瑚来源潜在降解对甲氧基肉桂酸辛酯的细菌物种多样性

  • 黄沁愉 , 1, 2 ,
  • 吕丽娜 2 ,
  • 李洁 2 ,
  • 琚慧敏 2 ,
  • 苏宏飞 , 1
展开
  • 1.广西大学海洋学院, 广西 南宁 530004
  • 2.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
苏宏飞。email:

黄沁愉(1999—), 女, 广东省广州市人, 硕士研究生, 从事海洋珊瑚微生物相关研究。email:

Copy editor: 孙翠慈

收稿日期: 2024-03-18

  修回日期: 2024-04-12

  网络出版日期: 2024-04-29

基金资助

国家自然科学基金项目(U23A2036)

收起

Microbial diversity of potential EHMC-degrading bacteria from coral

  • HUANG Qinyu , 1, 2 ,
  • LYU Lina 2 ,
  • LI Jie 2 ,
  • JU Huimin 2 ,
  • SU Hongfei , 1
Expand
  • 1. School of Marine Sciences, Guangxi University, Nanning 530004, China
  • 2. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Chinese Academy of Sciences, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
SU Hongfei. email:

Copy editor: SUN Cuici

Received date: 2024-03-18

  Revised date: 2024-04-12

  Online published: 2024-04-29

Supported by

National Natural Science Foundation of China(U23A2036)

Fold

摘要

对甲氧基肉桂酸辛酯(2-ethylhexyl-4-methoxycinnamic acid, EHMC)是国内防晒产品中最常见的有机紫外吸收剂成分, 随人类活动汇入海洋并在珊瑚组织内积累, 加速珊瑚白化。微生物降解法是去除珊瑚EHMC污染的有效手段之一, 然而目前珊瑚的EHMC降解细菌资源及EHMC对珊瑚微生物群落的影响仍知之甚少。本文选择三亚鹿回头近岸海域珊瑚为研究对象, 开展EHMC降解菌多样性研究。首先, 以EHMC为唯一碳源对珊瑚组织样品进行多次富集, 获得EHMC的耐受菌群, 利用高通量测序技术, 分析富集菌群组成和多样性; 同时通过细菌的分离鉴定和功能验证, 筛选出潜在的EHMC降解菌株。16S rRNA基因高通量测序结果显示, 在EHMC胁迫下, 滨珊瑚(Porites lutea)、角蜂巢珊瑚(Favosites sp.)和鹿角珊瑚(Acropora sp.)三个样品的细菌群落多样性下降。从属水平上看, 壤霉菌属(Agromyces)、副球菌属(Paracoccus)、Pelagibaca属和赤杆菌属(Erythrobacter)等细菌在原始珊瑚中占比极低, 经EHMC多次富集后成为优势菌属。通过纯化培养, EHMC富集样品共分离出60株可培养细菌。16S rRNA基因鉴定结果显示, 60株细菌分别归属于3个门、3个纲、6个目、8个科、13个属和17个种。可培细菌的优势菌属主要为芽孢杆菌属(Bacillus), 其次是红球菌属(Rhodococcus), 副球菌属, 微小杆菌属(Exiguobacterium)和尖球菌属(Acuticoccus)。经对单个纯培养菌株的活性筛选, 最终筛选出8株潜在EHMC降解菌株, 分别归属于芽孢杆菌属、短波单胞菌属(Brevundimonas)、副球菌属、尖球菌属、Phycicoccus属、红球菌属和分枝杆菌属(Mycolicibacterium)。前人研究表明, 红球菌属、芽孢杆菌属和副球菌属等细菌与芳香族化合物的生物降解相关。本研究分析了EHMC污染对珊瑚细菌群落的影响, 并分离出潜在的EHMC降解细菌, 为珊瑚抵御有机紫外吸收剂污染提供有用信息, 也为后续构建珊瑚益生微生物组减轻珊瑚礁有机污染积累了宝贵的菌种资源。

关键词： 珊瑚; 对甲氧基肉桂酸辛酯; 菌群多样性; 微生物降解

本文引用格式

黄沁愉 , 吕丽娜 , 李洁 , 琚慧敏 , 苏宏飞 . 珊瑚来源潜在降解对甲氧基肉桂酸辛酯的细菌物种多样性[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(1) : 133 -145 . DOI: 10.11978/2024059

Abstract

2-ethylhexyl-4-methoxycinnamic acid (EHMC) is an organic UV filter that is widely used in domestic sunscreen products. It is released into the ocean via human activities and accumulated in coral tissues, hastening coral bleaching. Biodegradation is an effective method for removing EHMC from coral, but little is known about its biodegradation in coral and its impact on coral microorganisms. To study the diversity of EHMC biodegradation in coral, we collected coral samples from Luhuitou, Sanya. These samples were enriched multiple times with EHMC as the sole carbon source to obtain EHMC-tolerance bacteria. High-throughput sequencing technology was used to analyze the composition and diversity of bacteria communities from enrichment samples. Besides, potential EHMC-degrading strains were isolated and identified from the enrichment through activity tests. High-throughput 16S rRNA gene sequencing revealed that the microbial community diversity in coral samples of Porites lutea, Favosites sp. and Acropora sp. was reduced under high concentration of EHMC. In contrast to their low abundance in the original coral samples, Agromyces, Paracoccus, Pelagibaca and Erythrobacter were the dominant genera after multiple enrichment with EHMC. Furthermore, a total of 60 bacterial strains were isolated from the EHMC-enriched samples. Based on 16S rRNA gene identification, these strains belonged to three phyla, three classes, six orders, eight families, thirteen genera and seventeen species. The main dominant genera among the cultivable bacteria were Bacillus, followed by Rhodococcus, Paracoccus, Exiguobacterium and Acuticoccus. Moreover, eight potential EHMC-degrading strains were selected through activity tests, belonging to Bacillus, Brevundimonas, Paracoccus, Acuticoccus, Phycicoccus, Rhodococcus and Mycolicibacterium, respectively. Previous studies have shown that Rhodococcus, Bacillus and Paracoccus were correlated with the biodegradation of aromatic compounds. This study illustrates the impact of EHMC on coral microbial communities and isolates potential EHMC-degrading bacteria, providing valuable information for coral resilience against organic UV filters. Additionally, it accumulates valuable bacterial resources for eliminating organic contaminants in coral by the subsequent construction of coral probiotic consortium.

Key words： coral; 2-ethylhexyl-4-methoxycinnamic acid; microbial diversity; microbial degradation

对甲氧基肉桂酸辛酯(2-ethylhexyl-4-methoxycinn amic acid, EHMC)是一种有效吸收290~320nm紫外线的有机紫外吸收剂(Ghasemi et al, 2018)。作为良好的防晒成分, EHMC被广泛添加在防晒霜和其他个人护理产品中, 目前已成为我国防晒产品中最常用的有机紫外吸收剂成分(王任 等, 2023)。EHMC通过生活废水、工业污水和海上娱乐活动等方式进入水生环境, 最终进入海洋(Fent et al, 2008; He et al, 2019)。研究已显示, 在沿海地区的表层海水以及海洋沉积物均检测到了EHMC的存在(Tsui et al, 2015, 2019)。由于EHMC具有低水溶性和高亲脂性[log10(Kow)> 3.5], 其在海洋环境中极易积聚并富集于各类生物体内, 包括鱼类、贻贝、珊瑚和其他大型无脊椎动物等(Bachelot et al, 2012; Mitchelmore et al, 2019)。长期积累的EHMC会对生物体的内分泌系统产生干扰, 严重威胁它们的发育和繁殖, 例如, 可能影响鱼类激素的分泌, 毒害鱼类的发育神经(Yang et al, 2024), 甚至促进病毒感染, 导致珊瑚白化和死亡等现象(Danovaro et al, 2008; He et al, 2019)。EHMC作为一种有机污染物(Tsui et al, 2014), 长期在生物中积累将危害海洋各生态系统的健康运行, 因此需要重视海洋EHMC污染问题。
目前, 海洋中有机污染物去除方式包括物理吸附、光转化、化学氧化和微生物降解等(Rodil et al, 2009; Hopkins et al, 2017; Qiu et al, 2022; 钱程, 2022)。相对于理化方法可能产生的二次污染, 微生物降解方法具有低成本、高安全性等优势。利用微生物的吸附和代谢分解作用, 将难降解污染物转化为无污染终产物, 是处理海洋有机污染物污染的最佳方案之一(Fragoso Ados Santos et al, 2015)。有机紫外吸收剂微生物降解已经受到了广泛的关注, 并且已经报道了多种能够降解有机紫外吸收剂的微生物。如白腐真菌可降解4-甲基苄亚基樟脑(4-MBC)和苯酮类机紫外吸收剂(Badia-Fabregat et al, 2012; Gago-Ferrero et al, 2012); 分枝杆菌(Mycobacterium agri)在油滴状的奥克立林表面形成生物膜并降解利用(Suleiman et al, 2019); 分离自不同地区污染沉积物的嗜甲基菌(Methylophilus sp.)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)及红球菌(Rhodococcus oxybenzonivorans)等细菌具有降解二苯酮-3的能力(Jin et al, 2019; Fagervold et al, 2021; Baek et al, 2022)。海洋沉积物也被发现对对二甲氨基苯甲酸异辛酯具有良好的去除能力(Volpe et al, 2017), 因此, 采用微生物来清除海洋中的EHMC是一种有效的手段, 其中关键是获得EHMC降解微生物资源。然而目前, 有关EHMC微生物降解研究有限。研究证实秦淮河沉积物的微生物群落对EHMC具有降解潜力(Zhang et al, 2021), 但还未获得纯培养的EHMC降解细菌。
南海是中国珊瑚分布最广泛、种类最丰富的海域。三亚鹿回头位于南海中纬度热带地区, 造礁石珊瑚种类繁多, 据统计约可归类为13个科24个属(李明, 2022), 优势属有鹿角珊瑚属(Acropora)、滨珊瑚属(Porites)、杯形珊瑚属(Pocillopora)、牡丹珊瑚属(Pavona)、角孔珊瑚属(Goniopora)、盔形珊瑚属(Galaxea)等 (赵美霞 等, 2008; 吴钟解 等, 2013)。珊瑚礁是海洋中重要的生物多样性储库。其中微生物是珊瑚共生功能体中极其重要的组成部分, 参与宿主的营养物质循环, 具有外源污染物降解和病原体的防御等多样功能(Pereira et al, 2017; 陈飚, 2021)。此外, 自波斯湾珊瑚中分离出的大量石油降解细菌, 证实了珊瑚微生物具有降解复杂有机污染物的潜力(Ansari et al, 2021)。南海珊瑚礁正在遭受EHMC的污染(Tsui et al, 2019; Pei et al, 2023), 但海洋环境中EHMC的研究仅集中在环境分布、迁移和生物毒性的方面, 缺少EHMC对珊瑚微生物的影响及微生物降解资源的相关报道。
为此, 本研究采集了三亚鹿回头近岸海域常见的14个珊瑚样品(属水平归类为蔷薇珊瑚属、盘星珊瑚属、牡丹珊瑚属、鹿角珊瑚属、盔形珊瑚属、角孔珊瑚属、角蜂巢珊瑚属、滨珊瑚属和杯形珊瑚属), 以EHMC为唯一碳源, 对珊瑚共生微生物进行多次富集培养, 获得EHMC降解菌群, 通过高通量测序手段, 分析降解菌群的组成和多样性, 进一步通过分离鉴定和活性验证, 筛选出潜在的EHMC降解菌株资源。本研究有助于深入了解南海珊瑚微生物在EHMC污染环境中的生态适应能力, 并且为未来开发生物降解技术提供了重要的资源基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 珊瑚样品

2022年4月在三亚市鹿回头近岸海域的珊瑚礁区(18°13′N, 109°29′E)下潜采集14个造礁石珊瑚样品, 截取每个珊瑚的1~2个健康断枝使用30%聚乙二醇(PEG 3000)保存, 均置于液氮中冻存, 并运输至实验室内开展实验。在中国科学院南海海洋研究所珊瑚生态专业团队的专家帮助下, 对采集的珊瑚样品进行种属鉴定, 具体物种信息在表1中罗列。
表1 三亚鹿回头海域采集的珊瑚物种信息

Tab.1 The information of coral species collected from Luhuitou, Sanya

珊瑚属名 珊瑚种名 拉丁名
蔷薇珊瑚属 截顶蔷薇珊瑚 Montipora truncata
蔷薇珊瑚 Montipora sp.
盘星珊瑚属 盘星珊瑚 Dipsastraea sp.
牡丹珊瑚属 厚板牡丹珊瑚 Pavona duerdeni
十字牡丹珊瑚 Pavona decussata
鹿角珊瑚科属 巨锥鹿角珊瑚 Acropora monticulosa
多孔鹿角珊瑚 Acropora millepora
风信子鹿角珊瑚 Acropora hyacinthus
鹿角珊瑚 Acropora sp.
盔形珊瑚属 从生盔珊瑚 Galaxea fascicularis
角孔珊瑚属 角孔珊瑚 Goniopora sp.
角蜂巢珊瑚属 角蜂巢珊瑚 Favosites sp.
滨珊瑚属 澄黄滨珊瑚 Porites lutea
杯形珊瑚属 鹿角杯形珊瑚 Pocillopora damicornis

1.1.2 主要培养基及试剂配置

30%聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)3000盐溶液的配置: 称取30g PEG 3000, 溶解于100mL 3%氯化钠水溶液。EHMC母液(1.0g·L-1)配置: 称量0.1g EHMC, 加入二氯甲烷在100mL容量瓶中定容。分离培养使用海生菌琼脂固体培养基(marine agar 2216, MA)。富集培养使用人工海水培养基: 氯化钠24.0g·L-1, 硝酸铵1.0g·L-1, 氯化钾0.7g·L-1, 磷酸二氢钾2.0g·L-1, 磷酸氢二钠3.0g·L-1, 七水合硫酸镁3.5g·L-1, ddH2O 1L, pH 7.4, 121℃ 灭菌20min。灭菌后添加1‰ 微量元素原液和1‰ 维生素原液。微量元素原液和维生素原液配置方案参考文献(Liu et al, 2005)。

1.1.3 试剂

扩增细菌16S rRNA基因的通用引物27F (5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。EHMC (98%)购自Sigma-Aldrich公司; 细菌DNA提取试剂盒和TGuide S96 磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 EHMC降解菌群的富集培养

在无菌环境下, 使用气枪法分离珊瑚组织和骨骼, 加入10mL MMC培养液收集珊瑚组织, 混合均匀。无菌培养管内添加30mL灭菌MMC培养基, 加入1.0mg·L-1 EHMC, 接种1mL珊瑚组织液, 设置3个平行实验组, 转速160r·min-1、25℃避光条件下培养30d, 剩余珊瑚组织液于-80℃避光保藏。30天后转接1mL富集培养物至新培养体系中, 以相同条件培养。进行两次传代富集, 每次传代收集5mL富集培养物于-80℃避光保藏, 以用于后续高通量测序分析。

1.3 潜在EHMC降解菌的分离培养

取第三代富集培养物进行梯度稀释, 选取10-6、10-7和10-8三个梯度的稀释培养液, 在MA平板上涂布, 于25℃避光培养5d。根据涂布平板上菌落的形态差异, 挑取不同菌落于MA平板上划线纯化, 在25℃避光条件下培养菌株, 直至获得纯培养的细菌菌落。对分离纯化的菌株进行编号和记录, 于30%甘油管内-80℃避光保藏。

1.4 潜在 EHMC降解菌的鉴定和系统进化分析

在MA平板上收集纯培养菌体, 采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA, 用通用引物27F和1492R对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增, PCR扩增产物经凝胶电泳检测后, 送至北京擎科生物科技股份有限公司进行基因测序。有效的测序结果经SeqMan 7.1软件拼接, 提交至EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对鉴定。根据序列比对结果, 选取具有最高同源性菌株的16S rRNA基因作为参比序列, 使用MEGA X软件(Kumar et al, 2018), 结合K2模型(Kimura 2-parameter model)估算系统进化矩阵, 设置自展值为1000次, 采用邻接法(neighbor-joining, N-J)(Saitou et al, 1987)进行聚类分析, 构建系统发育树, 并在iTOL网站(Letunic et al, 2019)对系统发育树进行美化。

1.5 EHMC降解菌群的高通量测序分析

根据1.4部分各富集样品的纯培养细菌分离鉴定情况, 以纯培养细菌种数大于2为富集情况良好的样品, 并选取该类样品进行高通量测序。使用TGuide S96 磁珠法土壤/粪便基因组 DNA 提取试剂盒, 提取原始珊瑚菌群和EHMC富集菌群的总DNA。在PacBio Sequel Ⅱ平台上进行高通量测序文库构建及测序(北京百迈客生物科技有限公司)。选择带Barcode的通用引物27F和1492R, 对样品中细菌16S rRNA基因全长区域进行PCR扩增。扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测并纯化回收。构建文库后提交至PacBio Sequel Ⅱ测序平台进行分析, 将获得的序列进行过滤、聚类及去噪, 并以SILVA 138.1数据库(Quast et al, 2013)为参考, 使用朴素贝叶斯分类去结合比对方法, 分类注释各类序列并进行物种注释及群落结构分析。使用Usearch软件(Edgar, 2013)对相似度为97.0%的有效序列(reads)进行聚类、并获取OTU(operational taxonomic unit)序列。利用QIIME2软件(Bolyen et al, 2019)对样品的多个α多样性指数进行计算评估, 生成不同分类水平上的物种丰度表, 再通过BMKCloud (www.biocloud.net) 绘制各分类学水平的群落结构图。

1.6 EHMC降解菌的活性筛选

将纯培养菌株在MA平板上活化, 挑取菌株至10mL MMC-EHMC培养基, 混合均匀, 保持其初始OD600(600nm下光密度值, optical density)处于0.1~0.2之间, 在转速160r·min-1 、25℃避光条件下培养30d, 以5d为间隔测定菌液OD600值, 根据OD600值的变化判定菌株是否可在EHMC为唯一碳源的MMC培养基内生长。

2 结果与分析

2.1 富集培养前后珊瑚共生菌群多样性

选取富集情况良好的三类珊瑚样品(滨珊瑚、角蜂巢珊瑚、鹿角珊瑚)进行高通量测序分析, 并对富集前后的微生物群落进行α多样性分析。以测序深度和物种数目构建的稀释曲线显示, 随测序深度增加, 各样品中的稀释曲线趋于平缓, 表明本次测序数据合理, 且该测序深度已满足多样性分析需求(图1)。
图1 原始珊瑚样品和EHMC富集样品的稀释曲线

前缀: Coral-代表原始珊瑚样品, EHMC-代表富集样品; 后缀: PL代表滨珊瑚, FA代表角蜂巢珊瑚, AC代表鹿角珊瑚

Fig. 1 Rarefraction curves of original coral and EHMC-enrichment samples

ACE(abundance-based coverage estimator)指数和Chao 1指数用于评估样品的物种丰富度; Simpson指数和Shannon指数用于衡量物种多样性。微生物群落的α多样性分析结果可由ACE指数、Chao 1指数、Simpson指数和Shannon指数四个指标呈现。如表2数据所示, 滨珊瑚样品Coral-PL的ACE指数和Chao 1指数的数值在三种珊瑚样品中最高, 其次分别是角蜂巢珊瑚样品Coral-FA和鹿角珊瑚样品Coral-AC。三个珊瑚样品的Simpson指数范围在0.8~0.9, 其Shannon指数也仅在3~6范围内波动, 且珊瑚样品之间的Simpson和Shannon指数值差异较小。该数据表明滨珊瑚的菌群丰度最高, 角蜂巢珊瑚和鹿角珊瑚的菌群丰度较低, 但三个珊瑚样品间的菌群多样性没有太大差异。经EHMC富集传代三次后, 三个EHMC富集样品间的α多样性指标数值相近, 均无明显差异(表2)。对比富集前后的珊瑚样品, EHMC富集菌群的ACE指数和Chao 1指数均低于原始珊瑚菌群, 富集过程中菌群的丰富度显著下降。EHMC富集菌群的Simpson指数最高仅0.67, Shannon指数最高也仅1.98, 均低于原始珊瑚样品。该两种指数的减少表明在EHMC高浓度驯化下, 细菌群落多样性下降。
表2 原始珊瑚样品和EHMC富集样品的微生物群落多样性指数

Tab. 2 Diversity indexes of microbial communities isolated from original coral and EHMC-enrichment samples

珊瑚物种 样品编号 ACE指数 Chao1指数 Simpson 指数 Shannon 指数
滨珊瑚 Coral-PL 1888 1423 0.84 3.88
EHMC-PL 75 95 0.53 1.34
角蜂巢珊瑚 Coral-FA 1040 1052 0.90 5.45
EHMC-FA 84 69 0.43 1.53
鹿角珊瑚 Coral-AC 808 837 0.93 5.92
EHMC-AC 82 81 0.67 1.98
高通量测序获得的OTU序列, 以相似度97%进行聚类和划分物种分类后, 将原始珊瑚样品和EHMC富集样品的菌群在不同分类水平上的分布情况列入表3。根据表3数据所示, 三个原始珊瑚样品中的细菌共被归属为32个门、71个纲、184个目、356个科、662个属, 其中角蜂巢珊瑚Coral-FA的细菌种类最丰富, 比另两个珊瑚样品多50个菌属数量。结合各样品细菌种类的相对丰度对优势类群进行划分, 以相对丰度高于5%为该样品的优势细菌类群, 原始珊瑚样品共3个优势菌门(不计入未分类细菌), 分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)。从纲水平结果分析, 原始珊瑚样品的主要菌纲分别为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)。而EHMC富集样品的菌群在门、纲、目、科、属分类上检测到的数量分别为7、9、29、49、71。如表3所示, 滨珊瑚、角蜂巢珊瑚和鹿角珊瑚的富集样品之间的细菌种类数目相近。据门、纲水平细菌的优势类群分析, 富集样品中共有3个优势菌门和4个优势菌纲, 分别为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门(Actinobacteriota), 以及γ-变形菌纲、α-变形菌纲、芽孢杆菌纲和放线菌纲(Actinobacteria)。
表3 原始珊瑚样品和EHMC富集样品中不同水平上的细菌种类数目

Tab. 3 The numbers of bacteria species at different levels in original coral and EHMC-enrichment samples

珊瑚物种 样品编号 门数目 纲数目 目数目 科数目 属数目
滨珊瑚 Coral-PL 26 48 118 193 335
EHMC-PL 5 7 21 33 43
角蜂巢珊瑚 Coral-FA 31 64 154 250 394
EHMC-FA 6 8 20 31 40
鹿角珊瑚 Coral-AC 19 38 99 174 346
EHMC-AC 4 6 16 25 37
EHMC富集前后样品对比发现, 富集样品的菌类数目明显下降了1个数量级, 且优势菌群发生了一定程度的改变。高浓度的EHMC胁迫培养下, 所有样品的拟杆菌门和拟杆菌纲的细菌丰度下降, 而放线菌门和放线菌纲的丰度上升。结合α多样性分析和菌群类别分布情况可得, 高浓度EHMC胁迫下各珊瑚样品的细菌群落多样性均显著下降, 细菌优势类群改变, 且EHMC对珊瑚菌群结构的影响可能具有广谱性。

2.2 富集培养前后珊瑚共生菌群组成差异

原始珊瑚样品的细菌多样性丰富, 菌群结构复杂, 且不同珊瑚来源的细菌种类具有差异。从门水平对三个原始珊瑚样品的细菌组成进行比较(图2), 滨珊瑚Coral-PL和鹿角珊瑚Coral-AC的细菌优势类群凸显, 变形菌门的细菌占据巨大优势, 相对丰度分别高达95.90%、81.62%。与之相比, 角蜂巢珊瑚Coral-FA的菌门结构层次分明, 厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门等分布均匀, 相对丰度分别为29.79%、28.78%、25.78%。从纲水平对三个珊瑚样品的细菌组成进行比较(图3), γ-变形菌纲和α-变形菌纲的细菌在三个珊瑚样品中优势显著, 拟杆菌纲的细菌仅在Coral-FA中占优势。与门分类水平结果相似, Coral-FA的菌纲丰度分布更加均匀。珊瑚样品的属水平群落结构如图4所示(不计Others), 以相对丰度高于4%的属定义为优势菌属, 除去未分类的菌属, Coral-PL样品共5个优势菌属, 分别为弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、附小杆菌属(Epibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海源菌属(Idiomarina); Coral-FA共3个优势菌属, 微小杆菌属(Exiguobacterium)、弧菌属和突柄绿菌属(Prosthecochloris); Coral-AC的优势菌属共4个, 分别为交替单胞菌属(Alteromonas)、Thalassotalea属、弧菌属和Algicola属。原始珊瑚样品的菌群多样性高, 优势菌属的优势性不突显, 且不同珊瑚样品之间的优势菌属差异较大, 鹿角珊瑚的菌属结构最复杂。
图2 原始珊瑚/EHMC富集样品在门水平上的细菌群落分布

图中仅列出相对丰度> 0.1%的菌属类群; Others为相对丰度< 0.1%的菌属类群; 前缀中Coral-代表原始珊瑚样品, EHMC-代表富集样品; 后缀中PL代表滨珊瑚, FA代表角蜂巢珊瑚, AC代表鹿角珊瑚

Fig. 2 Distribution of bacterial community in original coral samples and EHMC-enrichment samples based on phylum level (relative abundance > 0.1%)

图3 原始珊瑚/EHMC富集样品在纲水平上的细菌群落分布

图中仅列出相对丰度> 0.1%的菌属类群; Others为相对丰度< 0.1%的菌属类群; 前缀中Coral-代表原始珊瑚样品, EHMC-代表富集样品; 后缀中PL代表滨珊瑚, FA代表角蜂巢珊瑚, AC代表鹿角珊瑚

Fig. 3 Distribution of bacterial community in original coral samples and EHMC-enrichment samples based on class level (relative abundance > 0.1%)

图4 原始珊瑚/EHMC富集样品在属水平上的细菌群落分布

图中仅列出相对丰度> 0.1%的菌属类群, 丰度< 0.1%归入Others且不列出; 前缀中Coral-代表原始珊瑚样品, EHMC-代表富集样品; 后缀中PL代表滨珊瑚, FA代表角蜂巢珊瑚, AC代表鹿角珊瑚

Fig. 4 Distribution of bacterial community in original coral samples based on genus level

经EHMC富集后, 三个样品的细菌结构趋于单一, 且放线菌门(Actinobacteriota)细菌丰度显著增加。从门水平上分析(图2), 三个富集样品的优势菌门均减至2类, 变形菌门仍为主要优势菌门。此外, 放线菌门在EHMC-PL和EHMC-AC样品中的丰度上升, 而厚壁菌门仅在EHMC-FA中占优。从纲水平分类进行分析(图3), 3个样品的优势菌纲数目均为2个, 但种类不同: α-变形菌纲是三个样品中的主要优势菌纲, 而放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲和γ-变形菌纲, 分别在EHMC-PL、EHMC-FA和EHMC-AC样品中占优势。富集样品的属水平群落结构如图4所示(不计Others), 3个富集样品之间的优势菌属差异明显。以相对丰度高于5%的属定义为优势菌属, EHMC-PL样品优势菌属仅壤霉菌属(Agromyces)和副球菌属(Paracoccus); EHMC-FA样品的优势菌属共4个, 微小杆菌属、短波单胞菌属(Brevundimonas)、Pelagibaca属和副球菌属; EHMC-AC样品的优势菌属共4个, 分别为假交替单胞菌属、赤杆菌属(Erythrobacter)、附小杆菌属和Pelagibaca属。
珊瑚样品经EHMC进行多次驯化后, 细菌群落结构趋于简单, 优势类群突出且细菌组成发生变化, 放线菌相对丰度显著提升, 而拟杆菌明显减少。对比富集前后的菌属水平, 各样品富集前后的优势菌属改变, 高浓度的EHMC导致抗逆性弱的细菌消亡。而部分细菌因对EHMC具有较高耐受性或具有降解能力, 逐渐成为菌群中的优势种类。如壤霉菌属、副球菌属、Pelagibaca属和赤杆菌属等细菌在原始珊瑚中占比极低, 通过EHMC多次富集后成为优势菌属。这些优势菌属对EHMC具有耐受性, 还可能是潜在的EHMC降解菌, 但其具体功能还需要通过分离培养进行验证。

2.3 EHMC富集样品中可培养细菌的分离鉴定与活性验证

全部珊瑚样品经EHMC富集传代三次后, 利用MA培养基分离纯化共获得60株纯培养细菌。通过Ezbiocloud和NCBI网站对细菌的16S rRNA基因序列进行比对, 结果显示该60株细菌分别与17个已知物种的亲缘相近, 这些细菌归属于3个门、3个纲、6个目、8个科、13个属(图5)。其中2株细菌的最近缘物种分别为Paracoccus aerius 011410(97.59%)和Agromyces indicus NIO-1018(98.35%), 相似度低于参考值98.65%(Kim et al, 2014), 是副球菌属和壤霉菌属的潜在新物种。所有珊瑚样品分离的细菌中的优势菌门为厚壁菌门, 占所有可培养菌株的52%, 其次是放线菌门(28%)和假单胞菌门(20%)。从属水平的分类等级分析(图6), 芽孢杆菌属(Bacillus)优势最明显, 占比为34%; 其次是红球菌属(Rhodococcus)、微小杆菌属、副球菌属和尖球菌属(Acuticoccus)。芽孢杆菌属的细菌分离自多个珊瑚的富集样品, 分布较广泛。而其他菌属, 例如尖球菌属、红球菌属、Phycicoccus属、胞囊杆菌属(Cytobacillus)和Niallia属等仅出现在鹿角珊瑚中; 壤霉菌属和Gulosibacter属则仅分离自滨珊瑚。
图5 采用邻接法基于60个菌株的16S rRNA 基因序列构建系统发育树

Fig. 5 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences of 60 strains

图6 分离获得的潜在EHMC降解菌株在门、属水平的分布情况

Fig. 6 Taxonomy of potential EHMC-degrading bacteria based on phylum and genus level

不同珊瑚来源的EHMC降解菌分离情况显示, 滨珊瑚、角蜂巢珊瑚、鹿角珊瑚来源的EHMC富集样品中可培养细菌种类最丰富, 细菌种数分别为4、5、8, 且副球菌属和壤霉菌属的两个潜在新物种均分离自滨珊瑚。而盘星珊瑚、杯形珊瑚、盔形珊瑚、牡丹珊瑚和蔷薇珊瑚等来源的富集样品均仅分离出1个细菌物种。滨珊瑚和角蜂巢珊瑚的EHMC富集样品中, 细菌的分离培养结果与高通量测序结果相近, 其纯培养细菌大部分为高通量分析中的优势类群。滨珊瑚的富集样品中, 优势菌属壤霉菌属和副球菌属均被成功分离培养; 角蜂巢珊瑚的富集样品中, 优势菌属微小杆菌属、短波单胞菌属和副球菌属被成功分离培养。分离自鹿角珊瑚富集样品的纯培养细菌则与高通量分析中的优势菌属具有较大差异。
经32d的EHMC单一碳源培养, 根据细菌的生长状况, 以OD600值增长且在无碳源对照组中不变的细菌为潜在降解细菌, 从60株可培养细菌中初步筛选出8株潜在的EHMC降解菌, 归属于7个菌属, 分别为芽孢杆菌属、短波单胞菌属、副球菌属、尖球菌属、Phycicoccus属、红球菌属和分枝杆菌属(Mycolicibacterium)。细菌细胞的生长密度变化如图OD600数值结果显示, 8株细菌的细胞密度呈现缓慢增长(图7), 具体的菌株来源及种属信息列于表4中。培养情况显示分枝杆菌属菌株SCSIO 19779生长情况最佳, 培养30d后OD600达到0.7, 其次是芽孢杆菌属菌株SCSIO 19749和副球菌属的两株细菌SCSIO 19762和SCSIO 19789, 其中SCSIO 19762是副球菌属中一个潜在新物种。该8个菌株是否对EHMC具有降解能力, 仍需进一步开展降解动力学验证。
图7 潜在EHMC降解菌活性验证

Fig. 7 Active test of potential EHMC-degrading strains

表4 潜在EHMC降解菌株信息

Tab. 4 The information of potential EHMC-degrading strains

菌株来源 菌株编号 种名 相似度/%
杯形珊瑚 SCSIO 19749 Bacillus altitudinis 41KF2b 100.00
角蜂巢珊瑚 SCSIO 19792 Brevundimonas diminuta ATCC 11568 99.77
角蜂巢珊瑚 SCSIO 19789 Paracoccus rhizosphaerae CC-CCM15-8 99.17
鹿角珊瑚 SCSIO 19765 Acuticoccus sediminis PTG4-2 100.00
鹿角珊瑚 SCSIO 19799 Phycicoccus jejuensis NRRL B-24460 99.13
鹿角珊瑚 SCSIO 19755 Rhodococcus hoagii DSM 20295 99.42
牡丹珊瑚 SCSIO 19779 Mycolicibacterium poriferae ATCC 35087 99.86
滨珊瑚 SCSIO 19762 Paracoccus aerius 011410 97.59

3 讨论

3.1 EHMC对珊瑚共生菌群落结构的影响

本文发现在三亚鹿回头不同种类的珊瑚中, 珊瑚共生菌在门、纲分类水平上的优势类群相似性较高, 变形菌门、γ-变形菌纲和α-变形菌纲等类型的细菌均占据极大丰度优势。珊瑚礁生态系统具有极丰富的微生物多样性。这些微生物与珊瑚宿主构成了稳定的共生关系, 并在珊瑚宿主的健康生长和功能调节中发挥了关键的作用(Kanisan et al, 2023)。即使是不同珊瑚来源的微生物类群, 其在门、纲水平上的组成也具有一定的共性。与本文的研究结果相似, 多个不同海域的健康珊瑚细菌类群组成中, 主要优势菌门类群均为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门(Bayer et al, 2013; 陈飚, 2021), 而优势菌纲则主要由γ-变形菌纲和α-变形菌纲构成(Van De Water et al, 2018)。然而, 进一步分析滨珊瑚、角蜂巢珊瑚和鹿角珊瑚三个样品的在属分类水平上的菌群结构发现, 三种珊瑚的优势菌属差异较大。这种差异也导致经EHMC处理后, 三种珊瑚样品之间的优势菌属没有过多相似性。在一项对澳大利亚宁格鲁礁珊瑚细菌群落结构的长期采样观测的中, 也发现了同区域珊瑚的细菌群落构成相似, 但优势类群不同(Ceh et al, 2011)。珊瑚的微生物群落同时受珊瑚宿主本身和各种环境因素的影响, 不同的珊瑚物种因其特殊生长需求和形态结构, 因此会吸引不同种类的微生物定植(Rohwer et al, 2002)。
经EHMC多次驯化后, 三种珊瑚的共生菌多样性下降, 细菌群落结构趋于简单, 且富集前后的优势细菌种类差异明显。受人为因素影响, 当前大量如有机氯农药、多氯联苯、多环芳烃、有机紫外吸收剂等有机污染物进入南海珊瑚礁生态系统(Kang et al, 2022)。在污染物的长期胁迫下, 环境中的微生物结构会发生改变, 进一步影响该环境内的菌群功能(Yakimov et al, 2005)。在不同微塑料处理下的河流沉积物中, 细菌群落组成发生一定程度的变化, 丰富度显著下降, 且其微生物的各项代谢功能也受到影响(李汶璐 等, 2022)。同样, 一项对波斯湾珊瑚进行石油处理的研究中发现, 经石油富集后的珊瑚细菌群落, 从以弧菌属为主导的细菌组成, 变成由假交替单胞菌属、假单胞菌和交替单胞菌属等更利好石油环境的细菌类群为主导(Al-Dahash et al, 2013)。长期暴露于高浓度有机污染下的部分微生物会对污染物产生适应性, 当污染物达到一定浓度时, 会激发降解细菌对污染物的降解利用能力(田蕴 等, 2004)。本研究中部分细菌可能因无法转化利用EHMC作为碳源生长, 或不耐受EHMC而死亡; 而放线菌门、放线菌纲的细菌丰度在EHMC富集后显著提升, 该类群的优势细菌可能产生了独特的EHMC应对策略, 进而在高浓度EHMC胁迫下占领生存优势。

3.2 珊瑚中潜在的EHMC降解菌株资源

本研究采用单一碳源富集培养的方式, 自EHMC富集的珊瑚样品中分离出芽孢杆菌属、红球菌属和副球菌属的细菌。在进一步的活性验证中, 也发现了几株归属于芽孢杆菌属、副球菌属、尖球菌属、红球菌属和分枝杆菌属的细菌能在以EHMC唯一碳源培养基内生长。珊瑚拥有丰富的细菌资源, 但珊瑚来源的降解功能微生物资源报道仍十分稀缺, 其潜藏的功能微生物还有待开发。目前已有研究自乌姆迈拉迪姆岛的珊瑚中分离出弧菌属、芽孢杆菌属、赤杆菌属、假交替单胞菌属和假单胞菌属等细菌, 并证实了这些细菌具有降解多种脂肪族、芳香烃甚至天然石油的功能(Al-Dahash et al, 2013)。因此, 从珊瑚中分离可降解EHMC的微生物具有可行性。本研究获得的纯培养菌株中, 红球菌属、芽孢杆菌属和副球菌属的细菌都曾被报道具有烷烃类或多环芳烃等有机物的降解能力(Teng et al, 2010; 崔倩倩 等, 2020; Lyu et al, 2022), 是潜在的EHMC降解菌株资源, 但这些细菌对EHMC的降解能力和代谢机制仍未明晰。为此, 本团队目前正针对已获得的潜在EHMC降解菌株进行更深入降解机制相关研究。
对比细菌的分离培养结果, 仍有部分高通量测序中丰度较高的细菌并未被成功培养。这可能与富集培养条件及分离选用的培养基有关。培养基的营养成分对可培细菌的数量及种类具有重要影响(周楠 等, 2016), 而本研究仅使用海生菌琼脂(MA)作为分离培养基, 其营养成分与富集培养基相差较大, 可能不利于部分菌株的分离。为获得更多可降解有机紫外吸收剂的细菌, 还需要了解可降解有机紫外吸收剂的主要细菌类群, 通过设计针对性的培养方案以进一步获得更多具有降解功能菌株。
本研究是首次从微生物角度揭示了EHMC对珊瑚的潜在影响, 并成功分离获得潜在的EHMC降解菌资源, 为深入探究EHMC对珊瑚的生态影响和EHMC的生物修复技术提供了理论基础和资源支持。然而, 要全面了解EHMC对珊瑚健康状况的影响, 还需要结合更多的环境因素以及珊瑚自身的实际情况进行综合分析。因此, 未来的研究应该着重于整合多个方面的数据, 以全面评估EHMC对珊瑚生态系统的潜在风险和影响。

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