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热带海洋学报 >

2022 , Vol. 41 >Issue 6: 75 - 89

DOI: https://doi.org/10.11978/2021114

红树林专栏

红树植物拟海桑及其亲本的根际细菌群落特征分析

  • 叶锦成 , 1, 2 ,
  • 陈毅青 3 ,
  • 高琳 1 ,
  • 周鲜娇 1 ,
  • 钟才荣 3 ,
  • 张颖 1 ,
  • 王芸 , 1
展开
  • 1.岭南师范学院红树林研究院, 广东 湛江 524048
  • 2.暨南大学生命科学技术学院生态学系, 广东 广州 510632
  • 3.海南省林业科学研究院(海南省红树林研究院), 海南 海口 571129
王芸。博士, 副研究员, 主要从事微生物资源与生态学研究。email:

叶锦成(1997—), 男, 广东省云浮罗定市人。email:

Copy editor: 林强

收稿日期: 2021-08-30

  修回日期: 2021-10-11

  网络出版日期: 2021-10-13

基金资助

海南省林业科学研究院(海南省红树林研究院)基础性工作(KYYS-2021-04)

岭南师范学院红树林研究院开放课题(YBXM09)

海南省科研院所技术创新专项(JCYK-2021-10)

收起

Analysis of rhizosphere bacterial community characteristics of mangrove plant Sonneratia × gulngai and its parents

  • YE Jincheng , 1, 2 ,
  • CHEN Yiqing 3 ,
  • GAO Lin 1 ,
  • ZHOU Xianjiao 1 ,
  • ZHONG Cairong 3 ,
  • ZHANG Ying 1 ,
  • WANG Yun , 1
Expand
  • 1. Mangrove Institute, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China
  • 2. Department of Ecology, College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 3. Hainan Academy of Forestry (Hainan Mangrove Research Institute), Haikou 571129, China
WANG Yun. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2021-08-30

  Revised date: 2021-10-11

  Online published: 2021-10-13

Supported by

The Project of Basic Scientific Research Work of Hainan Forestry Research Institute (Hainan mangrove research institute)(KYYS-2021-04)

The Open Project of Mangrove Research Institute, Lingnan Normal University(YBXM09)

The Project of Technical Innovation Special Project of Hainan Scientific Research Institutes under Grant(JCYK-2021-10)

Fold

摘要

植物根际微生物群落能够从亲本传递给子代, 从而影响植物的表型。野外调查发现, 海桑属(Sonneratia)红树植物自然杂交杂种拟海桑在野外通常比亲本生长更为强壮, 表现出极强的生存优势。为探究这一现象的原因, 本研究从根际微生物角度出发, 利用细菌16S rRNA基因高通量测序技术, 对采自海南省东寨港的三种红树植物拟海桑(S. × gulngai)及其亲本海桑(S. caseolaris)和杯萼海桑(S. alba)的根际土壤进行根际细菌群落特征分析。结果表明, 三种红树植物根际细菌群落多样性高, 种类丰富, 分属于30门242科351属, 其中变形菌门(Proteobacteria)为最优势门, 在各个样本中丰度超过40%, 子代拟海桑继承亲本的根际微生物多数都属于这一类群。研究发现, 子代拟海桑与两亲本的根际细菌类群组成在门水平存在显著差异, 其中酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)在子代拟海桑中丰度分别为4.3%和6.5%, 显著高于亲本1%~2%的含量; 在亲本杯萼海桑中, 丰度高达19.8%的栖热菌门(Thermi)在子代中丰度仅有1%, 而热袍菌门(Thermotogae)(5%)甚至消失。总之, 子代拟海桑与亲本杯萼海桑的根际微生物群落组成相对于亲本海桑表现出更大的差异性。土壤理化性质分析发现, 子代拟海桑的土壤全氮(total nitrogen, TN)含量显著低于亲本, 含量相差3倍以上, 相关性分析表明, TN浓度与菌群中的浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)丰度显著负相关。通过功能预测分析发现, 子代拟海桑微生物群落中与基础代谢相关的碳水化合物、氨基酸、能量以及脂质代谢相关的功能基因丰度显著都高于亲本, 表现出代谢能力的增强。本研究认为, 子代拟海桑对亲本的根际土壤微生物进行了选择性继承, 菌群组成更为合理, 在保持菌群高度多样性的同时, 一些根际促生菌的含量增加, 使菌群基础代谢能力增加, 更有利于子代拟海桑的生长。

关键词： 红树; 海桑; 根际微生物; 细菌群落; 多样性

本文引用格式

叶锦成 , 陈毅青 , 高琳 , 周鲜娇 , 钟才荣 , 张颖 , 王芸 . 红树植物拟海桑及其亲本的根际细菌群落特征分析[J]. 热带海洋学报, 2022 , 41(6) : 75 -89 . DOI: 10.11978/2021114

Abstract

Plant rhizosphere microbes can be transferred directly from mother to offspring, these vertically-transmitted organisms can affect host phenotype. Field investigation revealed that Sonneratia × gulngai, a natural hybrid of mangrove plants of the genus Sonneratia, usually grew stronger than its parents, and showed stronger survival advantage. In order to explore the reasons for this phenomenon, the offspring's microbiome composition (S. × gulngai) was compared with its parents S. caseolaris and S. alba by the bacterial 16S rRNA gene high-throughput sequencing technology. The sediment samples were collected from the Dongzhaigang Mangrove National Nature Reserve of Hainan Island. The result showed the rhizosphere bacterial communities of the three mangroves were highly diverse and rich, and distributed into 30 phyla, 242 families and 351 genera. Proteobacteria contributed to 40% of all reads and constituted the predominant members, most of the inherited rhizosphere microbiome belonged to this phylum. Significant differences were also observed at the phylum level. In offspring S. ×gulngai, the abundance of Actinobacteria and Acidobacteria was 4.3% and 6.5% respectively, which are significantly higher than parent's 1%~2%; Thermi species were enriched to be dominant populations with relative abundances of 19.8% in the parent S. alba, but the numbers was only 1% in the offspring S. × gulngai, and found Thermotogae phylum (5%) was absent in the rhizosphere bacterial community of S.× gulngai. In short, microbiome composition differed more strongly between offspring S. × gulngai and the parent S. alba than S. caseolaris. The analysis of soil physical and chemical properties found that the soil total nitrogen (TN) content of S. × gulngai was significantly lower than that of the parent, with a difference of more than 3 times. Correlation analysis showed that the concentration of TN was significantly negatively correlated with the abundance of Planctomycetes, Actinobacteria, and Acidobacteria. Through functional prediction, some functional genes related to the basic metabolism in the offspring S. × gulngai microbial community were greatly enriched, S.× gulngai's metabolic capacity was enhanced. These findings showed that the selectively inherited some the rhizosphere soil microorganisms from their parents, which made the offspring's microbiome composition more reasonable and maintained higher diversity, some rhizosphere growth-promoting bacteria particularly enriched and increased the basal metabolic capacity, these changes promoted S. × gulngai to grow better than its parent.

Key words： mangrove; Sonneratia; rhizosphere microbial; bacterial community; diversity

红树林湿地生态系统广泛分布于热带、亚热带海岸, 具有美化环境、保护海岸、支持沿岸区域水生生物的栖息和觅食等生态服务功能(Giri et al, 2011; Alongi, 2014; 江睿 等, 2021)。红树林湿地还拥有丰富的生物多样性, 但由于气候变化、海平面上升和人为活动的影响, 红树林湿地面积迅速减少, 全球每年会减少1%~2%(Duke et al, 2007; Giri et al, 2011; Luis et al, 2019)。在过去的半个世纪里, 红树林湿地的面积已经下降了30%~50%(Duke et al, 2007; Polidoro et al, 2010; Donato et al, 2011)。如何保护并修复红树林湿地生态系统是当前红树林生态保护工作的一个重要研究内容。
海桑属(Sonneratia)红树植物是红树林的重要树种之一, 通常被认为是红树林海岸的先锋种(毛礼米 等, 2009; 李诗川 等, 2014), 开展海桑属红树植物的研究对红树林生态系统的修复具有重要意义。在我国的海桑属目前包含6个有效种(Duke, 1994; Zhong et al, 2020), 分别为: 海桑(S. caseolaris)、杯萼海桑(S. alba)、卵叶海桑(S. ovata)、拟海桑(S. × gulngai)、海南海桑(S. × hainanensis)和无瓣海桑(S. apetala)。拟海桑(S. × gulngai)最早由Muller等(1966)发现, 但未正式命名, 后由Duke(1984)于澳大利亚东北部再次发现并命名。1993年, 华南植物所高蕴璋(1993)在我国海南岛首次发现海桑属新种拟海桑。王瑞江 等(1999)通过形态学、花粉学、细胞学以及其他方面的比较研究, 认为在中国海南发现的拟海桑为杂交种, 它的嫌疑亲本为杯萼海桑(S. alba)和海桑(S. caseolaris), 并归并入S. × gulngai N. C. Duke。植物分类学家通过对拟海桑的分类学特征研究发现, 拟海桑是海桑和杯萼海桑的自然杂交种, 拟海桑及其亲本是广布种, 在中国海南省以及澳大利亚等地均有分布(Muller et al, 1966; 高蕴璋, 1993; 王瑞江 等, 1999; Zhong et al, 2020)。王瑞江 等(1999)通过对野外杂交种植株的形态学观察发现, 拟海桑植株个体明显比杯萼海桑和海桑高大, 这与Duke(1984)对澳大利亚的海桑植物杂种研究结果一致。
已有大量的研究表明, 根际微生物在植物的生长发育和植物病虫害的生物防治等方面都具有十分重要的生态学意义(李晴晴 等, 2019; 刘京伟 等, 2021)。此外, 宿主遗传学和植物微生物组成之间存在相互作用, 其中与根相关的微生物群落部分会受宿主遗传因素的影响(Peiffer et al, 2013; Schlaeppi et al, 2014; Edwards et al, 2015; Naylor et al, 2017; Deng et al, 2021), 植物表型能作为微生物组功能的预测因子和读数(Wagner, 2021)。最新研究表明, 根际微生物群还可以促进植物表型可塑性, 可以通过植物激素的产生来调节植物的生长发育(Lu et al, 2018)。Wang等(2010)还从红树植物中分离出一种在温室被证实能够显著改善实验植物生长的AMF(arbuscular mycorrhizal fungi), 可导致植物的高度、地面直径和生物量增加, 并使实验植物对N、P和K的吸收增加。因此研究子代杂交种拟海桑与其亲本的根际微生物群落关系对于解释杂交种拟海桑生长优势具有重要意义。
尽管目前研究者们已经在植物微生物群、根系分泌物和植物生长繁殖之间的相互作用等方面取得了重大进展, 但是对海桑属红树植物根际微生物这方面的报道仍然较少(Yang et al, 2014; 颜栋美 等, 2018; Muwawa et al, 2021)。针对野外杂交种拟海桑生长能力较强的特性, 国内外尚没有相关文献对造成这种现象的原因进行解释。目前第二代测序技术——高通量测序技术因其高效性、准确性成为研究土壤微生物的主要方法(Margulies et al, 2005; Quail et al, 2008; 周晓光 等, 2010; 闫绍鹏 等, 2012)。故本研究基于高通量测序技术对中国海南岛东寨港的杂交种拟海桑及其亲本海桑和杯萼海桑的根际细菌的群落结构特征进行研究, 分析杂交子代与亲本间的根际细菌菌群结构特征的差异, 对解释拟海桑的生存优势和红树林湿地生态系统的保护和修复工作具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验样本于2018年6月采集自海南省东寨港红树林保护区内, 在采样区100m×200m的区域中, 采用蛇形采样, 每种植物每隔30m选一个点, 利用土壤取样器在植物根区, 分别采集5份土壤混合均匀后装入无菌样品袋中, 并保存在专门的便携式冷却器中, 共获得土样9个。采集当天运回实验室进一步处理, 在实验室中, 每个土样被分成两份: 一份用于土壤理化性质分析, 在4℃下储存, 另一份在-80℃下储存用于进一步的根际土壤总DNA提取。本研究所采样本海桑的缩写为Sc, 杯萼海桑缩写为Sal、拟海桑缩写为Sg。

1.2 土壤化学性质测定

土壤全氮(total nitrogen, TN)和土壤全碳(total carbon, TC)利用碳氮元素分析仪(Elementar Vario EL Ⅲ, Elementar, 德国)测定(张威 等, 2009)。土壤全磷(total phosphorus, TP)采用钼锑抗显比色法测出, 速效钾(available potassium, AK)采用醋酸铵浸提—火焰光度计法测出(鲍士旦, 2000), 每个土样重复3次。

1.3 土壤细菌群落组成测定

采用MO BIO试剂盒并结合液氮冷冻研磨的方法提取土壤样品中微生物基因组DNA, 送至广州赛哲生物科技股份有限公司进行Illumina Miseq PE300高通量测序。土壤细菌群落组成检测选取细菌16S rRNA序列V4-V5区, 其扩增引物(Biddle et al, 2008; Jing et al, 2015)分别为515F(5′-GTGCCAG CMGCCGDGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCM TTTRAGTTT-3′)。PCR反应体系和反应参数设置具体参照文献(Jing et al, 2015)。物种分类的操作分类单元(OTU)根据barcodes将不同处理组的序列信息进行聚类。每个OTU对应的分类信息由silva数据库的比对得到, 其中OTU相似性为97%。

1.4 生物信息学分析

1.4.1 Alpha多样性分析

单样本的OTU多样性分析(alpha diversity)可以反映样本内微生物群落的丰富度和多样性, 利用每个OTU在样品中的有效序列的绝对丰度和相对信息(Edgar, 2013), 使用Qiime(Version1.9.1)计算Observed-OTUs、ACE、Shannon、Simpson和Chao1等指数, 以评估各样本中微生物群落的物种丰富度和多样性等差异。Chao1和ACE指数简单指群落中物种的数量, 而不考虑群落中每个物种的丰度情况。Shannon指数和Simpson指数受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响。

1.4.2 Beta多样性分析

利用Qiime(Version1.9.1)软件对所测所有样本的细菌群落构成进行分析, 采用主坐标分析(PCoA)和PERMANOVA对样本间的细菌种群结构差异显著性进行分析。

1.4.3 细菌类群的分类

为更好地寻找影响微生物群落的关键种, 确定所有微生物类群的作用和贡献, 根据Dai等(2016)提出的物种丰度划分, 把稀有类群的阈值设置为0.1%, 丰富类群的阈值设置为1%, 并根据它们的丰度将所有可操作的分类单元分为如下6个专属类别: 稀有物种(rare taxa, RT), 即在所有的样本中丰度均低于0.1%; 丰富物种(abundant taxa, AT), 在所有的样本中丰度均高于1%; 中等物种(moderate taxa, MT), 在所有样本中丰度在0.1%至1%之间; 条件稀有物种(conditionally rare taxa, CRT), 在所有样本中丰度均低于1%, 同时在部分样本中丰度低于0.1%; 条件丰富物种(conditionally abundant taxa, CAT), 在所有样本中丰度均高于0.1%, 同时在部分样本中丰度高于1%; 条件稀有或丰富物种(conditionally rare or abundant taxa, CRAT), 在部分样本中的丰度在低于0.1%, 同时在部分样本中的丰度高于1%。使用R语言(Version3.5.0)按照拆分标准把所有的OTUs进行拆分。

1.4.4 PICRUSt功能预测

PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)功能预测是基于微生物16S序列间的进化距离以及已知全序列的微生物的功能基因拷贝数, 对其他微生物物种功能基因的拷贝数进行推测, 进而估计整个样品中各个功能基因的丰度分布的一种方法。其可以较准确地对微生物群落的功能进行分析。根据PICRUSt开发者的评测, 对于NSTI<0.05的肠道微生物样品和NSTI≈0.17的土壤样品, PICRUSt的预测结果较好, 而对于NSTI≈0.23的微生物样品, PICRUSt的预测结果较差。该方法首先通过祖源序列重建算法, 对GreenGene数据库中收录的微生物进行16S rRNA拷贝数和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、eggCOG(Evolutionary Genealogy of Genes: Clusters of Orthologous Groups of proteins)及RFAM功能注释对应基因的拷贝数进行推测, 得到每个物种单位拷贝的16S rDNA对应的功能注释的丰度。然后根据上一步推测得到的数据, 对样品中各个物种的16S rRNA拷贝数进行校正。之后根据校正后的16S rRNA拷贝数, 对样品中各个功能或注释条目的拷贝数进行估计, 并进行后续的差异分析。最后根据KEGG和eggCOG数据库中的分层分类信息, 在不同层级将功能基因进行归类, 并计算不同分层水平下, 不同类别功能基因在样品中的丰度(Langille et al, 2013)。

1.5 数据统计

使用Qiime(Version1.9.1)软件评估样品的根际土壤细菌菌群多样性, 计算多样性指数后使用SPSS(Version13.0)进行ANOVA+Turkey HSD test。根据不同的距离矩阵计算方式计算Unweighted Unifrac, Weighted Unifrac, Bray Curtis, Euclidean距离矩阵后使用R语言(Version 3.5.0)进行PCoA分析和作PCoA图进行Beta多样性展示(Hamady et al, 2010; Yatsunenko et al, 2012; Jiang et al, 2013)。使用Microsoft Excel 2016对测序所得的原始OTUtable中的各分类菌群进行丰度的排序, 选择优势菌群使用GraphPad Prism(Version 8.0)绘制相对丰度累加图展示。此外还使用SPSS(Version13.0)对土壤理化性质环境因子进行ANOVA+Duncan检验以及其和菌群的相关性分析(Spearman), 检验显著性水平为P<0.05。此外PERMANOVA组间相似性统计分析、物种丰度拆分、热图、三元图的绘制均由R语言(Version 3.5.0)进行(Oksanen et al, 2007)。

2 结果与分析

2.1 测序数据

对三种样品, 每种三个重复, 共9个样本进行测序, 测序结果如表1。根据测序数量可知, 每个样本的测序数量均超过3万条, 稀释性曲线趋于平台期(数据没有显示), 说明结果能够比较全面真实地反映根际土壤微生物群落组成。聚类后共获得11475个有效OTU(97%的相似度)。共获得30门, 242科, 251属的根际土壤细菌。门、科、属、种的可注释水平分别为86.95%、41.53%、10.41%和0.36%。
表1 土壤样本测序数据量统计

Tab. 1 Statistics of soil samples volume sequencing data

样品 OTUs 测序总量
Sc1 6333 38105
Sc2 5987 37913
Sc3 6059 38142
Sal1 1037 39702
Sal2 1905 37969
Sal3 1336 37147
Sg1 5264 39259
Sg2 6409 39784
Sg3 6975 39264

注: 操作分类单元OTUs为按照97%的相似度对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类得到的OTU代表序列量

2.2 细菌群落结构组成与差异性分析

在门水平上, 由图1a可知, 三种样品的根际土壤细菌主要类群包括变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、栖热菌门(Thermi)和厚壁菌门(Firmicutes)7个类群。变形菌门是所有样本共同的绝对优势门, 在各组样本中占比均达到40%以上。不同样品的丰富细菌类群种类和相对丰度具有差异。在Sc样品中丰度排名前四的门依次是变形菌门(Proteobacteria) 40.38%、绿弯菌门(Chloroflexi)14.37%、浮霉菌门(Planctomycetes) 6.02%、拟杆菌门(Bacteroidetes)4.33%。丰度占比达65.15%。在Sg样品中丰度排名前四的门依次是变形菌门(Proteobacteria)45.78%、浮霉菌门(Planctomycetes)11.25%、绿弯菌门(Chloroflexi) 6.84%、酸杆菌门(Acidobacteria)6.5%。丰度占比达70.37%。在Sal样品中丰度排名前四的门依次是变形菌门(Proteobacteria)47.35%、栖热菌门(Thermi) 19.84%、拟杆菌门(Bacteroidetes)13.32%、厚壁菌门(Firmicutes)5.86%。丰度占比达86.37%。其中Sal样品的丰度丰富细菌类群在三种样品中丰度占比最高, 具有高优势。从丰度丰富细菌类群组成方面分析, 样品Sg的菌群各门与Sc更为相似, 样品Sal的菌群组成与Sc、Sg的差异较大。从丰度方面分析, 丰富细菌类群在子代和亲本的丰度具有显著差异(图2), 例如Sg的酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的丰度分别为4.3%和6.5%, 显著高于亲本的1%~2%的含量, 且与Sc比较更为显著。在Sal中占比高达19.8%的栖热菌门(Thermi)在Sg和Sc中占比少于1%。占比5%的热袍菌门(Thermotogae)在Sg中消失。在属水平上, 结合图1b分析, 发现在属水平上不同样品间的丰度丰富根际细菌类群的组成也具有较大的差异。在数量上, 随着分类水平的降低, 三种样品属水平丰度丰富菌群种类减少。此外Sg浮霉菌门的Planctomyces属相对丰度高于其他样品, 栖热菌门的g__B-42属和变形菌门的Sulfurimonas属的相对丰度低于其他样品。
图1 各样本细菌群落构成与比较。

a. 各样品菌群组成在门水平相对丰度; b. 各样品菌群组成在属水平相对丰度; c. Venn图展示不同样本的共有和特有的OTU数量; d. 基于Weighted unifrac距离的主坐标分析

Fig. 1 Composition and comparison of bacterial community in each mangrove species. (a) Relative abundance map at phylum level. (b) Relative abundance map at genus level. (c) The Venn diagram shows the number of common and unique OTUs for different samples. (d) Principal coordinate analysis generated using Weighted unifrac distance

图2 主要细菌菌群(门水平)的丰度差异

配对样本T检验, ***P<0.001; **P<0.01; *P <0.05; ns P>0.05

Fig. 2 The difference in the abundance of the main bacterial flora(Phylum level, Paired-Samples T Test, ***P<0.001; **P<0.01; *P <0.05; ns P>0.05)

2.3 Venn图分析

通过维恩图可以直观地比较不同海桑样品根际土壤样本间共有和特有的OTU数量, 并反映出样本在OTU水平上的细菌物种组成差异(图1c)。三种海桑样品, 9个样本共测出11475条OTU, 其中Sc5980条、Sg6838条、Sal1329条。三种样品共有OTU数目为331, 占比2.8%。Sc和Sg共有的细菌OTU数量为1255, 同时Sc特有OTU数量为4048, Sg为5113; Sc和Sg两者共有细菌OTU数量占14.12%, 同时Sc和Sg各自特有的OTU数量分别占35%和43.5%。Sal和Sg共有的细菌OTU数量为139, 同时Sal特有OTU数量为513, Sg为5113; Sal和Sg两者共有细菌OTU数量占1.18%, 同时Sal特有的OTU数量占4.36%。说明三种样品中菌群结构差异程度各不相同。Sc和Sg的共有OTU数目最多, 差异程度最小, 相似性最高。Sal和Sg的差异程度大, 相似性低。

2.4 Alpha多样性分析

根际细菌群落的各α多样性指数的计算结果表明, 三种海桑根际细菌群落多样性高(表2)。对样本间的多样性指数进行ANOVA+Turkey HSD test发现, Sc和Sg样本的Observed-OTUs、ACE、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数数值相似性高, 而Sal样本的Observed-OTUs、ACE、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数与Sc和Sg样本比较显著偏低。表明样本Sc和样本Sg间的多样性无显著性差异, 而Sc与Sal、Sal与Sg之间存在显著差异性。
表2 三种海桑的根际细菌群落α多样性指数分析(平均值±标准误差)

Tab. 2 Alpha diversity index of rhizosphere bacterial community of three species of Sonneratia (Mean±SD)

红树物种 香农维纳指数 OTUs观测量 Chao1指数 Ace指数 辛普森指数
Sc 10.44±0.12a 5196.67±43.59a 7482.27±197.88a 7883.287±140.61a 1±0a
Sg 10.53±0.24a 5353.33±562.37a 6882.33±769.47a 7231.98±801.72a 1±0a
Sal 5.65±0.56b 1289.67±357.69b 2229.13±464.49b 2363.41±533.58b 0.93±0.02b

注: 上标不同字母的比较样本之间存在显著差异

2.5 Beta多样性分析

Beta多样性统计分析揭示了样本之间的细菌群落差异, 基于Bary-Curtis、Enclidean、unweighted Unifrac、weighted Unifrac距离。利用PCoA分析, 不同距离矩阵PCoA结果均表明不同海桑样品之间的根际微生物细菌的群落组成具有一定的差异性, 其中Weighted Unifrac距离关注样品间物种种类以及数量的组成差异。不同样本间的Weighted unifrac distance均值Sc与Sg为0.57, Sal与Sg为0.73, Sc与Sal为0.73。PCoA分析结果(图1d)显示Sg与Sc的距离值更短, 表明它们根际细菌菌群的物种种类以及数量的组成更为相似。进一步利用PERMANOVA检验发现三种样品根际土壤细菌群落组成差异并不显著。

2.6 物种丰度划分

所有细菌OTU被划分到6个分类群类别, 对于潜在的区分群落的关键类群AT、CAT、CRAT的归类情况如下: 没有OTU被归类为AT(在所有样本中相对丰度都高于1%的OTU), CAT(仅在一些样本中相对丰度高于1%, 但从不低于0.01%的OTU)包含2个OTU, 均属于变形菌门, CRAT组(在部分样本中的相对丰度低于0.1%, 同时在部分样本中的相对丰度高于1%)包含31个OTU。研究认为微生物群落的特征是少数优势高丰度分类群和低丰度稀有分类群影响的结果(Sogin et al, 2006; Pedrós-Alió, 2007; Galand et al, 2009), 参考Dai等(2016)的研究方法, 对本研究的每组划分结果进行综合分析后认为本研究的CRAT组最具代表意义。对该组的物种绘制热图(图3)直观地呈现出多个样本多个OTU的全局丰度分布变化和多OTU丰度分布的聚类关系, 并绘制三元图(图4)分析各根际细菌群落之间的差异性OTUs的贡献度, 等边三角形中圆点的位置由三种海桑属样本的根际微生物群对各OTU相对丰度的贡献确定(Dombrowski et al, 2017)。由图3可知, CRAT组中Sc样本的高丰度OTU均属于变形菌门(2个), Sg样本的高丰度OTU属于变形菌门(4个)和厚壁菌门(2个)。Sal样本的高丰度OTU属于变形菌门(12个)、拟杆菌门(4个)、绿菌门(3个)、厚壁菌门(2个)、热袍菌门(1个)和栖热菌门(2个)。三种样品根据多组值间两两的差异程度(欧氏距离)进行聚类发现样本在系统关系上(图上方的树状结构)分为了两类。一类是Sc和Sg, 另一类是Sal。结合三种样本关键类群的数量和分类的差异说明了菌群的相似程度为Sc和Sg更相似, Sal样本中的菌群异质性相对较高。图4中三角形的三个点分别代表三个样品组, 从图中看出距离Sc近的有一个OTU, 来自变形菌门, 距离Sg近的有两个OTU来自变形菌门和拟杆菌门, 距离Sal近的也有两个OTU来自厚壁菌门和变形菌门。综合图3和图4分析, 三种样品中确实存在能区分三种样品根际土壤细菌群落的关键OTU。
图3 各样本CRAT拆分组OTU水平热图

Fig. 3 Heat map of OTU level of each sample CRAT split group

图4 各样本CRAT拆分组OTU水平的三元相图

Fig. 4 The ternary plot of the OTU level of each sample CRAT split group

2.7 土壤理化性质与微生物群落多样性的关系

对不同样品土壤测定了全碳(TC)、全氮(TN)、全磷(TP)和速效钾(AK)含量, 并分析计算得出碳氮比(C/N)和氮磷比(N/P), 各数值如表3所示。结果显示Sc样品的土壤全碳含量较高; Sc和Sal的根际土壤全氮量比Sg高3倍以上。
表3 土壤样品的理化性质(平均值±标准误差)和ANOVA显著性分析、Duncan检验多重比较结果

Tab. 3 Physicochemical characteristics of soil samples (Mean±SD) and ANOVA significance analysis, Duncan test multiple comparison results

理化指标 样品
Sc Sg Sal
TC/(mg.g-1) 24.33±2.07a 13.17±0.60b 15.60±2.30b
TN/(mg.g-1) 4.33±0.06b 1.21±0.05c 4.64±0.04a
TP/(mg.g-1) 0.34±0.02b 0.72±0.04a 0.67±0.03a
AK/(mg.g-1) 0.51±0.01b 0.34±0.02c 0.67±0.01a
C/N 5.62±0.52b 10.82±0.13a 3.36±0.52c
N/P 12.45±0.67a 1.68±0.03c 6.93±0.24b

注: 上标不同字母的比较样本之间存在显著差异(P<0.05)

应用相关分析方法研究TC, TN, TP, AK, C/N, N/P和变形菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、绿菌门、芽单胞菌门、WS3、螺旋体门、酸杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、栖热菌门、热袍菌门之间的相关关系, 使用Spearman相关系数表示相关关系的强弱情况, 结果如表4所示。由表4可知, TC与变形菌门丰度具有显著负相关关系; TN和浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门丰度之间具有显著负相关关系, 而与绿菌门、厚壁菌门、栖热菌门、热袍菌门丰度之间有着显著的正相关关系; TP与变形菌门丰度具有显著正相关关系。
表4 土壤理化性质与门水平主要细菌的相关性

Tab. 4 Correlation between soil physical and chemical properties and main bacteria at phylum level

细菌门 中文名 TC TN TP AK C/N N/P
Proteobacteria 变形菌门 -0.817** 0.217 0.700* 0.159 -0.283 -0.667*
Chloroflexi 绿弯菌门 0.433 -0.467 -0.517 -0.402 0.433 0.467
Planctomycetes 浮霉菌门 -0.417 -0.917** 0.333 -0.854** 0.883** -0.433
Bacteroidetes 拟杆菌门 -0.233 0.65 -0.05 0.678* -0.817** 0.1
Chlorobi 绿菌门 0.35 0.967** -0.267 0.879** -0.933** 0.383
Gemmatimonadetes 出芽单胞菌门 0.1 -0.5 0.083 -0.770* 0.6 -0.1
WS3 0.417 -0.483 -0.533 -0.418 0.417 0.483
Spirochaetes 螺旋体门 0.433 -0.383 -0.55 -0.385 0.35 0.533
Acidobacteria 酸杆菌门 -0.433 -0.933** 0.3 -0.879** 0.850** -0.417
Firmicutes 厚壁菌门 -0.117 0.717* 0.4 0.527 -0.533 -0.267
Actinobacteria 放线菌门 -0.45 -0.867** 0.383 -0.904** 0.800** -0.483
Thermi 栖热菌门 0.317 0.850** -0.433 0.887** -0.917** 0.5
Thermotogae 热袍菌门 0.356 0.881** -0.39 0.877** -0.915** 0.492

注: * P<0.05, ** P<0.01

2.8 PICRUSt功能预测

本研究的样本丰度≥0.1%OTU水平下的NSTI值为0.15~0.18, 根据PICRUSt开发者的评测结果(Langille et al, 2013)认为该预测结果较好。KEGG功能预测分析结果显示(图5), Environmental Information Processing中的Membrance Transport功能基因丰度和Metabolism中的碳水化合物、氨基酸、能量以及脂质代谢等功能基因在Sg样品中丰度比亲本高。而COG功能预测同样发现Metabolism功能相关的碳水化合物、氨基酸、能量代谢等基因丰度在Sg样品中高于亲本。RFAM功能预测在RFAM数据库(http://rfam.xfam.org/)对比发现Sg样品的RF01687 (Acido-Lenti-1, 主要在变形菌门和酸杆菌门中的物种发现)、RF01383(编码一种属于谷氨酸门控离子通道家族的蛋白质, 只在变形菌门中的1个物种发现)、RF00519(一种蛋白质编码的RNA, 全部在细菌的变形菌门的物种中发现)、RF01668(一种蛋白质编码的RNA, 全部在细菌的变形菌门的物种中发现)、RF00023(transfer-messenger, 主要在变形菌门、厚壁菌门、放线菌门的物种中发现)、RF00169(细菌小信号识别颗粒RNA, 主要在变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门的物种中发现)和RF00010 (Bacterial RNase P class A, 主要在变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门的物种中发现)等RNA分子的丰度显著上升。
图5 KEGG二级分类预测丰度聚类热图

功能基因丰度是功能基因数目取log10值所得

Fig. 5 KEGG secondary classification prediction of abundance clustering heat map Functional gene abundance is obtained by taking the log10 value of the number of functional genes

3 讨论

红树林已经适应了潮间带—陆地和海洋生态系统之间的界面。研究表明, 红树林在生理、生态和基因组水平上具有适应性进化(Feng et al, 2020)。以往学者们对于红树植物的研究大多集中于分类、分布、生理生态、用途及价值等方面(李海生, 2003), 对海桑属红树植物的研究多关注无瓣海桑的引种及其所造成的影响(Ren et al, 2009, 2010; 曹雷雷 等, 2015, Yu et al, 2020)。在微生物水平上研究区域的红树林湿地的沉积物的微生物群落结构、污染物对微生物群落的影响、参与生物化学循环的功能菌等(Bharathi et al, 1991; Brito et al, 2006; Tian et al, 2008; Zhou et al, 2009; Jiang et al, 2013)。本文采用高通量测序技术, 对具有亲缘关系的三种海桑属红树植物: 海桑(Sc)、杯萼海桑(Sal)、拟海桑(Sg)的根际土壤细菌种类进行鉴定, 分析细菌群落结构、菌群多样性, 预测细菌的生物学功能。认识了海桑属红树植物根际土壤细菌菌群的一般结构, 探究了具有亲缘关系的不同海桑属之间在根际细菌结构上的相似性和异质性, 并尝试从微生物角度去探讨根际微生物组成与杂交拟海桑具有的生长优势的关系。
拟海桑及其亲本三种海桑属样品的根际土壤细菌多样性较高。本研究的拟海桑及其亲本的根际细菌群落Shannon指数为5.12~10.73, 高于任健 等(2012)对东寨港秋茄林(Shannon指数4.15~4.96)和无瓣海桑(Shannon指数3.3~3.6)的土壤细菌多样性研究结果, 以及陈玉军 等(2004)对海南省琼山县三江河两岸的红树植物无瓣海桑(Shannon指数为1.18~1.88)、海桑(Shannon指数为1.29~2.22)、秋茄(Shannon指数为0.70~1.33)三种人工林群落的系统研究结果。
三种海桑样品的根际细菌群落结构有较高的相似性。变形菌门细菌广泛生活在土壤、海水和滩涂淤泥中(王勇忠, 2015; 吴冬梅, 2018, 柳旭, 2019;张起畅 等, 2020)。变形菌门在各海桑样本的根际细菌群落相对丰度均超过40%, 为绝对优势门。与任健 等(2012)对无瓣海桑林下土壤细菌组成的研究结果相似, 但是低于张起畅 等(2020)研究海南东寨港红树林淤泥中的变形菌门占比为83.78%的水平。各海桑样本除优势门变形菌门外, 其余丰度丰富菌群在组成和丰度上均具有明显差异。其他较丰富的类群包括: 浮霉菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、厚壁菌门等。除变形菌门外, 其余的丰度丰富菌群的丰度均在拟海桑和海桑样品间存在显著差异。本研究发现亲本杯萼海桑(Sal)的丰度丰富菌群种类少但是占比高, 具有高优势, 这是造成Sal较Sc、Sg菌群多样性偏低的主要原因。杯萼海桑的栖热菌门的OTU属于楚帕氏菌科(Trueperaceae), g_B-42属, g_B-42属的具体功能尚未清楚, 楚帕氏菌科细菌被证实为堆肥过程中的降温期和成熟期的标志微生物, 具有碳代谢和氨基酸代谢的重要功能(Zhang et al, 2020)。拟海桑及其亲本样品的根际土壤细菌在菌群多样性和结构方面对比三亚湾海草根际微生物(周卫国 等, 2019)和三沙湾沙滩微生物(王勇忠, 2015)发现, 优势门变形菌门在海草根际微生物和沙滩中占比最高, 海草为70.87%, 沙滩为50.0%, 海草的Shannon指数为7.74, 故拟海桑和海桑样品的根际土壤细菌在菌群多样性比海草高。而杯萼海桑则比海草低。子代拟海桑的根际细菌菌群结构与亲本具有差异, 表明尽管根际微生物能从亲本传递给子代, 但会发生过滤, 在过滤作用下, 亲本的个别丰度丰富菌群在子代的丰度显著降低, 甚至消失。
拟海桑及其亲本的根际细菌的群落物种组成的异质性不高。利用物种丰度划分的方法寻找可能造成异质性的关键种, 发现条件稀有或丰富类群(CRAT)的OTUs来自丰度占优势的变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、热袍菌门和栖热菌门。三元图对CRAT的OTUs进行贡献度分析发现对拟海桑及其亲本根际细菌群落区分贡献度大的OTU来自变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。说明在细菌群落物种组成上, 三种样品间存在着能区分群落的OTU但是数量较少。
子代拟海桑根际微生物群落中放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度显著升高。放线菌门是土壤中分布最广的细菌门之一, 以其在体外降解植物残体的能力而著称, 能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂(Bao et al, 2021)。Li等(2018)研究发现放线菌门的根际促生菌可以产生吲哚乙酸(indole-3-aceticacid, IAA), 丰富的根际微生物之一节杆菌(属于放线菌门)已被报道具有产生IAA促进植物生长的能力。酸杆菌门(Acidobacteria)是一类重要的功能菌。多项研究发现酸杆菌门(Acidobacteria)在重要生态过程中的动态作用, 即调节生物地球化学循环、分解生物聚合物、分泌胞外多糖和促进植物生长, 还具有多种代谢途径所涉及的基因, 这些基因可能有助于根际存活和竞争定殖(王光华 等, 2016; Kalam et al, 2020)。本研究通过PICRUSt功能预测发现Sg样本的碳水化合物、氨基酸、能量以及脂质代谢等与代谢相关的功能基因丰度明显高于亲本。酸杆菌门和放线菌门细菌的丰度增加, 使得相关功能基因增加, 并导致拟海桑的根际细菌代谢能力增强, 代谢产物增多, 供养增多, 能为拟海桑生长提供更多的营养。这提高了拟海桑的生存能力, 使其具有生长优势。
土壤理化性质的测定中, 海桑和杯萼海桑的土壤全氮量比拟海桑的数值高3倍, 对比任健 等(2012)同一地区的无瓣海桑林的土壤理化性质, 发现本研究的根际土壤样品的TN、TP等含量均增加。Lu等(2021)模拟氮沉降对黄河三角洲滨海湿地土壤微生物群落多样性的影响研究发现, TN和TC的含量是影响土壤细菌多样性的最重要因素, 模拟TN含量增高会导致土壤细菌多样性下降, 人为提高TN含量会导致富营养类群(变形菌门)丰度提高, 降低贫营养类群(酸杆菌)的丰度。此外多项研究发现高的TN含量会抑制或降低微生物菌群的多样性(Van Diepen et al, 2010; 袁颖红 等, 2013; Li et al, 2016; 沈芳芳 等, 2019; 林婉奇 等, 2020)。本研究的客观结果是Sg样本的TN含量显著低于亲本, 且其变形菌门的丰度与亲本比较并无显著降低, 相反其酸杆菌门的丰度还明显增高。所以拟海桑TN含量降低不是人为因素导致的。Wang等(2010)从红树植物中分离出使实验植物对N、P和K的吸收增加的AMF, 故拟海桑放线菌门和酸杆菌门细菌丰度的增加也可能促进拟海桑对N元素的吸收增加。研究还发现植物分泌的化感物质(如酚类、酸类物质)也有助于植物吸收N、P以及金属离子等营养成分(Chapin III, 1995; Bradley et al, 1997)。齐璐(2019)研究表明Proteobacteria在有机基质降解方面作用巨大, 并在其中已发现多种可进行固氮的细菌, 但细菌的活性受多因素影响, 如pH等, 而根际土壤的pH值受植物根系的分泌物所形成的根际效应影响(张福锁 等, 1992; 朱丽霞 等, 2003)。故造成海桑与亲本间的TN含量差异可能是植物-根际微生物互作的结果。相关性分析研究了TN和13项丰度丰富门细菌之间的相关关系后发现, 拟海桑样品的酸杆菌门、放线菌门丰度显著升高与TN含量低相关。酸杆菌门和放线菌门的细菌含有的代谢功能基因丰富, 根系是植物吸收营养的场所, 根际微生物作为植物的第二基因组能够影响植物对营养物质的吸收。综上所述, 拟海桑生长优势的出现与其根际微生物的结构和功能的变化是相关联的。营养物质、根际微生物结构和代谢能力的变化等多因素综合作用可导致拟海桑的生长优势的出现。此外还有许多预计会影响微生物组成和活动的植物性状的因素, 例如根系分泌物(Zhalnina et al, 2018)和根系结构(Saleem et al, 2018), 并且可能由大量基因控制(Deng et al, 2021)。本研究增加了我们对近缘海桑属红树植物根际细菌群落结构组成及其生态功能的了解。
在分析亲缘关系对微生物群分类组成的影响时, 由于16S rRNA基因测序相对简单且经济实惠, 因此本研究使用这一当前广泛应用的标准方法进行量化。然而, 由于rRNA基因变异的分辨率不足和分类群之间的功能冗余, 该技术无法有效区分对宿主有功能影响和没有功能影响的微生物, 并面临着一系列问题和挑战(黄志强 等, 2021)。未来在相关研究中, 期待能发展、完善或发现更有效的方法。

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