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热带海洋学报 >

2025 , Vol. 44 >Issue 1: 24 - 34

DOI: https://doi.org/10.11978/2024067

海洋生物学

长牡蛎(Crassostrea gigas)环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)的基因克隆与功能研究

  • 白晶 , 1, 2 ,
  • 毛帆 2 ,
  • 刘客林 2 ,
  • 宋菁晨 2 ,
  • 喻子牛 2 ,
  • 张扬 , 2
展开
  • 1.暨南大学, 广东 广州 510632
  • 2.中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301
张扬。email:

白晶(1998—), 女, 黑龙江省牡丹江市人, 硕士, 从事贝类免疫研究。email:

Copy editor: 孙翠慈

收稿日期: 2024-03-22

  修回日期: 2024-04-10

  网络出版日期: 2024-05-21

基金资助

国家重点研发项目(2022YFD2400301)

国家自然科学基金(32073002)

国家自然科学基金(U22A20533)

第九届青托工程项目(2023QNRC001)

广州市科技计划项目(2023A04J0096)

广州市科技计划项目(2024A04J6278)

收起

Molecular cloning and functional study of cyclic GMP-AMP synthase from Crassostrea gigas

  • BAI Jing , 1, 2 ,
  • MAO Fan 2 ,
  • LIU Kelin 2 ,
  • SONG Jingchen 2 ,
  • YU Ziniu 2 ,
  • ZHANG Yang , 2
Expand
  • 1. Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 2. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Guangzhou 510301, China
ZHANG Yang. email:

Copy editor: SUN Cuici

Received date: 2024-03-22

  Revised date: 2024-04-10

  Online published: 2024-05-21

Supported by

National Key Research and Development Program of China(2022YFD2400301)

National Natural Science Foundation of China(32073002)

National Natural Science Foundation of China(U22A20533)

9th Young Elite Scientists Sponsorship Program(2023QNRC001)

Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China(2023A04J0096)

Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China(2024A04J6278)

Fold

摘要

环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)是一种关键的细胞内传感器, 能够识别细胞质内异常存在的DNA并触发免疫反应。为了揭示cGAS在软体动物先天性免疫调控中的重要作用, 本研究成功克隆了长牡蛎中的cGAS基因(CgcGAS), 其开放阅读框(open reading frame, ORF)全长1623bp, 编码540个氨基酸, 理论相对分子质量为62.3kDa, 并具有保守的Mab21结构域。系统进化分析表明了CgcGAS为软体动物cGAS家族中的一员。定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果显示CgcGAS广泛表达于各组织, 并在消化腺的相对表达量最高。亚细胞定位实验观察到CgcGAS蛋白在细胞核和细胞质中都有分布, 主要定位于细胞核, 提示其可能在细胞核内的DNA感应以及细胞质内的DNA结合和信号传递中发挥作用。另外, 双荧光素酶报告基因系统和RNA干扰实验结果显示, CgcGAS能够显著激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和干扰素刺激性反应元件(interferon-sensitive response element, ISRE)信号通路, 及其下游的炎症相关因子干扰素诱导病毒抑制蛋白(virus inhibitory protein endoplasmic reticulum-associated interferon-inducible, viperin)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白细胞介素-17 (interleukin-17, IL-17)及转录因子干扰素调节因子2/8 (interferon regulatory factor 2/8, IRF2/8)的表达。综上所述, CgcGAS在长牡蛎的先天性免疫反应中的信号传递过程中发挥了关键作用。

关键词： 长牡蛎; 先天性免疫; 环GMP-AMP合酶; 基因克隆; 功能

本文引用格式

白晶 , 毛帆 , 刘客林 , 宋菁晨 , 喻子牛 , 张扬 . 长牡蛎(Crassostrea gigas)环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)的基因克隆与功能研究[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(1) : 24 -34 . DOI: 10.11978/2024067

Abstract

Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a critical intracellular sensor that can recognize abnormally located DNA in the cytoplasm and trigger immune responses. To elucidate the critical role of cGAS in the regulation of innate immunity in mollusks, we successfully cloned and analyzed Crassostrea gigas cGAS (CgcGAS). The open reading frame (ORF) of CgcGAS was 1623bp and encoded 540 amino acids with a theoretical molecular weight of 62.3 kDa and a conserved Mab21 domain. Phylogenetic analysis confirmed that CgcGAS was a member of the molluscan cGAS family. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) results revealed widespread expression of CgcGAS in various tissues, with the highest relative expression in the digestive glands. Subsequently, subcellular localization experiments showed that CgcGAS was observed in both the nucleus and cytoplasm, with a predominant nuclear localization, suggesting that CgcGAS may have played a role in DNA sensing in the nucleus and DNA binding and signaling in the cytoplasm. Furthermore, dual-luciferase reporter gene assays and RNA interference experiments revealed that CgcGAS could activate the NF-κB and ISRE signaling pathways, as well as the expression of downstream inflammation-related factors, such as virus inhibitory protein endoplasmic reticulum-associated interferon-inducible (viperin), tumor necrosis factor (TNF), interleukin-17 (IL-17), and the transcription factor interferon regulatory factor 2/8 (IRF2/8). In conclusion, CgcGAS played a critical role in the signal transduction process of innate immune responses in Crassostrea gigas.

Key words： Crassostrea gigas; innate immunity; cyclic GMP-AMP synthase; gene cloning; function

先天免疫是无脊椎动物抵御病原体的第一道防线(Canesi et al, 2002; Li et al, 2018a)。其中, 模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)可以检测病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP), 从而激活免疫通路, 抵御病原入侵(Wu et al, 2014a; Cai et al, 2021)。动物中的PRRs可分为四个主要的亚家族, 包括Toll样受体、核苷酸结合域富含亮氨酸重复序列/NOD样受体、视黄酸诱导基因-I样受体和C型凝集素受体等(Li et al, 2021)。但是最近发现了全新且广泛存在于生物体内的PRRs家族cGAS样受体(cGAS-like receptors, cGLR) (Li et al, 2023)。cGAS是核苷酸转移酶家族(nucleotidyl transferase, NTase)成员, 在细胞中通常以无活性状态存在, 它能以非序列特异性的方式识别胞质中错误定位的双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA), 包括多种DNA病毒、某些逆转录病毒、细菌病原体等(Liu et al, 2020)。cGAS与DNA结合后构象改变为活性状态, 催化GTP和ATP转化为cyclic GMP-AMP (cGAMP) (Li et al, 2018b; Hopfner et al, 2020; Liu et al, 2020)。环二核苷酸(cyclic dinucleotides, CDNs)首先在细菌中被描述, 细菌直接产生的CDNs包括cyclic diGMP、cyclic diAMP和3′3′-cGAMP (Wu et al, 2013; Motwani et al, 2019 )。而哺乳动物cGAS催化产生2′3′-cGAMP, 在化学结构上与细菌产生的3′3′-cGAMP不同(Diner et al, 2013; Gao et al, 2013)。不过, 2'3'-cGAMP以及细菌直接产生的CDNs均可结合并激活内质网上的适应性蛋白-干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes, STING), 从而招募并激活蛋白激酶IκB激酶(IkappaB kinase, IKK)和TANK结合激酶1 (TANK-binding kinase 1, TBK1), 后者又激活转录因子NF-κB和IRF3, 以诱导I型干扰素(interferon, IFN)及其他炎症信号转导(Zhang et al, 2013; Yu et al, 2019)。
虽然海葵和人在进化上分化超过五亿年, 但是二者均鉴定到了cGAS和STING蛋白(Kranzusch et al, 2015), 揭示了cGAS具有古老的起源。最近发现果蝇cGAS样受体1-cGLR1作为双链RNA传感器识别dsRNA产生3'2'-cGAMP激活STING并限制病毒复制, 提示了cGAS同源物可能在动物先天免疫中发挥广泛作用(Slavik et al, 2021)。值得注意的是, cGLRs广泛存在于后生动物中, 一些刺胞动物和双壳类动物, 例如珊瑚Stylophora pistillata和长牡蛎(Crassostrea gigas)的基因组中编码大量cGLR(cGAS-like receptors) (Li et al, 2023), 表明cGAS可能在后生动物中发挥重要作用, 然而它们的具体功能尚无详细报道。
长牡蛎属于软体动物门无脊椎动物, 目前的研究结果表明无脊椎动物没有特异性免疫系统, 只依赖天然免疫来防御病原感染, 维持机体的健康和正常生命活动。长牡蛎基因组中cGLR家族的数量扩张, 从免疫系统进化和自身免疫防御机制两个角度都具有非常重要的研究价值。
因此, 本研究克隆了长牡蛎cGAS家族成员之一, 初步研究了它的序列特征、进化地位及功能, 为牡蛎体内cGAS-STING信号通路的研究提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用长牡蛎均取自山东省青岛市, 暂养于循环人工海水中以适应实验室条件, 温度保持22~25℃、盐度为25‰。实验个体2龄, 平均壳高10cm。两周后随机选取9个个体, 收集围心腔血淋巴液, 并立即4000g离心10min以收集血淋巴细胞。同时收集100mg鳃、外套膜、闭壳肌、心脏、消化腺、性腺和唇瓣等组织置于1mL Trizol中并用冷冻研磨仪研磨组织, 共三个重复, 提取总RNA进行基因克隆与组织分布分析。

1.2 总RNA的提取

采用TRizol (Invitrogen)法提取组织RNA。具体操作如下: 向TRizol匀浆的组织中加入200µL氯仿, 剧烈振荡15s, 混匀后室温放置5min; 随后在4℃条件下12000g离心10min, 吸取上层透明液至一个新EP管中; 向新EP管中加入500µL预冷的异丙醇, 混匀后静置30min; 4℃ 12000g离心12min, 弃上清, 75%乙醇悬浮沉淀, 洗去杂质; 4℃ 12000g离心5min, 弃上清, 加入20µL 二甲基亚硝基乙酰胺处理水溶解RNA。用Nanodrop 2000 (Thermo Scientific)检测RNA浓度并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.3 长牡蛎环GMP-AMP合酶(CgcGAS)基因克隆

CgcGAS (基因编号为XM_034454337.1)序列信息来自NCBI(National Center for Biotechnology Information database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
cDNA模板的合成: 以牡蛎RNA为模板, 使用定量PCR专用反转录试剂PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time, Takara)根据说明书合成cDNA。先进行DNA酶切酶(DNase I)消化, 反应体系如下: 冰上配制如下反应液混合液, 5×gDNA Eraser Buffer 2μL、 gDNA Eraser 1μL、 Total RNA 1μg、补充无酶无菌水(RNase Free dH2O)至10μL, 在42℃孵育2min; 随后进行反转录反应, 反应液配制在冰上进行, 反应体系如下: DNase I消化后的反应液10μL、 PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL、 RT Primer Mix 1μL、5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4μL、RNase Free dH2O 4μL, 37℃反应15min, 85℃反应5s, 反应产物4℃保存。
CgcGAS基因克隆: cDNA模板稀释10倍作为PCR模板, 使用Primer Primer 5.0设计引物, 见表1。利用2×Taq Plus Master Mix (Dye Plus, Vazyme)进行PCR从而获得目的基因, 反应体系如下: 2×Taq Plus Master Mix 12.5μL、上游引物(10μmol·L-1) 1μL、下游引物(10μmol·L-1) 1μL、 模板DNA 1μL、 ddH2O 9.5μL。PCR程序为: 95℃ 3min; (95℃ 15s、降落60—45℃ 15s、72℃ 100s)进行30个循环; 72℃ 5min后终止反应。通过琼脂糖凝胶检测PCR产物, 回收纯化目的片段, 将目的片段与pMD19-T载体连接, 然后转化到DH5α感受态细胞中, 用氨苄青霉素选择性培养基过夜培养后挑选阳性菌落进行菌液PCR, 挑选与目标片段大小一致的菌液送至天一辉远生物科技有限公司测序。
表1 引物信息

Tab. 1 Sequences of designed primers used in this study

引物名称 序列(5′-3′) 用途
cGAS-F1 ATGGTAATCAAATGTCCTAATTGTG ORF克隆
cGAS-R1 TTATTGTAAGAGACCCTCTAGTTCC ORF克隆
pEGFP-N1-cGAS-F TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTGCCACCATGGTAATCAAATGTCC pEGFP-N1-cGAS重组质粒
pEGFP-N1-cGAS-R ATGGTGGCGACCGGTGGATCCGATTGTAAGAGACCCTCTAGTTCCCT pEGFP-N1-cGAS重组质粒
PCDNA3.1/V5-His-cGAS-F GCACAGTGGCGGCCGCTCGAGATGGTAATCAAATGTCCTAATTGTGAC pcDNA3.1/V5-His-cGAS重组质粒
PCDNA3.1/V5-His-cGAS-R AGGCTTACCTTCGAAGGGCCCTTGTAAGAGACCCTCTAGTTCCCTG pcDNA3.1/V5-His-cGAS重组质粒
dscGAS-F CGACAAAACAAAGATCGACTACAAC cGAS-RNAi
dscGAS-R CAGTCTGGATTTCTCTTGCATCCTT cGAS-RNAi
dscGAS-F-T7 TAATACGACTCACTATAGGCGACAAAACAAAGATCGACTACAAC cGAS-RNAi
dscGAS-R-T7 TAATACGACTCACTATAGGCAGTCTGGATTTCTCTTGCATCCTT cGAS-RNAi
dsGFP-F GCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG GFP-RNAi
dsGFP-R TTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGC GFP-RNAi
dsGFP-F-T7 TAATACGACTCACTATAGGGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG GFP-RNAi
dsGFP-R-T7 TAATACGACTCACTATAGGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGC GFP-RNAi
cGAS-F2 GGAAAGACGACAGGGACGG qRT-PCR
cGAS-R2 TGTCTGGAGAACCCCTTTGG qRT-PCR
viperin-F CTGAAACCCATCAGTGTCAACTACC qRT-PCR
viperin-R GACAATGAAGGGCTCGCCAC qRT-PCR
IRF2-F ACTTCCGCTGTGCCCTGAAT qRT-PCR
IRF2-R TATGACCTTTGGCACTGTCGTTC qRT-PCR
IL-17-F AAACATGCTGGAATACCTCGAGT qRT-PCR
IL-17-R GTGGGACGCTACGAGGAAATA qRT-PCR
TNF-F GTATTACTGAGGAATGGCGTGAAAC qRT-PCR
TNF-R CAAAATCCCTGTCACTACAACCG qRT-PCR
IRF8-F GGACAGCGGTCAGACACGAC qRT-PCR
IRF8-R CCTTGAATATTGTGGAGTCTGCCT qRT-PCR
β-actin-F GGATTGGCGTGGTGGTAGAG qRT-PCR
β-actin-R GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC qRT-PCR

注: “F”表示上游引物, “R”表示下游引物

1.4 cGAS基因的生物信息学分析

进化树构建: 收集代表性动物的基因组蛋白注释文件, Bioedit构建本地数据库, 利用人、小鼠、斑马鱼、海葵的cGAS序列作为参考序列, 进行本地数据库搜索(Benedetti et al, 2020), 获取进化史上代表性物种的cGAS基因家族, 并将筛选的序列在NCBI上进行反向验证, 确定基因序列的准确性; 随后使用mafft软件进行多序列比对(Katoh et al, 2013), 用MAGE11软件进行系统进化树的构建(Tamura et al, 2021)。使用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)进行蛋白结构域的预测和绘图。

1.5 实时荧光定量PCR

按照上文方法合成cDNA, cDNA模板经稀释后使用, β-actin作为内参基因, 引物见表1。根据2×Power Green qPCR Mix试剂盒(GDSbio)操作说明制备反应液, 于罗氏荧光定量PCR仪(LC480)中进行基因定量检测, 反应体系为: 2×Power Green qPCR Mix 10μL, 上游引物(10μmol·L-1) 1μL, 下游引物(10μmol·L-1) 1μL, cDNA模板1μL, ddH2O 7μL。将上述反应体系上样至96孔板中, 封膜后, 短暂离心, 置于PCR仪中进行反应。反应程序为94℃预变性3min; 94℃变性15s, 56℃退火15s, 72℃延伸20s, 进行40个循环; 85℃, 15s后终止反应。数据以2-ΔΔct法计算目的基因的表达量, 其中以血淋巴细胞为对照组。

1.6 亚细胞定位

构建pEGFP-N1-cGAS重组质粒, 并将其转染至HEK293T细胞中过表达。培养48h后, 弃去细胞培养基, 用1mL缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)清洗细胞3次; 然后用500µL 4%多聚甲醛固定细胞, 室温静置15min; 再加入PBS清洗细胞3次后使用DAPI对细胞核染色, 室温避光孵育20min。随后弃去染液, 缓慢加1mL PBS清洗细胞3次以去除背景杂质。最后, 在徕卡激光共聚焦显微镜下镜检分析目的蛋白的表达情况。

1.7 双荧光素报告基因

构建pcDNA3.1/V5-His-cGAS重组质粒, 转染至HEK293T细胞中过表达。转染体系见表2。48h后弃去细胞培养基, 向48孔板缓慢加入1mL 1×PBS/孔, 小心清洗细胞3次。根据Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)说明书进行细胞裂解, 每孔加入65μL 1×PLB, 室温裂解15min; 随后, 吸取20µL裂解液至白底96孔板中, 每孔加入50μL LARII溶液, 检测萤火虫荧光素酶发光强度; 最后, 每孔加入50µL 1×Stop&Glo溶液, 检测海肾荧光素酶发光强度。通过计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶发光强度的比值得到每孔相对发光强度。
表2 双荧光素报告基因质粒转染体系

Tab. 2 Plasmids transfection in dual luciferase reporter assay

组别 pNF-κB-luc/ISRE-luc/ng 目的质粒/ng 对照空质粒/ng 内参质粒RT-TK/ng
对照组 200 0 400 20
实验组1 200 100 300 20
实验组2 200 200 200 20
实验组3 200 400 0 20

1.8 RNA干扰

使用Primer Primer 5.0设计一对引物从CgcGAS基因ORF中扩增400bp的片段, 再设计一对引物在5’末端加入T7启动子[5′-TAATACGACTCACTATAGGN(17-22)-3′], 引物见表1。按照相同方法在pEGFP-N1中克隆400bp作为对照。
根据T7 RiboMAXTM Express RNAi System (Promega)合成dsRNA, 反应体系如下: T7 2×Buffer 10μL, DNA模板1μg, Enzyme Mix T7 Express 2μL, 补充Nuclease Free水至20μL, 轻柔混匀。PCR程序为: 37℃反应30min, 70℃孵育10min, 后使用降落PCR在20min内使温度从70℃降到20℃(每个循环降0.5℃, 12s一个循环), 合成dsRNA。随后, 去除ssRNA和DNA模板: 稀释RNase solution(1∶200), 每20µL反应体系加入1µL新鲜的稀释液和1µL RNase-Free DNase, 37℃孵育30min。最后, 进行dsRNA的纯化, 操作流程如下: 加入0.1体积的3mol·L-1 乙酸钠 (pH5.2)和1体积的异丙醇混匀并置于冰上5min, 以最高转速离心10min; 弃去上清, 使用0.5mL 70%冷乙醇洗涤沉淀, 移除乙醇, 室温条件风干15min; 将RNA重悬于100µL的无核酸酶水中, -80℃冰箱储存产物, 用于后续注射。
选取生理状态良好的长牡蛎20只, 随机分为两组, 每只长牡蛎通过闭壳肌注射100μg cGAS-dsRNA或GFP-dsRNA, 注射后静置30min放回牡蛎培养箱中。5d后收集牡蛎血淋巴细胞并进行后续实验。RNA干扰效率通过荧光定量PCR验证。

1.9 数据分析

使用GraphPad Prism(9.0.0)进行数据处理和统计分析, 所有数据均以平均值 (±) SEM(standard error of the mean)表示。采用Student’s t检验来确定两组间的显著性, 使用one-way ANOVA和Tukey事后检验来进行两组以上的比较。*表示P<0.05, 表示具有显著性差异; **表示P<0.01, ***表示P<0.001, ****表示P<0.0001, 表示具有极显著差异; 不同字母代表组间具有显著性差异, P<0.05。

2 结果

2.1 cGAS基因的克隆和生物学信息分析

通过基因克隆得到了长牡蛎cGAS基因(以下称为CgcGAS)的开放阅读框(open reading frame, ORF)序列, CgcGAS的ORF长度为1263bp, 编码540个氨基酸, 预测其相对分子质量为62.3kDa, 核苷酸序列及推导的氨基酸序列如图1所示。通过对CgcGAS结构域预测和分析, 发现其有一个Mab21保守结构域和N端两个连续的锌指结构域(图2)。对CgcGAS氨基酸序列与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、斑马鱼(Danio rerio)、深海偏顶蛤(Bathymodiolus platifrons)和香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)的cGAS序列进行比对, 发现CgcGAS在进化中保守, 不同物种cGAS的NTase活性位点残基保守, 但CgcGAS同香港牡蛎和深海偏顶蛤的cGAS基因均缺少C末端的锌带结构域(zinc-ribbon domain), 这种结构通常定义为H(X5)CC(X6)C (Wu et al, 2014b)(图3)。
图1 长牡蛎cGAS开放阅读框序列全长和推导的氨基酸序列

锌指结构域用蓝色方框标出, Mab21结构域用紫色方框标出; *表示蛋白翻译终止, 起始密码子ATG和终止密码子TAA为红色字体

Fig. 1 Full length of the Crassostrea gigas cGAS open reading frame sequence and deduced amino acid sequence. The zinc finger structure is marked with a blue box and the Mab21 structural domain is marked with a purple box. * indicates protein translation termination, with initiation codon ATG and termination codon TAA in red font

图2 cGAS在不同物种中的结构图解

人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、斑马鱼(Danio rerio)、深海偏顶蛤(Bathymodiolus platifron)、香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)和长牡蛎(Crassostrea gigas)

Fig. 2 Schematic of cGAS structures in different species

图3 长牡蛎与其他物种cGAS氨基酸序列比对

图中NTase活性位点残基以红点标记, 锌带结构域以方框标出, “---” 表示氨基酸缺失; “*” “:” 和“.”分别表示相同的、高度保守的和不太保守的氨基酸残基

Fig. 3 Multiple alignment of cGAS amino acid sequences between Crassostrea gigas and other species. NTase catalytical sites are marked with red dots, and the zinc-ribbon domain is indicated by a box, with “---” representing an amino acid deletion. “*”, “:” and “.” present identical, highly conserved, and less conserved amino acid residues, respectively

采用MEGA11软件构建基于最大似然法的cGAS系统发育进化树, 其中cGAS同源物与2'-5'寡腺苷酸合成酶1 (2'-5'-oligoadenylate synthetases1, OAS1)同源物同属于核苷酸转移酶超家族, 但二者分别聚为两类(Civril et al, 2013)。此外, 进化树结果显示CgcGAS与香港牡蛎cGAS亲缘关系最近, 并与其他软体动物的同源蛋白聚为一支, 这与物种进化关系相符, 表明其在进化中具有保守性(图4)。
图4 基于最大似然法的系统发育进化树

红色字体表示长牡蛎

Fig. 4 Phylogenetic evolutionary tree of cGAS constructed by maximum likelihood method. Red lettering represents Crassostrea gigas

2.2 CgcGAS基因的表达模式

CgcGAS基因的组织表达水平检测结果显示, CgcGAS在血淋巴、鳃、闭壳肌、外套膜、性腺、消化腺、唇瓣和心脏中均广泛表达, 其中, 消化腺中表达量最高, 其次是唇瓣和心脏, 在其余组织表达水平相对较低(图5)。
图5 不同成体组织中CgcGAS的表达水平

所有数据均以平均数±SEM表示, n = 3。显著性差异(P< 0.05)由不同字母a—c表示

Fig. 5 Expression levels of CgcGAS in different tissues. All data are expressed as mean±SEM, n =3. Significant differences (P< 0.05) are identified by different letters, a-c

2.3 CgcGAS的亚细胞定位分析

为了进一步研究CgcGAS在细胞的作用机制, 对其进行了亚细胞定位分析, 结果显示, 目标蛋白(标记为绿色)在细胞质和细胞核都产生强烈信号, 即CgcGAS同时表达于细胞质和细胞核, 细胞核是主要的分布区域(图 6)。
图6 长牡蛎cGAS的亚细胞定位

左侧为pEGFP与cGAS荧光融合蛋白, 中间为DAPI染色后的细胞核, 右侧为合并图像。40倍镜下HEK293T细胞显微观察结果

Fig. 6 Subcellular localization of cGAS in Crassostrea gigas. Shown on the left is the fluorescent fusion protein of pEGFP and cGAS; shown in the middle is the nucleus after DAPI staining; and shown on the right is the combined image. The microscopic observation results of HEK293T cells at 40 magnifications

2.4 CgcGAS的信号传导功能研究

cGAS信号的活化会激活NF-κB信号通路和IFN产生(Motwani et al, 2019)。为了验证CgcGAS在长牡蛎免疫信号传导中是否也发挥同样的作用, 我们构建了pcDNA3.1-cGAS真核表达载体, 转染至HEK293T细胞中检测双荧光素酶活性。结果显示, CgcGAS能明显激活NF-κB报告基因, 并且这一激活效应呈剂量依赖性, 最高可达到对照组的5.9倍(图7a)。同时, 利用ISRE报告基因检测IFN信号通路, 发现CgcGAS同样明显激活ISRE报告基因, 激活效果最高达到对照组的9.3倍(图7b)。
图7 长牡蛎中cGAS对NF-κB(a)和ISRE-luc(b)的激活效果

数据均以平均值±SEM表示, n=3, 显著性差异(P<0.05)由不同字母a—c表示

Fig. 7 The activating effect of cGAS on NF-κB (a) and ISRE-luc (b) in Crassostrea gigas. All data are expressed as mean±SEM, n = 3. Significant differences (P< 0.05) are identified by different letters, a-c

2.5 CgcGAS对下游免疫因子的激活

为了进一步研究CgcGAS在免疫中的作用, 通过RNA干扰实验敲降了CgcGAS基因的表达, 定量PCR结果显示, 与对照组相比, 实验组的CgcGAS表达水平显著降低(图8a)。在CgcGAS被敲降后, 牡蛎体内的干扰素诱导病毒抑制蛋白(virus inhibitory protein endoplasmic reticulum-associated interferon-inducible, viperin)、干扰素调节因子2/8 (interferon regulatory factor 2/8, IRF2/8)、白细胞介素-17 (interleukin-17, IL-17)以及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的表达量都显著降低。这说明CgcGAS可以通过调控免疫相关因子的表达来进行抗菌抗病毒免疫(图8b)。
图8 长牡蛎cGAS敲降后下游因子表达情况

a. 荧光定量PCR检测敲降效果; b. cGAS敲降后下游免疫因子表达量; 数据均以平均值±SEM表示, n=3, *表示 P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001, ****表示P<0.0001

Fig. 8 Expression of downstream factors after cGAS knockdown in Crassostrea gigas; (a) fluorescence quantitative PCR was used to detect the knockdown effect; (b) expression of downstream immune factors after cGAS knockdown. All data are presented as mean ± SEM, with significance denoted as * for P<0.05, ** for P<0.01, *** for P<0.001, and **** for P<0.0001

3 讨论与结论

3.1 CgcGAS的结构

在哺乳动物中cGAS是重要的胞质DNA传感器, 介导先天免疫中的模式识别。近期有研究发现长牡蛎编码大量的cGAS样受体(cGAS-like receptors, cGLRs) (Li et al, 2023), 本文克隆了长牡蛎cGAS家族成员之一, 旨在初步探究cGAS在长牡蛎中的功能。CgcGAS在进化上保守, 其含有一个Mab21保守结构域和N末端两个锌指结构域, 并与其他物种cGAS一样具有NTase活性位点残基, 但其C末端缺少插入Mab21区域的锌带结构域, 大量研究发现无脊椎动物cGAS缺少锌带结构域, 该结构域对于金属配位及与DNA相互作用至关重要(Wu et al, 2014b)。凡纳滨对虾cGAS缺少锌带结构域, 因而不参与dsDNA的识别和STING依赖性IRF-Vago (interferon functional analog protein)信号轴的激活, 但参与白色斑点综合征病毒感染的抵御(Li et al, 2024)。不过, cGAS锌带结构域的缺失并不意味着无脊椎动物缺少DNA依赖性免疫途径(Li et al, 2024), 已经报道的牡蛎cGAS都具有识别DNA的能力, 如长牡蛎cGAS家族成员之一(XM_034454330.1), 具有识别病毒核酸的活性, 可以直接结合dsDNA和dsRNA (Qiao et al, 2021)。长牡蛎(Crassostrea gigas) cGLR1和美洲牡蛎(Crassostrea virginica) cGLR1可以识别dsDNA (Li et al, 2023), 推测本研究CgcGAS同样具有DNA传感器的功能, 但还需要进一步实验验证。

3.2 CgcGAS的定位

cGAS识别异常定位于细胞质的dsDNA, 最初cGAS被认为定位于细胞质, 并在细胞质中识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PMAP) (Sun et al, 2013; Chen et al, 2016b)。最近有许多研究对这种观点提出质疑并表明cGAS也定位于细胞核, 并且优先存在于细胞核, 核定位cGAS与核小体或染色质紧密结合, 活性被抑制, 以限制被自身DNA激活(Lahaye et al, 2018; Volkman et al, 2019; Boyer et al, 2020)。cGAS的核定位也为病毒的核传感提供了更多可能性, 如RNA病毒感染下核定位的cGAS可以与蛋白精氨酸甲基转移酶5 (protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)相互作用, 催化ifnb和ifna4启动子的组蛋白H3精氨酸2的对称二甲基化, 从而促进IRF3进入细胞核以促进IFN的产生(Cui et al, 2020)。此外, DNA损伤也会诱导cGAS易位到细胞核, 在核中cGAS被募集到DNA双链断裂处, 抑制同源重组介导的DNA修复(Liu et al, 2018)。本研究中亚细胞定位分析发现在无刺激情况下CgcGAS在细胞核与细胞质中都有分布, 并且主要定位于细胞核。这种cGAS核质共定位的情况在人类中也有过报道, Sun等发现人宫颈癌细胞(Hela)和人单核细胞(THP-1)的内源性cGAS定位于细胞质和细胞核, IFN刺激DNA (IFN stimulatory DNA, ISD)诱导cGAS从细胞核输出到细胞质中, 以响应并启动IFN反应, 并且阻断cGAS核输出会消除其胞质DNA传感器功能(Sun et al, 2021)。由于cGAS具有这种细胞核-细胞质传输机制, 胞外刺激的不同可能导致cGAS在细胞中的定位不同从而使其发挥不同的功能。已报道的牡蛎cGAS具有识别dsDNA的能力, 并产生2′-5′/3′-5′ cyclic UMP-AMP(2′, 3′-cUA)以激活下游STING, 介导免疫反应(Li et al, 2023), 推测CgcGAS可以从细胞核输出到细胞质以识别DNA进行免疫响应。

3.3 CgcGAS的免疫机制

cGAS通过激活多种信号通路和细胞因子来介导免疫反应, 研究最为广泛的是cGAS激活下游STING, 随后激活干扰素调节因子(IRF), 从而激活干扰素(IFN), 释放的IFN触发IFN刺激基因(ISG)的激活。ISG可以编码干扰素诱导病毒抑制蛋白viperin, 其具有抗病毒活性(Qiao et al, 2021)。有研究发现cGAS的活化会诱导TNF和IL等炎症因子(Willemsen et al, 2021; Allen et al, 2022), 以清除细胞外细菌或调节细胞增殖、分化、吞噬和其他细胞因子的表达(Li et al, 2014; Chen et al, 2016a)。据报道, 太平洋牡蛎存在viperin、IRF2、IRF8、IL-17和TNF等细胞因子, 与脊椎动物功能相似, 进行免疫防御(Li et al, 2014; Green et al, 2015; Huang et al, 2017; Mao et al, 2018)。cGAS最初发现激活ISRE信号通路, 后发现cGAS对NF-κB同样有激活作用(Deng et al, 2019)。本研究发现在无外源刺激时CgcGAS可以显著激活NF-κB、ISRE信号通路, 当CgcGAS被敲降时炎症因子vipeirin、TNF、IL-17和转录因子IRF2/8的表达量显著降低, 与前人研究相符(Qiao et al, 2021; Willemsen et al, 2021), 证实了CgcGAS在牡蛎免疫中的重要作用。纯化的海葵Exaiptasia pallida cGLR也被发现在缺乏外源核苷酸配体情况下具有强大活性, 该研究同样指出海葵cGLR自活性可能是由于蛋白纯化过程中共纯化的残余核酸的存在导致的(Li et al, 2023), 因此推测CgcGAS的自活性可能由于是HEK293T细胞产生了核酸碎片, 从而活化CgcGAS, 激活NF-κB、ISRE信号通路及相关炎症因子与转录因子。
综上所述, 本文研究了长牡蛎的cGAS家族成员之一, 发现其结构保守, 可以激活NF-κB、ISRE信号通路及多种炎症因子和转录因子以进行免疫反应, 这为牡蛎的先天免疫研究提供了更多的理论基础, 丰富了对于贝类先天免疫的理解, 对贝类养殖的病原体防治研究有重要意义。

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