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热带海洋学报 >

2017 , Vol. 36 >Issue 4: 87 - 92

DOI: https://doi.org/10.11978/2016117

雷州半岛近岸海域海洋红酵母的分离鉴定

  • 孙建男 , 1, 2 ,
  • 刘影 1 ,
  • 谢为天 1 ,
  • 徐春厚 , 1
展开
  • 1. 广东海洋大学, 广东 湛江 524088
  • 2. 奥健生物科技有限公司, 广东 广州 510000
通讯作者:徐春厚。E-mail:

作者简介：孙建男(1989—), 女, 辽宁省朝阳市人, 硕士, 研究方向为微生物学与分子生物学。E-mail:

收稿日期: 2016-11-16

  要求修回日期: 2016-12-27

  网络出版日期: 2017-07-26

基金资助

广东省科技计划项目(2013B020307013)

广东省农业科技项目(201201147)

湛江市科技计划项目(2015B01013)

收起

Isolation and identification of marine Rhodotorula in a coastal area near Leizhou Peninsula

  • SUN Jiannan , 1, 2 ,
  • LIU Ying 1 ,
  • XIE Weitian 1 ,
  • XU Chunhou , 1
Expand
  • 1. Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China
  • 2. LIGENSIA Bio-Technology Limited Incorporation, Guangzhou 510000, China
Corresponding author: XU Chunhou. E-mail:

Received date: 2016-11-16

  Request revised date: 2016-12-27

  Online published: 2017-07-26

Supported by

Science and Technology Program of Guangdong Province (2013B020307013)

Agricultural Science and Technology Program of Guangdong Province (201201147)

Science and Technology Program of Zhanjiang (2015B01013)

Copyright

热带海洋学报编辑部
Fold

摘要

从雷州半岛近岸海域采集海洋生物、海水、海泥等样品, 共计317份。将样品处理后先富集培养, 再用红酵母琼脂培养基及麦芽汁琼脂培养基进行分离培养, 之后对分离菌株通过菌体形态、培养特性及生理生化试验结果进行初步鉴定。根据红酵母的初步鉴定结果, 选取有代表性的菌株作26s rDNA D1/D2区域序列测定, 构建系统发育树, 进行多样性分析。结果表明, 从317份样品中分离鉴定出71株海洋红酵母; 其中, 有代表性的36株红酵母归属于5个种和2个疑似新种。36株红酵母包括胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)22株、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)6株、红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)3株、斯鲁菲亚红酵母(Rhodotorula slooffiae)2株、浅红红酵母1株(Rhodotorula pallida)和疑似红酵母新种2株(Rhodotorula sp, cZDJ2和Rhodotorula sp. ZTC2)。雷州半岛近岸海域的海洋红酵母优势种为胶红酵母, 种群的多样性不够丰富。

关键词： 海洋红酵母; 分离鉴定; 近岸海域; 雷州半岛

本文引用格式

孙建男 , 刘影 , 谢为天 , 徐春厚 . 雷州半岛近岸海域海洋红酵母的分离鉴定[J]. 热带海洋学报, 2017 , 36(4) : 87 -92 . DOI: 10.11978/2016117

Abstract

In this study, 317 samples from marine organisms, seawater and sea mud were gathered in a coastal area near the Leizhou Peninsula. After basic process and enrichment culture, marine Rhodotorula was isolated by using Rhodotorula agar medium and wort agar medium. The Rhodotorula strains were preliminary identified by using cell morphology characteristics, cultural characteristics, physiological and biochemical test results. Based on the preliminary identification results, representative strains were tested by 26s rDNA D1/D2 domain sequence analysis, phylogenetic tree was constructed and diversity was analyzed. The 71 strains isolated from 317 samples were preliminary identified as marine Rhodotorula among which 36 representative strains were identified as belong to five species and two suspected to be new species. Among them, 22 strains were R. mucilaginosa, six strains were R. glutinis, three strains were R. toruloides, two strains were R. slooffiae, one strain was R. pallida, and two strains were suspected to be new species named Rhodotorula sp. cZDJ2 and Rhodotorula sp. ZTC2, respectively. The dominant species of marine Rhodotorula in the coastal area near the Leizhou Peninsula was Rhodotorula mucilaginosa, indicating that the diversity of population in the coastal area near the Leizhou Peninsula was not rich enough.

Key words： Marine Rhodotorula; Isolation and Identification; Coastal area; Leizhou Peninsula

海洋红酵母是存在于海洋环境及海洋生物中的单细胞真核微生物。国外研究表明, 在南极、北极、太平洋、印度海岸、深海火山及一些受污染海域中, 均有红酵母的分布, 且有些为优势种群(Hagler et al, 1981; Prabhakaran et al, 1991; Yamasato et al, 1994; Connell et al, 2009; Zhang et al, 2012; Singh et al, 2014)。海洋红酵母富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、消化酶、维生素等多种生物活性物质, 具有较高的营养价值和活性作用, 可作为食品添加剂、功能生物饲料、抗氧化剂及微生物拮抗剂等产品的原料(叶伟庆 等, 2013; 孙建男 等, 2015; 汪洋 等, 2015; Zhang et al, 2016)。
周与良 等(1999)从中国黄海、渤海沿岸采集多种样品, 共分离出4种海洋红酵母, 其中牧草红酵母9株、小红酵母19株、粘红酵母39株、深红酵母153株。魏艳敏 等(1997)对长江流域红酵母进行了调查, 发现我国长江流域中主要存在着深红酵母、粘红酵母、小红酵母等3种红酵母。目前, 对于中国南海海域红酵母种类的调查研究报道甚少。本研究团队从我国南海近岸海域采集样品, 分离出了4株海洋红酵母, 2株鉴定为胶红酵母、1株粘红酵母、1株未定种名的红酵母(叶伟庆 等, 2013); 由于分离菌株数量较少, 尚不能说明该海域红酵母的多样性。因此, 本研究团队于2014年8月至2015年7月期间, 再次从雷州半岛近岸海域采集样品, 继续进行红酵母的分离鉴定, 以期对南海近岸海域的红酵母种群多样性进行分析, 为将来开发利用海洋红酵母提供菌种库及试验依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

从雷州半岛近岸海域采集海洋生物、海水、海泥等样品317份, 主要包括带鱼、马友鱼、石斑鱼、白骨鱼、红腊鱼、黄花鱼、沙丁鱼、鱿鱼、章鱼、明虾、螃蟹、鲎、海草、海水、海泥(10m深海底)、红树根、红树叶。将采集的样品放入灭菌封口袋或灭菌瓶内, 冰盒内保存和运输。
称取海泥5g, 加入50mL灭菌海水, 振荡混合, 纱布过滤, 取滤液待用; 称取海草、红树根或红树叶5g, 剪碎, 加入50mL灭菌海水, 振荡混合, 纱布过滤, 取滤液待用; 取鱼肠道内容物0.2~1g, 加入2~10mL灭菌海水, 振荡混合, 纱布过滤, 取滤液待用。

1.2 培养基配制

1.2.1 富集培养基
蛋白胨20g·L-1, 酵母膏10g·L-1, 葡萄糖20g·L-1, 谷氨酸钠0.1g·L-1, 过滤海水600mL·L-1, 蒸馏水400mL·L-1, pH4.8~5.0, 115℃灭菌30min。
1.2.2 红酵母琼脂培养基
在富集培养基中加入琼脂粉20g·L-1, 即为红酵母菌琼脂培养基。
1.2.3 麦芽汁琼脂培养基
麦芽汁琼脂培养基145.1g, 过滤海水600mL·L-1, 蒸馏水400mL·L-1, 115℃灭菌30min。

1.3 红酵母的分离鉴定

1.3.1 红酵母的富集培养
分别取海泥、海草、红树根、红树叶、鱼肠道内容物滤液1mL, 接种于10mL富集培养基中; 取1mL海水接种于10mL富集培养基中; 将擦拭过鱼、鱿鱼、章鱼、明虾、螃蟹、鲎的体表及鱼鳃的灭菌棉签置于10mL富集培养基中; 28℃、150r·min-1振荡培养72h, 即为富集培养液。
1.3.2 红酵母的分离
将富集培养液划线接种于红酵母琼脂培养基平板和麦芽汁琼脂培养基平板上, 28℃培养5~10d; 根据菌落形态、颜色及显微镜下菌体细胞的形态观察结果, 选取疑似红酵母菌落进行纯培养。
1.3.3 分离菌株的表型鉴定
根据疑似红酵母分离菌株的菌落特征、菌体形态及生理生化试验等表型特征进行初步鉴定(Barnett et al, 1991)。
1.3.4 分离菌株的分子生物学鉴定
采用26S rDNA D1/D2区域序列对疑似红酵母分离菌株进行鉴定。PCR扩增和测序采用酵母菌通用引物; NL1(5°-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3°)、NL4(5°-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3°)(White et al, 1990), PCR产物送至上海立菲生物科技技术有限公司广州实验室分室进行序列测定。用MightyAmp DNA Polymerase 进行分离菌株的菌落PCR扩增; PCR扩增体系; DNA模板, 用灭菌牙签挑取少许平板中的菌落; 引物NL1(10μmol·L-1), 1.5μL; 引物NL4(10μmol·L-1), 1.5μL; LightyAmp DNA Polymerase 1.5μL; 2×MightAmp Buffer, 30μL; dd H2O, 25.5μL; 溶液总量60μL。PCR扩增程序为; 94℃, 10min; 94℃, 30s; 50℃, 1min; 72℃, 1min; 40个循环。所测序列结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据库中进行同源序列比对。用MEGA5.0软件包采用邻接法(Neighbor-joining)进行聚类分析和系统进化树构建。

2 结果与分析

2.1 疑似红酵母菌株的分离

从317份采集的样品中共分离出疑似红酵母71株; 其中, 带鱼肠道内容物6株, 体表3株, 鳃3株; 马友鱼肠道内容物6株, 体表1株, 鳃2株; 白骨鱼肠道内容物4株, 体表1株, 鳃1株; 石斑鱼肠道内容物3株; 红腊鱼肠道内容物2株; 沙丁鱼肠道内容物2株; 黄花鱼体表1株; 鱿鱼体表2株; 鲎体表2株; 明虾体表1株; 螃蟹体表1株; 海草11株, 海泥4株, 海水3株; 红树根8株, 红树叶4株。
从不同培养基的分离效果看, 红酵母琼脂培养基种类最多, 菌落形态较丰富, 占疑似红酵母分离菌株的83%; 麦芽汁琼脂培养基选择性强, 菌落形态单一, 占疑似红酵母分离菌株的19%。疑似红酵母分离株的菌落呈现红色、粉红色、深红色、橘红色等; 大小在2~4mm之间; 菌落厚, 不透明, 边缘整齐, 圆形, 隆起(图1); 显微镜下观察菌体细胞形态多为卵圆形, 还有圆形、长形及不规则多边形等(图2)。
Fig. 1 Colony morphology of Suspected Rhodotorula strains

图1 疑似红酵母菌株的菌落形态

Fig. 2 Cell morphology of Suspected Rhodotorula strains (×1000)

图2 疑似红酵母菌株的菌体形态(×1000)

2.2 分离菌株的生理生化试验

对71株疑似红酵母进行葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、密二糖、棉籽糖、松三糖、菊糖发酵试验, 糖发酵试验均为阴性; 71株分离菌的脲酶试验和重氮基蓝B试验为阳性, 在25℃和30℃生长; 68株在35℃生长, ZZC2、ZTC2和CZDJ2三株不生长; 71株分离菌的同化生长试验结果见表1。71株分离菌的糖发酵阴性、脲酶阳性和重氮基蓝B阳性, 符合红酵母属的主要生理特征; 表1同化生长试验结果亦符合红酵母的生理生化特征。
Tab.1 Assimilation tests of carbon and nitrogen in 71 strains

表1 71株分离菌的碳源和氮源同化生长试验

分离菌株 蔗糖 麦芽糖 海藻糖 松三糖 木糖 鼠李糖 乳糖 蜜二糖 棉子糖 甘露糖 菊糖 肌醇 淀粉 硝酸盐 亚硝
酸盐		 乙胺 肌酸 肌酸酐
ZTC4等46株 + + + + + v - - + v - - - - - + - -
aZDD4等12株 + + + + v + - - + + + - - + + + - -
ZTHD2等6株 + + + + + - - - v v v - - + + v - -
aZDB等4株 + - + + + v + - v v v - - + + - - -
ZZC2 + - + - - - - - - + - - - - - - - -
ZTC2 - + + - + + - - + + - - - + + + - -
cZDJ2 + - + + + - - - - + - - - - - - - -

注: “+”表示结果阳性; “-”表示结果阴性; “v”表示结果不确定; 空白表示无数据

2.3 分离菌株的分子生物学鉴定

将初步鉴定的71株红酵母分离菌株进行菌落形态、菌体形态及生理生化试验结果比较, 对于结果相同的分离菌株选取1株作为代表, 共选取了36株分离菌; 通过PCR得到36株分离菌株的26S rDNA D1/D2区域序列, 其基因片段长度为600bp左右。
在GenBank数据库中同源序列的比对结果见表2, 构建的系统发育树见图3。按Fell 等(2000)报道, 与最相近模式菌株的26S rDNA D1/D2序列相似性高于99%便可确定到种的分类地位的依据, 36株分离菌的序列中有34株与其系统发育关系最密切的模式菌株相似率达99%以上, 归属于5个种; 其中, 胶红酵母22株, 粘红酵母6株, 红冬孢酵母3株, 斯鲁菲亚红酵母2株, 浅红红酵母1株。菌株ZTC2、菌株cZDJ2与模式菌株的相似率分别为98.7%和93%, 为疑似红酵母新种。
Tab. 2 26S rDNA D1/D2 sequence similarity between 36 Rhodotorula strains and their relationships most closely type strain

表2 36株红酵母与其关系最密切的模式菌株间的26S rDNA D1/D2序列相似性

类群 分离菌株(Genbank登录号) 相似性最高模式菌株 相似性/%
R. mucilaginous
(22株)		 ZZC1(KP979796)、aZDD6(KP954615) R. mucilaginosa ATCC 32763 99.6
ZTHD4(KP954623、ZTHG1(KP954624)
aZDY(KP966487)、ZTHY5(KP966488)
ZTHQ(KP954629)
cZDL1(KP954617)、aZDY1(KP954618) R. mucilaginosa ATCC 32763 99.5
aZDZ1(KP954619)、cZDY5(KP954620)
bZDB2(KP966490)、 ZDS(KP954630)
ZTHY1(KP954625) R. mucilaginosa ATCC 32763 99.3
aZDD3(KP979795) R. mucilaginosa ATCC 32763 99.1
cZDY2(KP954616)、ZTHD3(KP954622) R. mucilaginosa CBS 8383 99.6
ZTC4(KP966489) R. mucilaginosa CBS 8383 99.5
ZTHY4(KP954626)、ZTC3(KP954627)
ZTC5(KP954628) 、ZTHY2(KP966486)		 R. mucilaginosa KCTC 2829 99.6
R. glutinis(6株) cZDD5(KP979800)、 bZDD5(KP979801)
bZDD4(KP979802) 、bZDD1(KP979803)
aZDD5(KP979804)、aZDD4(KP979805)		 R. glutinis ATCC 32765 99.3
R. toruloides(3株) ZTHD2(KP979806)、ZTC1(KP979807) R. toruloides KCTC 17083 99.5
ZTHD1(KP979808) 99.1
R. slooffiae(2株) aZDH8(KP979798)、aZDB(KP979799) R. slooffiae CBS 5706 99.5
R . pallid(1株) ZZC2(KP979797) R. pallid CBS 320 99.3
Rhodotorula sp.(1株) cZDJ2(KP979809) R. minuta JCM 5951 93.0
Rhodotorula sp.(1株) ZTC2(KP954620) R. mucilaginosa ATCC 32763 98.7
Fig. 3 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis

图3 基于26S rDNAD1/D2区域序列构建的系统发育树

由图3可知, 整个系统发育树共有7个分支; 其中ZZC1、aZDD3、aZDD6、cZDY2、cZDL1、aZDY1、aZDZ1、ZTHD3、ZTHD4、ZTHG1、ZTHY1、ZTHY4、ZTC3、ZTC5、ZTHQ、ZDS、ZTHY2、aZDY、ZTHY5、ZTC4、bZDB2、cZDY5等22株红酵母聚为一支, 与胶红酵母模式菌株处于同一进化水平; cZDD5、bZDD5、bZDD4、bZDD1、aZDD5、aZDD4等6株红酵母聚为一支, 与粘红酵母模式菌株处于同一进化水平; ZTHD1、ZTHD2、ZTC1等3株红酵母聚为一支, 与红冬孢酵母模式菌株处于同一进化水平; aZDH8、aZDB与斯鲁菲亚红酵母模式菌株处于同一进化水平; ZZC2为一支, 与浅红红酵母模式菌株处于同一进化水平; cZDJ2与小红酵母模式菌株在进化水平接近, 为疑似新种; ZTC2与禾本红酵母模式菌株在进化水平上接近, 为疑似新种。

3 讨论

本研究采用红酵母琼脂培养基和麦芽汁琼脂培养基从海洋生物及海洋环境中分离培养红酵母, 经表型特征分析, 初步鉴定出71株海洋红酵母。通过比对71株红酵母的菌体形态、培养特性及生理生化试验结果, 选取36株红酵母进行了26s rDNA D1/D2基因序列测定, 构建了系统发育树。结果表明, 36株红酵母归属于5个种和2个疑似新种; 其中22株鉴定为胶红酵母R. mucilaginosa, 6株鉴定为粘红酵母R. glutinis, 3株鉴定为红冬孢酵母R. toruloides, 2株鉴定为斯鲁菲亚红酵母R. slooffiae, 1株鉴定为浅红红酵母R. pallida; 2株疑似新种, 命名为Rhodotorula Sp. cZDJ2和 Rhodotorula Sp. ZTC2。
本文从雷州半岛近岸海域采集317份样品, 包括带鱼、虾等12种海洋动物, 海草和红树2种海洋植物, 以及海水和海泥2种海洋环境。采用先富集培养后再分离培养的方法, 共分离出71株海洋红酵母, 分离率为22.4%(71/317); 其中, 在鱼体中分离出41株红酵母, 且鱼肠道内容物及体表分离的数量明显高于鳃部, 与南开大学周与良 等(1999)所得结果一致。此外, 从海草和红树根等海洋植物中易于分离出红酵母, 分离率分别高达44%(11/25)和40%(8/20); 这可能与海草及红树林独特的生态环境有关。雷州半岛近岸海域的红酵母具有优势性, 胶红酵母为优势种群。而周与良 等(1999)、魏艳敏 等(1997)的研究表明, 在我国黄、渤海沿岸海域及长江流域, 深红酵母是各类基物的优势种; 李治滢 等(2017)报道, 云南程海湖冬季湖水中红冬孢酵母和斯鲁菲亚红酵母为优势种。这可能是由于地理环境和气候的差异所导致的不同结果, 有待进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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