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热带海洋学报 >

2025 , Vol. 44 >Issue 6: 120 - 131

DOI: https://doi.org/10.11978/2025022

海洋生物学

珊瑚共附生嗜盐单胞菌原噬菌体上的HicAB毒素-抗毒素系统的鉴定及其结构分析

  • 张雨 , 1, 2 ,
  • 刘自尧 2 ,
  • 王晓雪 2 ,
  • 陈冉 , 2
展开
  • 1 暨南大学生命科学技术学院, 广东 广州 510632
  • 2 中国科学院南海海洋研究所, 热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州 511458
陈冉。email:

张雨(1999—), 男, 江西省上饶市人, 硕士, 从事海洋微生物生理与生化研究。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2025-02-17

  修回日期: 2025-03-14

  网络出版日期: 2025-03-18

基金资助

国家自然科学基金项目(42188102)

中国科学院南海海洋研究所专项基金(SCSIO2023QY03)

海洋负排放国际大科学计划(ONCE)

海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室开放项目(MRUKF2023001)

收起

Identification and structural analysis of the HicAB toxin-antitoxin system encoded by a prophage in coral-associated Halomonas meridiana

  • ZHANG Yu , 1, 2 ,
  • LIU Ziyao 2 ,
  • WANG Xiaoxue 2 ,
  • CHEN Ran , 2
Expand
  • 1 College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 2 Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 511458, China
CHEN Ran. email:

Received date: 2025-02-17

  Revised date: 2025-03-14

  Online published: 2025-03-18

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42188102)

Special Fund of the South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences(SCSIO2023QY03)

Ocean Negative Carbon Emissions Program(ONCE)

Open project of State Key Laboratory of South China Sea Marine Resources Utilization, Hainan University(MRUKF2023001)

Fold

摘要

噬菌体与细菌宿主的相互作用对珊瑚健康和珊瑚礁稳定性具有重要影响, 也是病毒学领域的研究热点之一。为应对噬菌体的感染压力, 细菌进化出多种固有和适应性免疫系统, 其中毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统是重要的防御机制之一。本研究通过生物信息学分析预测, 珊瑚共附生嗜盐单胞菌Halomonas meridiana SCSIO 43005 (Hm43005)所携带的原噬菌体Phm2中的CTT34_05265和CTT34_05260基因分别编码HmHicA和HmHicB蛋白, 并通过大肠杆菌生长实验证实其构成TA系统。Pull-down和细菌双杂交实验进一步验证了HmHicA与HmHicB之间的相互作用。凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和DNaseⅠ足迹实验表明, HmHicB通过特异性结合hicAB启动子-35区上游和-10区的回文序列, 发挥转录自调控功能。此外, HmHicB单独表达对宿主表现出轻微毒性, 提示抗毒素蛋白在细胞内可能具有其他调控靶点。结构分析显示, HmHicA具有核糖体非依赖性RNA切割酶活性, 而HmHicB包含N端毒素结合结构域和C端DNA结合结构域。HmHicB通过C端形成同源二聚体, 并与HmHicA以2:2的化学计量比形成复合物。HmHicA带正电荷的活性口袋与HmHicB带负电荷的毒素结合结构域之间的相互作用, 以及HmHicA His24活性位点的包埋, 可能是抗毒素抑制毒素活性的分子机制。这些研究结果为深入解析该TA系统的性质及其生理生态功能奠定了重要基础。

关键词： 珊瑚共附生细菌; 嗜盐单胞菌; 毒素-抗毒素系统; HicAB系统

本文引用格式

张雨 , 刘自尧 , 王晓雪 , 陈冉 . 珊瑚共附生嗜盐单胞菌原噬菌体上的HicAB毒素-抗毒素系统的鉴定及其结构分析[J]. 热带海洋学报, 2025 , 44(6) : 120 -131 . DOI: 10.11978/2025022

Abstract

The interaction between phages and bacterial hosts significantly impacts coral health and reef stability, representing a key focus in virology. To combat phage infection, bacteria have evolved diverse innate and adaptive immune systems, including toxin-antitoxin (TA) systems, a crucial defense mechanism. In this study, bioinformatics analysis predicted that the CTT34_05265 and CTT34_05260 genes within the prophage Phm2 of the coral-associated bacterium Halomonas meridiana SCSIO 43005 (Hm43005) encode HmHicA and HmHicB proteins, respectively. Their TA system functionality was confirmed through E. coli growth assays. Pull-down and bacterial two-hybrid experiments validated the interaction between HmHicA and HmHicB. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and DNase I footprinting revealed that HmHicB specifically binds to palindromic sequences upstream of the -35 and -10 regions of the hicAB promoter, mediating transcriptional autoregulation. Additionally, HmHicB alone exhibited mild toxicity, suggesting potential alternative regulatory targets for the antitoxin. Structural analysis indicated that HmHicA functions as a ribosome-independent RNase, while HmHicB contains an N-terminal toxin-binding domain and a C-terminal DNA-binding domain. HmHicB forms a homodimer via its C-terminus and assembles with HmHicA in a 2:2 stoichiometric complex. The molecular mechanism of antitoxin-mediated toxin inhibition likely involves electrostatic interactions between the positively charged active pocket of HmHicA and the negatively charged toxin-binding domain of HmHicB, as well as the burial of the HmHicA His24 active site. These findings provide a foundation for further exploration of the properties and physiological roles of this TA system.

Key words： coral-associated bacteria; Halomonas meridiana; toxin-antitoxin system; HicAB system

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系统是一种多样化的双基因或三基因遗传元件, 广泛分布在细菌和古菌的基因组、并在质粒、原噬菌体等可移动遗传元件中富集存在(Jurėnas et al, 2022)。TA系统最初于20世纪80年代发现存在接合转移型质粒上, 并提出通过一种被称为“分离后致死效应”(post-segregational killing, PSK)的机制维持质粒在细菌群体中的垂直传播(Hayes et al, 2011)。随着对这些TA系统的进一步研究, 这些系统的更多生物学功能被揭示, 包括噬菌体防御(Guo et al, 2024)、生物膜形成(Wang et al, 2011)和质粒复制等(Ni et al, 2021)。已鉴定的TA系统中的毒素蛋白靶标原核生物的关键生命过程发挥其毒性作用, 包括干扰DNA复制(Aakre et al, 2013)、降解mRNA(Yao et al, 2020)、影响翻译(Bikmetov et al, 2022)、阻碍细胞骨架形成(Masuda et al, 2012)和细胞壁合成(Rocker et al, 2018)等重要细胞过程。同时, 抗毒素通过多种机制拮抗毒素发挥毒性(Jurėnas et al, 2022)。根据抗毒素中和毒素的方式将TA分类为八个亚型, 在这些亚型中Ⅱ型TA系统是最常见且目前被研究最广泛的毒素-抗毒素系统(Lin et al, 2023)。
HicAB属于Ⅱ型TA系统, 最早发现于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的菌毛基因簇(hif)当中, 因此被命名为HicAB( Haemophilus influenza contiguous) (Mhlanga-Mutangadura et al, 1998)。hicAB基因排列有一个显著的特点: 毒素基因(hicA)位于抗毒素基因(hicB)的前面, 这与大多数TA系统的基因排列顺序相反。hicAB基因在细菌和古菌中广泛存在, 并在一些宿主中以多个拷贝的形式存。抗毒素HicB大多包含有RNase H样折叠(典型特征包含β1β2β3α1β4α2模块), 而HicA包含结合双链RNA的结构域。研究者最初将带有RNase H样结构域的HicB预测为毒素组分, 把带有结合双链RNA的HicA预测为抗毒素(Makarova et al, 2006)。然而, 后续的实验结果与这一预测恰恰相反。第一对由实验证实的HicAB成员位于大肠杆菌K-12基因组, HicA是非核糖体依赖型的RNA切割酶, 能够对胞内的mRNA和tmRNA酶切, 进而阻断翻译过程的进行, 具有抑菌功能; 而HicB并没有表现出细胞毒性, 反而可以完全抑制HicA的毒性(Jørgensen et al, 2009)。目前已经发现的HicAB的生理功能主要有: 鼠疫杆菌hicB基因缺失导致菌株毒力大幅下降(Goulard et al, 2010); 类鼻疽伯克霍尔德菌HicAB介导持留细菌的形成(Butt et al, 2014); 大肠杆菌HicAB协助适应细胞外应激(Jørgensen et al, 2009)。
近年来, 随着研究深入, 越来越多的证据表明噬菌体基因组编码的TA系统具有双重调控功能: 该体系不仅能调控温和噬菌体的溶原-裂解周期转换, 还能参与宿主抵御烈性噬菌体侵染的防御过程。这一发现提示, 对噬菌体及其他可移动遗传元件中TA系统的深入研究, 将有助于揭示新型噬菌体调控机制, 并为阐明温和噬菌体与宿主间的互作网络提供新视角。本研究以珊瑚共附生嗜盐单胞菌Halomonas meridiana SCSIO 43005 (Hm43005)为目标菌株, 聚焦于前期开发的原噬菌体预测算法Prophage Tracer(Tang et al, 2021)鉴定出的原噬菌体Phm2(Liu et al, 2024)。通过对该原噬菌体携带的TA系统进行分子鉴定与功能解析, 我们发现: Hm43005中原噬菌体Phm2所编码的TA系统属于典型的Ⅱ型HicAB家族系统(本文命名为HmHicAB系统), 其毒素基因与抗毒素基因具有共转录特性。通过体外蛋白纯化实验证实, 毒素蛋白HmHicA与抗毒素蛋白HmHicB可发生特异性相互作用。进一步通过凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)发现, HmHicB蛋白对TA操纵子的启动子区域表现出强结合能力; 结合DNase I足迹实验, 最终定位到HmHicB在启动子区的特异性结合位点。值得注意的是, 抗毒素蛋白的DNA结合特性提示, 该TA系统可能通过HmHicB与宿主基因组其他位点的互作, 参与调控Hm43005菌株的特定生理功能。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和培养条件

本研究所用到的大肠杆菌菌株在LB培养基中于37℃培养, Hm43005菌株采用2216E培养基于30℃培养, 菌株详细信息见表1, 质粒详细信息见表2。在含有特定耐药基因质粒的细胞中添加氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。根据需要添加诱导剂或其他试剂, 例如10mmol·L−1 L-阿拉伯糖或0.1~1mmol·L−1 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)或2, 6-二氨基庚二酸(2, 6-diaminopimelic acid, DAP)。
表1 本文所用菌株

Tab. 1 Bacterial strains used in this study

菌株 描述 来源
Hm43005 Isolated from Coral samples of G. fascicularis. 实验室保存
WM3064 thrB1004 pro thi rpsL hsdS lacZΔM15 RP4-360 Δ(araBAD)567 ΔdapA1341:: [erm pir] 实验室保存
BL21 (DE3) F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm λ(DE3) Ω PtacUV5::T7 polymerase Novagen
BW25113 (K-12) lacIq rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 rph-1 Baba et al, 2006
Top10 F-, mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC), ϕ80, lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, araΔ139Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rps, (Strr) endA1, nupG 实验室保存

注: KmR, CmR, AmpR分别代表卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素。

表2 本文所用质粒

Tab. 2 Plasmids used in this study

质粒 描述 来源
pHGECm CmR, IPTG inducible expression vector in E.coli and H.meridiana SCSIO 43005 strains 实验室保存
pHGECm-hicA CmR; over-expression vector for CTT34_05265 本研究
pHGECm-hicB CmR; over-expression vector for CTT34_05260 本研究
pHGECm-hicAB CmR; over-expression vector for CTT34_05260 and CTT34_05265 as one operon 本研究
pUT18C-hicA AmpR; interaction assay vector for CTT34_05265 本研究
pKT25-hicB KmR; interaction assay vector for CTT34_05260 本研究
pET28b KmR, IPTG inducible expression and purified vector Novagen
pET28b-hicA-his KmR; pET28b PT7-lac::hicA with C-terminal His-tagged 本研究
pET28b-hicB-his KmR; pET28b PT7-lac::hicB with C-terminal His-tagged 本研究
pET28b-his-hicAB KmR; pET28b PT7-lac:: hicAB with N-terminal His-tagged 本研究

注: KmR, CmR, AmpR分别代表卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素。

1.2 Hm43005基因组中TA的预测

使用TADB 3.0 (https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB3)在线预测位于Hm43005基因组上的TA系统(Guan et al, 2024)。

1.3 蛋白的表达与纯化

构建表达载体: 以Hm43005基因组为模板, 使用SnapGene设计引物, 引物序列见表3。通过PCR获得目的基因, 反应体系如下: 2×PrimeSTAR Max Premix (TaKaRa) 25μL、上游引物(10μmol·L−1) 1.5μL、下游引物(10μmol·L−1) 1.5μL、模板DNA 1μL、ddH2O 21μL。PCR程序为: 95℃ 5min; (95℃ 20s、降落60~45℃ 20s、72℃ 1min)进行34个循环; 72℃ 5min后终止反应。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 回收纯化目的片段, 将目的片段与pET28b载体连接, 然后转化到Top10感受态细胞中, 用卡那霉素选择性培养基过夜培养后挑选阳性菌落进行PCR, 挑选与目标片段大小一致的菌液送至天一辉远生物科技有限公司测序, 将测序正确的表达载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)。
表3 引物信息

Tab. 3 Sequences of designed primers used in this study

引物名称 序列(5′-3′) 用途
pHGECm-hicA-F TAACAATTTCACACAGGAGAGATGAACAGCAGAGCACTGATC 毒性验证
pHGECm-hicA-R ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCATTCGAGGCCAGCGCTTTTC 毒性验证
pHGECm-hicB-F TAACAATTTCACACAGGAGAGATGTTATTTCCCATTGCCATTG 毒性验证
pHGECm-hicB-R ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTAGCTGGCTTGTTTGTTCCTG 毒性验证
pUT18C-hicA-F ACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGATGAACAGCAGAGCACTGATC 细菌双杂交
pUT18C-hicA-R ATTACTTAGTTATATCGATGAATTTCATTCGAGGCCAGCGCTTTTC 细菌双杂交
pKT25-hicB-F CTAGAGGATCCCCGGGTACCTATGTTATTTCCCATTGCCATTG 细菌双杂交
pKT25-hicB-R GAATTCTTAGTTACTTAGTTAGCTGGCTTGTTTGTTCCTG 细菌双杂交
pET28b-hicA-his-F CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACAGCAGAGCACTGATC 蛋白表达纯化
pET28b-hicA-his-R CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTCGAGGCCAGCGCTTTTCC 蛋白表达纯化
pET28b-hicB-his-F CTTTAAGAAGGAGATATACCATGTTATTTCCCATTGCCATTG 蛋白表达纯化
pET28b-hicB-his-R CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGCTGGCTTGTTTGTTCCTGGC 蛋白表达纯化
pET28b-his-hicAB-F GGTGGACAGCAAATGGGTCGGATGAACAGCAGAGCACTGATC Pull-down分析
pET28b-his-hicAB-R CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCTGGCTTGTTTGTTCCTG Pull-down分析

注: “F”表示上游引物, “R”表示下游引物。

蛋白纯化: 将表达菌株接种到含有特定抗生素的500mL液体LB培养基中, 在37℃培养, 生长到OD600约为0.8时取出恢复室温后添加终浓度0.3mmol·L−1 IPTG, 在16℃诱导表达16h, 在4400×g离心20min收集菌体。加入30mL缓冲液A (250mmol·L−1 NaCl; 40mmol·L−1 Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol·L−1咪唑)重悬细菌, 通过超声破碎仪破碎细胞(工作总时间10min, 超声时间5s, 停止时间10s, 超声功率200W), 10000×g离心1h, 去除细胞碎片, 收集上清。加入镍-氮川三乙酸树脂(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA), 目的蛋白会通过His-tag与树脂上的镍离子结合, 在摇床孵育1h, 用洗涤缓冲液(250mmol·L−1 NaCl, 40mmol·L−1 Tris-HCl pH 8.0, 20~50mmol·L−1咪唑)除去杂蛋白。使用缓冲液B(250mmol·L−1 NaCl, 40mmol·L−1 Tris-HCl, pH 8.0, 250mmol·L−1咪唑)洗脱目的蛋白。通过bradford法测蛋白质浓度, 将目的蛋白加入到quick start bradford 1×dye reagent (BIO RAD), 使用酶标仪测定OD595处吸光度, 计算蛋白浓度。取2μg蛋白, 用水补到20μL体积, 加5μL蛋白上样缓冲液煮沸10min, 通过SDS-PAGE检测蛋白纯度。在由150mmol·L−1 NaCl、20mmol·L−1 Tris-HCl (pH 8.0)、1mmol·L−1二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)配制的透析缓冲液中透析除去咪唑, 使用浓缩离心管浓缩蛋白。将纯化的蛋白分装, 于-80℃保存。

1.4 HmHicAB的序列与结构分析

用AlphaFold 3对HmHicA, HmHicB和HmHicA-HicB复合物的蛋白质结构进行预测(Varadi et al, 2024), 并用Dali server进行相似结构的搜索(Holm, 2022)。使用ChimeraX1.9进行结构分析及图片的可视化(Meng et al, 2023)。

1.5 细菌双杂交

采用基于T18和T25催化结构域相互作用的细菌双杂交实验(Battesti et al, 2012)确认HmHicA和HmHicB之间的相互作用。将hicA和hicB基因分别克隆到pUT18C或pKT25载体上, 重组质粒共转化大肠杆菌BTH101 (cya-99)感受态细胞。pUT18C含有T18催化结构域, pKT25含有T25催化结构域, T18和T25是腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, cAMP)的两个独立的催化结构域。阴性对照是插入了酵母GCN4亮氨酸拉链区片段(zip)的pUT18C和没插入zip的pKT25质粒, 阳性对照是pUT18C-zip和pKT25-zip质粒。亮氨酸拉链结构域会形成二聚体, 因此与其融合表达的T18和T25催化结构域将会靠近重新结合并恢复腺苷酸环化酶的活性, 从而在细菌中恢复cAMP的合成, 进而启动报告基因(如lacZ, 编码β-半乳糖苷酶)的表达, 通过X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, X-gal)蓝白筛选法检测β-半乳糖苷酶的活性。将5µL OD600约为1.0的菌液点样在补充有卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG (1mmol·L−1)和X-gal (40µg·mL-1)的麦康凯培养基平板上, 置于30℃培养箱生长12h, 有活性菌落呈蓝色, 无活性菌落保持白色或没有显色反应。

1.6 生长曲线绘制

通过测定菌液的浑浊程度(OD600)和每毫升中形成单菌落的活菌数(colony forming units, CFU)来表征细菌的生长情况。将含有hicA、hicB、hicAB基因的pHGECm质粒和空载质粒分别转入到BW25113菌株中, 挑取单菌落在液体培养基中过夜培养, 测定OD600。然后转接至25mL LB液体培养基中, 初始菌液OD600为0.1, 每组有3个重复。每2h测定菌液OD600下的吸光度(A600), 并用生理盐水10倍梯度稀释, 每个稀释梯度取10µL菌液点到LB固体平板, 待生长12h后拍照统计。

1.7 EMSA实验

将目标DNA用T载构建至pMD19T载体, 使用Biotin标记的引物扩增, 然后胶回收, 避光保存备用。计算好蛋白与核酸的摩尔浓度, 比例后将蛋白与核酸摩尔比(HmHicB/DNA)分别按0∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1混合, 在25℃孵育30min。然后样品采用电泳缓冲液(Tris-borate-EDTA buffer, TBE)配置的胶进行电泳。将TBE胶上的核酸及核酸蛋白复合物, 通过转膜电泳转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane, NC)。NC膜紫外交联30min后, 将NC膜加入封闭液封闭。室温孵育生物素一抗1h; TBST (Tris-buffered saline with tween 20)洗膜三次每次10min, 随后孵育二抗1h。使用化学发光法显影。

1.8 DNase I足迹实验

参考已有的实验方法(Zianni et al, 2006), 采用高保真DNA聚合酶2×PrimeSTAR Max Premix (TaKaRa) 扩增hicA启动子区290bp, 以商品化的T载pMD19为载体构建重组质粒pMD19-PhicA。以pMD19-PhicA为模板, 含有羧基荧光素(carboxyfluorescein, FAM)的M13 47 (FAM)和RV-M为引物, 通过PCR扩增hicA启动子区获得FAM标记的目的探针, 纯化并进行定量。然后将FAM标记的目的探针与HmHicB于25℃混合孵育30min, 以不添加HmHicB为空白对照。设置不同的DNase I反应条件以消化目的探针DNA(与蛋白结合的启动子区域不会被DNase I消化), 反应温度为25℃, 加入DNase I的量设置为1、0.5、0.25、0.125、0.0625U。反应时间设置为1、2、4、8、16min。DNase I消化反应用5mmol·L-1 EDTA终止反应, 通过苯酚抽提去除蛋白, 乙醇沉淀DNA。沉淀后的DNA溶解于Mili-Q超纯水中, 送样至金唯智公司通过ABI测序仪进行测序; 所用Ladder为ABIGeneScan500Liz。

2 结果

2.1 Phm2原噬菌体上TA系统的位置及保守位点分析

使用前期开发的一种识别原核基因组中活跃噬菌体的工具Prophage Tracer, 在珊瑚共附生微生物嗜盐单胞菌Hm43005基因组鉴定了三个原噬菌体, Phm1、Phm2和Phm3(Liu et al, 2024)。Phm2无法被丝裂霉素C诱导激活, 因此进一步对Phm2原噬菌体基因组进行注释, 使用TADB 3.0预测结果显示位于Phm2原噬菌体调控区域有一对潜在的TA系统, 其中CTT34_05265基因预测编码60个氨基酸的HicA毒素, CTT34_05260基因预测编码139个氨基酸的HicB抗毒素(图1a)。一般的Ⅱ型TA系统的抗毒素位于毒素的上游, 而Hm43005编码的hicAB基因排列与同家族其他成员相同: 即抗毒素基因(hicB)位于毒素基因(hicA)的后面。与PDB数据库中已经解析的HicAB复合物中的HicA和HicB的序列比对分析发现, 位于HicA第一和第二个β折叠之间活性中心最为重要的残基为His24, 在HmHicA中也非常保守(图1b), 说明他们催化机制可能类似。分析还发现了HicB的5个较为保守的位点: Pro4、Asp22、Gly30、Pro71和Ala128, 这些位点的具体作用未知(图1c)。
图1 HicAB系统的生物信息学分析

a. hicAB基因在原噬菌体中的位置, hicA和hicB分别采用蓝色和绿色显示; b. Hm43005菌株编码的HmHicA与已解析结构的B. pseudomallei (PDB 6G26)、Y. pestis (PDB 4P78)、S. pneumoniae (PDB 5YRZ)和E. coli (PDB 6HPB)四个物种HicA序列比对, c. Hm43005菌株编码的HmHicB与已解析结构的B. pseudomallei、Y. pestis、E. coli和S. pneumoniae四个物种HicB序列比对

Fig. 1 Bioinformatics analysis of the HicAB system. (a) The location of hicAB operon within the prophage, with hicA and hicB shown in blue and green, respectively; (b) sequence alignment of HmHicA encoded by the Hm43005 strain with the structurally resolved HicA sequences from B. pseudomallei, Y. pestis, S. pneumoniae, and E. coli; (c) sequence alignment of HmHicB encoded by the Hm43005 strain with the structurally resolved HicB sequences from B. pseudomallei, Y. pestis, E. coli and S. pneumoniae

2.2 Phm2上HicAB系统的鉴定

对上述预测出的Phm2原噬菌体上的TA系统(HmHicAB)进行验证。通过构建质粒pHGECm-hicA、pHGECm-hicB和pHGECm-hicAB并在大肠杆菌BW25113进行诱导表达。结果发现经IPTG诱导表达HmHicA能显著抑制细菌生长, 表达HmHicAB对宿主的生长并没有影响(图2a、b)。此外, 不同于大多数TA系统抗毒素过表达对宿主的生长没有影响, HmHicB的单独过表达时也对大肠杆菌的生长有轻微抑制作用(图2a)。以上结果表明与同家族成员一致的是hicA为毒素基因, 抗毒素hicB可以拮抗毒素的毒性作用。HmHicB对大肠杆菌生长有轻微抑制的现象说明他除了发挥拮抗毒素的作用之外, 可能通过DNA结合结构域在胞内调控其他靶点。
图2 大肠杆菌生长实验确认Phm2上的HmHicAB构成一对TA系统

a. 生长曲线表明过表达毒素HmHicA可以抑制大肠杆菌生长, HmHicB可中和HmHicA的毒性; b. 存活实验(CFU·mL-1)证实了hicA和hicB组成TA系统

Fig. 2 Growth experiments of E. coli confirm that hicA and hicB on Phm2 constitute a TA system. (a) Growth curves indicate that overexpression of toxins can inhibit the growth of E. coli; (b) survival assays (CFU·mL-1) confirmed that hicA and hicB constitute a TA system

2.3 HmHicA与HmHicB存在蛋白-蛋白互作

Ⅱ型TA系统的典型特征之一是毒素和抗毒素存在蛋白-蛋白相互作用, 采用pull-down实验检测HmHicA是否与HmHicB之间相互作用。在构建HmHicAB共表达载体时, 把预测的hicAB作为一个完整操纵子克隆至pET28b载体, 分别构建pET28b-hicA-His、pET28b-hicB-His (HmHicB C端标签) (图3a)和pET28b-hicAB-His (HmHicA N端标签)(图3b)。为了排除该双带是Ni-NTA柱料与蛋白HmHicAB的非特异性结合产生, 采用未带标签的pET28b-hicAB作为对照。蛋白表达纯化结果表明这一对HmHicAB符合共转录特性; 并且抗毒素HmHicB可以通过与毒素HmHicA直接相互作用来中和其毒性。但是可能由于毒素的毒性原因, 本实验并没有纯化出HmHicA毒素蛋白(图3a)。此外, 我们采用细菌双杂交系统进一步确认了HmHicA与HmHicB之间的相互作用。结果显示, 含有pUT18C-hicA和pKT25-hicB重组质粒的菌落呈蓝色, 表明HmHicA和HmHicB之间存在相互作用(图3c)。
图3 实验验证HmHicA与HmHicB相互作用

a. SDS-PAGE检测纯化到抗毒素HmHicB蛋白大小和纯度; 泳道1和5: 诱导前; 泳道2和6: 诱导后; 泳道3和7: 洗脱样1; 泳道4和8: 洗脱样2。b. SDS-PAGE显示表达毒素HmHicA蛋白可以成功下拉HmHicB抗毒素蛋白; 泳道1和4: 诱导前; 泳道2和5: 诱导后; 泳道3和6: 洗脱样1。c. 细菌双杂交鉴定HmHicA与HmHicB相互作用

Fig. 3 Experimental validation of the interaction between HmHicA and HmHicB. (a) SDS-PAGE analysis of the size and purity of the purified anti-toxin HmHicB protein: Lane 1 and 5 (pre-induction), Lane 2 and 6 (post-induction), Lane 3 and 7 (elution sample 1), Lane 4 and 8 (elution sample 2); (b) SDS-PAGE analysis demonstrates that the expressed toxin HicA protein successfully pulls down the HmHicB anti-toxin protein: Lane 1 and 4 (pre-induction), Lane 2 and 5 (post-induction), Lane 3 and 6 (elution sample 1); (c) bacterial two-hybrid assay confirms the interaction between HmHicA and HmHicB

2.4 HmHicAB操纵子存在转录自调控

使用EMSA实验来验证抗毒素蛋白HmHicB是否可以结合自身启动子, 同时采用Hm43005染色体编码的brnTA毒素-抗毒素系统的启动子为空白对照。结果表明抗毒素HmHicB能够结合毒素hicAB启动子, 并且随着蛋白浓度增加呈现梯度效应(图4a)。为了进一步确定抗毒素HmHicB与启动子的相互作用区域, 通过DNase I足迹实验对TA系统的抗毒素与启动子结合位点进行鉴定, 并通过Softberry网站(Millman et al, 2020)在线预测HicAB基因的-35和-10区。测序结果分析发现, 与没有添加HmHicB蛋白的对照组峰图结果对比, 添加了HmHicB的实验组的峰图中两段区域未能检测到峰或峰值较低, 说明HmHicB与这两段启动子区DNA序列结合, 保护其不被DNase I消化。测序结果和启动子预测对比分析发现, HmHicB的与HmHicA启动子结合的位点为位于-35区上游的“GGGTTATTGGGGTTAT” (结合区域1)和位于-10区“GGGGTTATAGTAACCCC” (结合区域2) (图4b)。进一步对这两个区域的序列特征分析发现, 结合区域1存在两个“GGGTTA”重复序列, 结合区域2存在由“GGGTTA”和“TAACCC”组成的回文序列。以上实验结果说明HmHicAB系统存在转录自调控机制。
图4 体外纯化的HmHicB抗毒素蛋白可以与hicAB的启动子结合

a. 抗毒素HmHicB能够结合自身启动子, 并且随着蛋白浓度增加结合能力增强, 0、1、2、4和8分别代表蛋白与核酸摩尔比(HmHicB/DNA) 为0∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1, 对照为Hm43005菌株brnTA系统的启动子; b. HmHicB与hicAB启动子-35区上游和-10区的回文序列结合, 对照为不加HmHicB的测序结果。-35和-10区序列用红色字体显示, 结合区域1和2用两个红色虚线方框显示, 重复和回文序列用下划线标记

Fig. 4 The in vitro purified HmHicB antitoxin protein can bind to the hicAB promoter. (a) The antitoxin HmHicB can bind to its own promoter, and its binding ability increases with higher protein concentrations. The numbers 0, 1, 2, 4, and 8 represent the molar ratios of protein to nucleic acid (HmHicB/DNA) at 0∶1, 1∶1, 2∶1, 4∶1, and 8∶1, respectively. The control is the promoter of the brnTA system from strain Hm43005. (b) HmHicB binds to the palindromic sequences upstream of the -35 and within the -10 regions of the hicAB promoter. The control is the sequencing result without HmHicB. The -35 and -10 regions are highlighted in red, and the binding regions 1 and 2 are marked with two red dashed boxes. Repeated and palindromic sequences are underlined

2.5 HmHicA的结构特征分析

为阐明HmHicA的结构特征, 本研究采用AlphaFold 3对单体蛋白结构进行预测(Varadi et al, 2024), 并通过Dali search服务器在线检索其三维结构相似蛋白(Holm, 2022)。检索结果显示HmHicA与类鼻疽伯克霍尔德菌(B. pseudomallei) HicAB复合物(PDB 6G26)(Winter et al, 2018)中的毒素最为相似, 60个Cα之间的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)值为0.8, Z-值为12.7(图5)。毒素HicA包含由3个β折叠和2个α螺旋组成的双链RNA结合结构域。活性中心最为重要的残基为His24(Manav et al, 2019), 位于第一和第二个β折叠之间(图5a)。通过将HmHicA与B. pseudomallei HicA进行结构叠加, 发现二者主体结构高度保守, 仅在N端和C端存在数个氨基酸长度的差异(图5b)。值得注意的是, His24残基周围的溶剂可及表面分布有大量正电荷, 且其侧链咪唑环朝向该区域, 提示此处可能是带负电荷RNA底物的潜在结合位点(图5c)。
图5 HmHicA的结构特征分析

a. AlphaFold 3预测的HmHicA单体结构; b. HmHicA与B. pseudomallei HicA结构对比分析; c. HmHicA表面电荷分析

Fig. 5 Structural analysis of HmHicA. (a) Monomer structure of HmHicA predicted by AlphaFold 3; (b) comparative structural analysis of HmHicA and B. pseudomallei HicA; (c) surface charge analysis of HmHicA

2.6 HmHicB DNA结合结构域形成的结构基础

采用AlphaFold 3预测的抗毒素HicB单体由4个β折叠和3个α螺旋组成(Varadi et al, 2024), 以及连接这些二级结构的多段长的环区, Met1-Leu89是N端的毒素结合结构域, Gly90-Ser139是C端的带-螺旋-螺旋(ribbon-helix-helix, RHH) DNA结合结构域(图6a)。Dali search服务器在线检索同样与类鼻疽伯克霍尔德菌(B. pseudomallei) HicAB复合物(PDB 6G26)中的抗毒素最为相似(Holm, 2022), 135个Cα之间的RMSD值为2.8, Z-值为16.9。与B. pseudomallei HicB结构叠加显示二者的二级结构数量和位置保守, 仅在几段长的环区存在构像差异(图6b)。对HmHicB的表面电荷分析发现溶剂暴露表面分布大量负电荷, 这一区域可能模拟了毒素HicA的核酸底物与毒素带正电荷的区域结合(图6c)。
图6 HmHicB的C端相互作用形成典型的RHH DNA结合结构域

a. AlphaFold 3预测的HmHicB单体结构; b. HmHicB与B. pseudomallei HicB结构对比分析; c. HmHicB表面电荷分析; d. AlphaFold 3预测的HmHicB二聚体结构, 二聚化形成的RHH结构域采用红色虚线方框标出; e. HmHicB单体与二聚体结构对比分析, 两处结构重排的区域采用红色虚线椭圆标出

Fig. 6 C-terminal interactions of HmHicB form a typical RHH DNA-binding domain. (a) Monomer structure of HmHicB predicted by AlphaFold 3; (b) comparative structural analysis of HmHicB and B. pseudomallei HicB; (c) surface charge analysis of HmHicB; (d) dimer structure of HmHicB predicted by AlphaFold 3, with the RHH domain formed by dimerization marked by a red dashed box; (e) comparative structural analysis of HmHicB monomer and dimer, with regions undergoing structural rearrangement marked by red dashed ellipses

目前PDB数据库中发布的4套HicAB系统结构中HicB的结构存在二聚(Manav et al, 2019)和四聚(Bibi-Triki et al, 2014; Kim et al, 2018; Winter et al, 2018)两种形态, 为了揭示HmHicB如何聚集形成DNA结合结构域, 我们采用AlphaFold 3预测了HicB同源二聚和四聚结构。四聚体中各单体存在部分区域的明显冲撞, 而且输出的5套模型中预测模板建模(predicted template modeling score, pTM)分数均在0.3左右, 说明四聚体模型不可信。而二聚体结构的两个单体契合良好, 5套模型pTM均为0.71, 说明二聚体的可能更大(图6d)。我们对二聚体结构进行分析, 发现两个单体的相互作用界面仅由RHH DNA结合结构域提供, 互作面积有1815Å2, N端的毒素结合结构域不参与二聚体形成(图6d)。HmHicB的单体和二聚体结构叠加分析显示, N端的毒素结合结构域和C端的DNA结合结构域都发生结构重排, 尤其是单体中的RHH结构域的带区域在二聚化时形成了新的β折叠, 与C端两个螺旋一起形成互作界面, 介导了HmHicB “V”字形二聚体结构的形成(图6e)。

2.7 HmHicB拮抗HmHicA毒性的分子基础

第一套HicAB系统的复合物结构(PDB 4P78)是2014年解析的鼠疫杆菌HicAB3系统(Bibi-Triki et al, 2014)。晶体结构显示: HicB3单独存在时形成环状四聚体; 结合2分子HicA3后形成异源六聚体复合物。与鼠疫杆菌HicAB3复合物结构不同的是, 类鼻疽伯克霍尔德菌(PDB 6G26)(Winter et al, 2018)和肺炎链球菌(PDB 5YRZ)(Kim et al, 2018)复合物中HicA:HicB均以4:4的比例形成异源八聚体, 而大肠杆菌(PDB 6HPC) (Manav et al, 2019)HicAB以2:2的比例形成异源四聚体。由此可见, 不同HicAB TA复合物存在构象的多样化。我们采用AlphaFold 3预测了HmHicA:HicB为2∶2、2∶4和4∶4等不同比例复合物结构, 只有2∶2的模型pTM值在0.7附近, 其他比例约为0.3, 推测HmHicAB以异源四聚体的形式存在(图7a)。
图7 HmHicAB复合物结构特征分析

a. AlphaFold 3预测的HmHicA:HmHicB比例为2:2的复合物结构; b. HmHicA单体结构与TA复合物中的结构对比分析; c. HmHicB二聚体结构与TA复合物中的结构对比分析; d. TA复合物中HmHicA的表面电荷分析; e. TA复合物中HmHicB的表面电荷分析; f. TA复合物中HmHicA的关键活性位点His24所处周围环境分析

Fig. 7 Structural characterization of the HmHicAB complex. (a) Predicted 2:2 complex structure of HmHicA:HmHicB by AlphaFold 3; (b) structural comparison between the HmHicA monomer and its conformation in the TA complex; (c) structural comparison between the HmHicB dimer and its conformation in the TA complex; (d) surface charge analysis of HmHicA in the TA complex; (e) surface charge analysis of HmHicB in the TA complex; (f) analysis of the surrounding environment of the key active site His24 in HmHicA within the TA complex

在四聚体模型中, 两个HmHicA毒素单体彼此远离, 分别结合于HmHicB抗毒素形成的“V”形二聚体两侧N端毒素结合结构域(图7a)。通过比较HmHicA单体及TA复合物中的构象特征, 发现除连接β3与α2的环区存在轻微位移外, 毒素分子整体结构保持高度保守(RMSD=0.34Å) (图7b), 这表明HmHicA的功能抑制主要源于HmHicB对其活性位点的空间位阻效应。进一步的结构叠加分析显示, HmHicB在二聚体状态和复合物状态间的Cα原子均方根偏差仅为1.02Å, 证实抗毒素在结合毒素过程中未发生显著构象变化(图7c)。这一发现提示HmHicB可能通过预形成的二聚体结构直接捕获毒素分子。静电势分析揭示HmHicA与HmHicB表面分别呈现特征性的净正电荷(蓝色)和净负电荷(红色)分布(图5c、6c)。复合物界面分析表明, 说明二者互作过程中除了疏水和氢键相互作用之外, 电荷作用也发挥了重要作用(图7d、e)。HmHicA的催化关键残基His24精确定位于HmHicB的α1和β3形成的裂缝中。该残基的侧链通过两对氢键网络被固定: 其咪唑环Nδ1原子与HmHicB Ser28羟基(2.8Å)形成氢键, Nε2原子则与Glu42羧基氧(2.7Å)产生强静电相互作用(图7f)。这种三维空间限制导致HmHicA的活性口袋被完全封闭, 使其无法结合RNA底物, 这可能是毒素失活的主要分子机制。

3 讨论

TA系统广泛分布于细菌基因组、质粒、原噬菌体及整合型可接合转移元件等水平转移元件中。例如, 大肠杆菌K-12菌株中有7对TA系统定位于原噬菌体上, 表明原噬菌体是其重要载体(Fraikin et al, 2020)。已有研究表明, 位于温和噬菌体上的TA系统具有包括噬菌体防御、影响切离后原噬菌体稳定和调控原噬菌体溶原-裂解转化等多种重要的生理功能(Guo et al, 2024)。本研究前期在一株分离自丛生盔形珊瑚的Hm43005中鉴定到了三种原噬菌体, 其中两种原噬菌体(Phm1和Phm3)可以在DNA损伤的情况下被诱导切离, 而Phm2呈现稳定整合状态(Liu et al, 2024)。在多溶原状态下, 宿主如何调控原噬菌体之间的平衡非常值得研究。在本研究中, 使用TADB 3.0预测了Hm43005中TA系统的分布, 在原噬菌体Phm2上预测到一对HicAB TA系统。与典型的Ⅱ型TA系统类似, 它的抗毒素可以通过与毒素蛋白相互作用进而中和毒素毒性。
越来越多的证据表明, 一些种类抗毒素的DNA结合结构域除了结合自身启动子介导反馈调节机制之外, 还可以结合其他特定基因的启动子区抑制其转录, 从而参与细菌的环境适应过程。例如, MqsR/MqsA系统中的MqsA可结合Sigma因子和csgD基因启动子区, 调控细菌应激反应和生物膜形成(Wang et al, 2011; Soo et al, 2013); 铜绿假单胞菌HigA结合mvfR基因启动子区, 抑制其表达并影响致病性(Guo et al, 2019)。抗毒素通常结合在启动子区的一段特定的“回文序列”, 在这些关键转录因子的启动子区均发现与抗毒素所结合的序列存在。在本文中, 抗毒素通过结合到TA自身的启动子区的特征碱基进而调控TA系统的表达, 并且抗毒素具有非常强的DNA结合能力。因此有理由推测Phm2上的这对TA可以作为转录因子调控宿主内的其他基因的转录, 进而影响Hm43005的生理功能。
值得注意的是, 多数Ⅱ型TA的抗毒素或者TA复合物仅与启动子DNA的一段回文序列结合, 而HmHicAB系统结合启动子的区域有两段: -35区上游的“GGGTTATTGGGGTTAT”和位于-10区“GGGGTTATAGTAACCCC”。这两个区域都具有“GGGTTAT”7个碱基的重复区域, 而-35区上游的序列具有两个这样的重复序列, -10区具有一个重复序列和“TAACCCC”的回文序列。HmHicAB在启动子区结合两个具有不同特征的区域, 这与已鉴定的同家族成员有明显区别(Winter et al, 2018; Kim et al, 2018; Du et al, 2019)。近年来陆续报道了Ⅱ型TA系统在体内外可以按照不同的毒素和抗毒素的比例形成复合物(Garcia-Pino et al, 2016; Chen et al, 2020; Xue et al, 2020; Beck et al, 2024), 这两段序列可能分别对应抗毒素或者TA复合物的不同聚集状态的结合区域。由于具有结合不同DNA序列的能力, HmHicAB系统是否会在某种环境胁迫下激活, 使抗毒素结合到其他基因的启动子调控转录, 进而调控细菌生理功能, 这将是需要进一步研究的问题。
我们采用AlphaFold 3预测了HmHicAB系统的毒素、抗毒素和合体的多套结构模型, 通过对这些结构的对比分析揭示了HmHicA的毒性机制、HmHicB二聚化介导的RHH DNA结合结构域形成的机制以及HmHicB抑制HmHicA的活性机制。由于HmHicA具有较强的宿主毒性, 我们并没有成功表达出毒素蛋白进行酶学验证, 但与同家族成员一致的整体构像和保守的His24残基提示它也作为核酸酶发挥功能。在比较HmHicB单体和二聚体结果的时候我们发现了几处比较明显的构像变化, 尤其是单体中的RHH结构域的带区域在二聚化时形成了新的β折叠, 参与介导了HmHicB “V”字形二聚体结构的形成。此外, HmHicA的催化关键残基His24位于HmHicB的α1和β3形成的裂缝中, 通过两对氢键网络被固定, 使其无法结合RNA底物, 可能是毒素结合抗毒素后失去核酸酶活性的主要分子机制。尽管不同物种中的HicAB形成比例不同的复合物, 这种毒素活性抑制的机制却相对保守(Bibi-Triki et al, 2014; Kim et al, 2018; Winter et al, 2018; Manav et al, 2019)。这种毒性抑制机制不仅解除了毒素对宿主生长的抑制, 还形成了TA复合物, 并使其可能作为新的转录因子发挥调控作用。因此研究噬菌体或其他可移动元件上的TA系统可以帮助我们发现一些新的噬菌体调控机制, 并且可以帮助我们更好地理解这些微生物的生存策略和适应性机制。

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