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Journal of Tropical Oceanography >

2020 , Vol. 39 >Issue 2: 54 - 64

DOI: https://doi.org/10.11978/2019045

Marine Biology

Effects of breeding density on the growth, metabolic enzyme activity and related gene expression level of juvenile Pampus argenteus

  • NI Jiahao , 1 ,
  • ZHU Xiaojing 1 ,
  • JI Yiping 1 ,
  • ZHOU Bin 1 ,
  • WANG Yajun 2 ,
  • XU Shanliang , 2 ,
  • WANG Danli , 1
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  • 1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China
  • 2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China

Received date: 2019-05-07

  Request revised date: 2019-07-25

  Online published: 2020-03-10

Supported by

National Natural Science Foundation of China(31772869)

National Natural Science Foundation of China(31872586)

Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY15C190003)

Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY18C190008)

Special Funds for Key Project of Science and Technology of Ningbo(2019C02059)

Copyright

Copyright reserved © 2019. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

The feeding experiment lasted for 40 days to explore the effects of breeding density (30, 60 and 90 individuals·m-3) on the growth, enzyme activity and mRNA expression of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) in liver and kidney of juvenile Pampus argenteus with an average body weight of (3.88±0.72) g. Results are as follows. The weight gain rate and specific growth rate of the 60 individuals·m -3 group were (235.19±10.23)% and (4.03±0.10)%, respectively, which were significantly higher than those in the 30 individuals·m-3 group (p<0.05), but showed no significant differences with the 90 individuals·m-3 group (p>0.05). The changes of enzyme activity of juvenile Pampus argenteus were the most significant in the 90 individuals·m-3 group and were the least significant in the 30 individuals·m-3group. The activities of LDH, ALT and AST in liver and kidney increased first and then decreased, and the values of the three enzyme activities reached the peak at 6 h, 10 d and 10 d, respectively, which were 2.0 times, 4.3 times and 2.0 times of the initial values. The peak values of the three enzyme activities appeared at 1 d, 3 d and 5 d in kidney, respectively, and the values were 2.1 times, 2.2 times and 3.1 times of the initial values. The changes of mRNA expression of AST, ALT and LDH genes and the changes of the three enzyme activities in liver and kidney showed significant correlations. In conclusion, the breeding density of 60 individuals·m-3 could promote the growth of juvenile Pampus argenteus. However, the 90 individuals·m-3 group might cause extra energy demand increases in Pampus argenteus juveniles. Increased expression of gluconeogenesis-related genes mRNA resulted in significant increases of AST, ALT and LDH activities in liver and kidney, and eventually slowed down the growth of juvenile Pampus argenteus.

Key words： juvenile Pampus argenteus; breeding density; metabolic enzymes; AST; ALT and LDH gene expression levels

Cite this article

NI Jiahao , ZHU Xiaojing , JI Yiping , ZHOU Bin , WANG Yajun , XU Shanliang , WANG Danli . Effects of breeding density on the growth, metabolic enzyme activity and related gene expression level of juvenile Pampus argenteus[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2020 , 39(2) : 54 -64 . DOI: 10.11978/2019045

在水产养殖过程中, 养殖密度是影响养殖鱼类生长的主要因素之一, 而在现代集约化养殖中, 高养殖密度又是不可避免的。高密度养殖往往导致鱼类对氧气、生存空间以及饵料等竞争加剧, 从而改变鱼体内在的生理状况, 引起鱼对额外能量产生需求, 从而促使相关酶活力发生变化, 还会增大鱼病发生的可能性, 减缓养殖鱼的生长速度, 甚至导致大量死亡(Allen, 1974)。研究表明: 高密度条件下点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)初期血浆皮质醇显著提高, 肝脏中谷丙转氨酶、乙酰胆碱酯酶活力显著增加, 而后机体通过自身调节能力, 使皮质醇水平在一定程度上有所降低(逯尚尉 等, 2011); 高密度养殖下北极红点鲑(Salvelinus alpinus)出现食欲减退、耗氧量增加、行为应激等现象(Jørgensen et al, 1993); 高密度养殖的鲫鱼(Carassius auratus)皮质醇和溶菌酶均发生了变化(王文博 等, 2004); 长期的高密度养殖对中华鲟的生长、摄食和行为有显著的负面影响, 具体表现为运动频率、呼吸频率、游泳速度等显著提高(张建明 等, 2013)。
谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活力与体内氨基酸的分解转化关系密切, 这两种酶活力水平的提高说明氨基酸被大量分解用以供能(Demeal et al, 1978)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活力可以反映机体乳酸的分解速率。当动物对环境胁迫因子产生应激作用时, 神经内分泌系统分泌皮质醇激素并释放到血液中, 调控加强糖原异生途径, 氨基酸、乳酸等被消耗转变为葡萄糖和糖原, 以缓解应激时能量分流和代谢调节, 机体物质代谢从而发生变化(逯尚尉, 2010)。
银鲳(Pampus argenteus)隶属于鲈形目(Pereiformes), 鲳亚目(Stromaeoidei), 鲳科(Stromateidae), 鲳属(Pampus), 是一种经济价值较高的海水鱼类, 其野生资源量日渐减少。随着银鲳的人工育苗及养殖技术的突破, 在规模化养殖中同样面临着确定适宜养殖密度的问题。关于养殖密度对银鲳生长和生理影响的报道较少, 仅见银鲳低中密度(5~25尾·m-3)的4个养殖密度的实验, 分析其相关酶活力指标的变化(彭士明 等, 2010)。然而, 目前实际生产中银鲳的养殖密度均高于25尾·m-3。因此本实验探讨了30尾·m-3、60尾·m-3和90尾·m-3 3个养殖密度条件下, 测定分析银鲳幼鱼肝脏、肾脏组织内的AST、ALT和LDH活力的变化规律。同时, 利用实时荧光定量PCR技术, 比较3种养殖密度条件下幼鱼肝脏、肾脏中上述酶基因的mRNA表达水平差异, 以期从酶活水平和分子层面分析养殖密度对银鲳幼鱼生长和代谢的影响, 并将其作为优化银鲳幼鱼养殖密度的指标, 为大规模养殖银鲳提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验用鱼

试验在宁波大学银鲳科研基地进行, 实验所用的银鲳幼鱼全部为人工培育, 养殖密度为20尾·m-3。从同一池中选取健康活泼、同一批次培育的大小规格相近的个体810尾, 平均体质量(3.88±0.72)g, 平均体长(6.85±0.45)cm。

1.2 实验设计

采用有效水体1.5m3的PVC圆桶进行实验, 实验分成3个密度处理组, 分别为低密度组(30尾·m-3)、中密度组(60尾·m-3)、高密度组(90尾·m-3), 每组3个平行。实验为期40d, 投喂自制的粘性团状饲料(日本产“鱼宝”牌饲料+新鲜鱼肉糜+海蜇的混合料), 每天投喂总体质量的3%~5%, 分4次投喂。试验期间连续充气, 每天换水100%, 海水盐度24‰~26‰, pH为7.9~8.1, 水温(28±1)℃, 溶解氧(DO)含量大于7mg·L-1, 光照50~100lx。

1.3 样品采集

在试验开始后分别在0h、6h、1d、2d、3d、4d、5d、10d、20d和40d取样。每次每个处理组各取6尾(每个平行组取2尾), 取样后及时减少桶内水体积, 以保持相应的养殖密度。将取出的活鱼立即用MS-222麻醉, 分别称量体质量和体长并记录, 然后将幼鱼置于冰盘上快速解剖, 取部分肝脏、肾脏保存于RNA保存液中, 其余肝脏和肾脏组织置于-80℃冷冻保存。

1.4 方法

1.4.1 生长指标计算
增重率(WG, 单位: %)和特定生长率(SGR, 单位: %)计算公式如下:
$WG=100 \times (m_{t}-m_{0})/m_{0}$
$SGR=100 \times (lnm_{t}- lnm_{0})/t$
式中: m0为实验开始时实验鱼的初始平均体质量(单位: g); mt为结束时实验鱼的初始平均体质量(单位: g); t为实验天数(单位: d)。
1.4.2 酶液制备与酶活力测定
称取一定量的组织于离心管中, 放入冰盘中, 加9倍体积的生理盐水进行匀浆, 匀浆后于冷冻离心机中(2500r·min-1, 4℃)离心10min。取上清液, 用生理盐水稀释10倍, 此1%的待测液用于后续AST、ALT、LDH酶活力和组织蛋白浓度的测定。
组织中酶活力均采用试剂盒检测, AST和ALT按赖氏比色法测定, 取0.5mL AST或ALT基质液, 加0.1mL组织匀浆稀释液, 混匀后37℃水浴30min, 后加入0.5mL 2,4-二硝基苯肼液混匀, 37℃水浴20min。最后加入5mL浓度为0.4mol·L-1的NaOH溶液混匀, 室温显色5min, 用分光光度计在505nm波长下测得各孔OD值。查对标准曲线并通过计算公式得到相应的AST和ALT酶活力。组织中LDH酶活力采用微板法测定, 取15μL待测液加入100μL基质缓冲液和20μL的辅酶I应用液, 混匀后37℃水浴中保温15min, 后加入100μL 2,4-二硝基苯肼液混匀, 37℃水浴15min, 加入1mL浓度为0.4mol·L-1的NaOH溶液混匀, 室温显色3min, 用分光光度计在440nm波长下测定各孔吸光值。通过BCA方法测定组织中的蛋白质浓度, 将20μL待测液加入样品孔, 再加入200μL BCA工作液, 37℃恒温箱保温20~30min, 用分光光度计在562nm波长下测定各孔吸光值。实验中测定组织酶活力所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.3 目的基因的定量表达
取出储存在-80℃超低温条件下RNA保护液中的样品, 在冰上化冻, 并根据TRIzol试剂说明提取总RNA, RNA沉淀用DEPC水溶解, 用核酸定量仪(Thermo Scientific)测定260nm和280nm处的吸收值, 测定银鲳肝、肾组织样品中RNA的提出量和纯度, 而后用1%的琼脂糖凝胶通过RNA非变性电泳检测RNA完整度。取出等量(2μL)的RNA, 根据M-MLV (Promega)说明书进行肝脏和肾脏组织总RNA的反转录操作, 以合成cDNA第一链。
应用Primer 5.0软件设计特异扩增引物, AST-F、AST-R参照斑马鱼(Barchydanio rerio var) (登录号: NM213379.1)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (登录号: XM010741311.2)、斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus) AST基因(登录号: NM001200582.1); ALT- F、ALT-R参照南极鳕鱼(Dissostichus eleginoides) (登录号: XM010776622.1)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther) (登录号: XM008307552.3)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) (登录号: XM003443496.4) ALT基因; LDH-F、LDH-R参照斑马鱼(登录号: BC067188.1)、南部黑鳕鱼(Anoplopoma fimbria) (登录号: AF079830.1)、黄鳍金枪鱼(Thunnus albacores) LDH基因(登录号: AF079828.1), 具体引物如表1所示。以cDNA为模板, 参照Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye)说明书进行目的基因片段PCR扩增。扩增产物回收纯化后送生工生物工程(上海)有限公司测序。
表1 AST、ALT和LDH基因荧光定量PCR所用引物

Tab. 1 Primer used for AST, ALT and LDH qRT-PCR

引物 序列(5'—3') 片段大小/bp 退火温度/℃
AST-F
AST-R		 AGTGGAAGGAGATTGCTGACATTGT
ACTCCACTCTCTTTGCCTCATCTGT		 242 58
ALT-F
ALT-R		 TCATCAAACTGGTGTCGGTGCG
TGTGGTGTAGGAGGGCTCATCAGGC		 103 61
LDH-F
LDH-R		 GCGACAAAGACTACAGCGTGAC
CGATGTTGGGGATGATAAACTTGAA		 137 57
以β-actin基因为内参基因进行预实验, 样品cDNA用RNase free ddH2O做4个5倍梯度稀释, 各设3个平行, 进行RT-qPCR, 而后建立标准曲线, 确定最佳实验稀释倍数为5倍。对样品cDNA进行5倍梯度稀释, 以稀释后的cDNA为模板进行荧光定量PCR, 每个样品设3个平行。PCR反应体系(共20μL): SYBR PremixEx Taq 10μL, 上、下游引物各0.4μL, 模板2μL, ddH2O 7.2μL。反应条件: 95℃预变性1min; 95℃变性10s, 相应基因退火温度下退火40s, 72℃延伸40s, 共进行40个循环。结果采用$2^{-\Delta \Delta Ct}$ 法比较不同基因的表达量。

1.5 统计与分析

实验数据表示为平均值±标准误(x±SE), 采用SPSS 13.0软件统计, 用单因子方差分析进行差异显著性检验, Duncan法多重比较检测各测量值指标的差异, p<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 养殖密度对银鲳幼鱼生长的影响

3个密度组银鲳幼鱼的增重率、特定生长率如表2所示。40d的饲养试验结束后, 各组银鲳幼鱼的终末体质量差异不显著(p>0.05)。中密度组(60尾·m-3)银鲳幼鱼的增重率与特定生长率分别为(235.19± 10.23)%、(4.03±0.10)%, 显著高于低密度组(p<0.05); 高密度组(90尾·m-3)幼鱼的增重率与特定生长率分别为(196.00±24.25)%、(3.61±0.27)%, 均略低于中密度组, 但无显著性差异(p>0.05)。
表2 养殖密度对银鲳幼鱼体生长的影响

Tab. 2 Effect of density on the growth of juvenile Pampus argenteus

组别 初始体质量/g 终末体质量/g 增重率/% 特定生长率/%
低密度组(30尾·m-3) 4.30±0.50 11.27±0.46 162.02±10.80 b 3.21±0.14 b
中密度组(60尾·m-3) 3.60±0.30 12.07±0.37 235.19±10.23 a 4.03±0.10 a
高密度组(90尾·m-3) 3.75±0.45 11.10±0.91 196.00±24.25 ab 3.61±0.27 ab

注: 不同小写字母表示该指标在不同密度组中差异显著(p<0.05)

2.2 养殖密度对银鲳幼鱼肝脏中3种代谢酶活力的影响

2.2.1 谷草转氨酶
不同养殖密度下银鲳幼鱼肝脏中谷草转氨酶(AST)随时间变化见图1a。在3个密度组中, AST活性表现为高密度组>中密度组>低密度组。高密度组AST活性显著高于中密度组和低密度组(p<0.05); 中密度组AST在6h、2d、3d时间点活性与低密度组有显著差异(p<0.05), 而在其他时间点无显著差异(p>0.05)。从高密度组看, 随着胁迫时间的延长, AST活性呈现先升高后降低的变化, 在0h后开始缓慢升高, 至3d后显著上升(p<0.05), 10d时达到最大值222.44U·g-1, 约为初始值的4.25倍, 而后又呈下降趋势(p<0.05)。低密度和中密度组也有类似的变化, 但不显著, 中密度的AST活性变化范围为21.72~ 52.30U·g-1, 低密度组的AST活性变化范围为17.82~52.30U·g-1。
2.2.2 谷丙转氨酶
在不同养殖密度下, 银鲳幼鱼肝脏谷丙转氨酶(ALT)活力变化见图1b。实验初期的6h~2d, 高密度组ALT酶活力显著高于中密度组和低密度组(p<0.05)。3d后至实验结束, 高密度组与中密度组无显著差异(p>0.05), 但仍显著高于低密度组(p<0.05)。高密度组和中密度组的ALT酶活力在5d后显著升高(p<0.05), 10d时达到活力最大值, 分别为152.02U·g-1和159.51U·g-1, 而后20d时显著下降跌入低谷, 约为10d值的37%~38% (p<0.05), 40d时又表现为显著上升, 但没有高于初始值。低密度组的幼鱼ALT酶活力高峰出现在20d, 与高密度和中密度的低谷持平。
2.2.3 乳酸脱氢酶
各养殖密度下银鲳幼鱼肝脏乳酸脱氢酶(LDH)的活力变化见图1c。除1d、5d外, 其他7个时间点高密度组LDH酶活力均显著高于中、低密度组(p<0.05), 2d、3d、5d、10d时中密度与低密度差异显著(p<0.05)。高密度组LDH酶活力在6h骤然升高, 达到峰值3428.61U·g-1, 是初始值的2倍, 1d时又显著下降(p<0.05), 此后又在4d和40d出现两个峰值。中、低密度组的最大峰值均出现40d, 分别为2355.75U·g-1和2076.79U·g-1。

2.3 养殖密度对银鲳幼鱼肾脏中3种代谢酶活力的影响

2.3.1 谷草转氨酶
不同养殖密度下银鲳幼鱼肾脏谷草转氨酶(AST)的活力变化见图2a。在各时间点(除1d、2d、40d外)高密度组幼鱼AST酶活力均高于中密度组和低密度组, 尤其是5d时达到峰值, 约为初始值的3.1倍, 分别是中、低密度组的3.3倍和4.9倍(p<0.05), 此后开始回落, 40d时与0h初始值接近。各时间点的中密度组幼鱼AST酶活力均高于低密度组, 且6h、3d、4d和10d~40d时两者存在显著差异(p<0.05); 中密度组的幼鱼AST酶在4d时为最大值48.59U·g-1。低密度组的幼鱼AST酶活力呈逐渐下降趋势, 变化范围为10.06~31.19U·g-1。
图1 养殖密度对银鲳幼鱼肝脏谷草转氨酶(a)、谷丙转氨酶(b)、乳酸脱氢酶(c)活力的影响

*表示同一密度组与前一时间点比较有显著差异(p<0.05); 不同小写字母表示不同密度组在同一时间点差异显著(p<0.05)

Fig. 1 Effect of density on liver AST (a), ALT (b) and LDH (c) activity of juvenile Pampus argenteus. * indicates significant difference between different treatment times at the same density (p<0.05), Different small letters above the bars indicate significant differences between different densities at the same time (p<0.05)

2.3.2 谷丙转氨酶
不同养殖密度下银鲳幼鱼肾脏谷丙转氨酶(ALT)的活力变化见图2b。除6h、1d点外, 高密度组ALT活力均高于中密度组和低密度组, 2d~5d、20d时间点显著高于中密度组与低密度组(p<0.05), 峰值出现在3d, 是初始值的2.2倍。中密度组酶活力除40d外均高于低密度组, 峰值出现在1d, 为52.06U·g-1。低密度组的峰值也出现在1d。高、中、低3个密度组的ALT酶活力都呈现先升高再下降的变化趋势。
图2 养殖密度对银鲳幼鱼肾脏谷草转氨酶(a)、谷丙转氨酶(b)、乳酸脱氢酶(c)活力的影响

*表示同一密度组与前一时间点比较有显著差异(p<0.05); 不同小写字母表示不同密度组在同一时间点差异显著(p<0.05)

Fig. 2 Effect of density on kidney AST (a), ALT (b) and LDH (c) activity of juvenile Pampus argenteus. Asterisk (*) indicates significant difference between different treatment times at the same density (p<0.05), Different small letters above the bars indicate significant differences between different densities at the same time (p<0.05)

2.3.3 乳酸脱氢酶
不同养殖密度下银鲳幼鱼肾脏乳酸脱氢酶(LDH)的活力变化见图2c。在6h~2d, 高密度组LDH酶活力显著高于中密度和低密度(p<0.05), 此后与中低密度组没有显著性差异, 甚至还低于中密度组。高密度组LDH酶活力1d时达到峰值, 是初始值的2.1倍, 中密度组的峰值出现在4d, 低密度组酶活力相对变化较平稳。

2.4 养殖密度对银鲳幼鱼肝脏、肾脏3种代谢酶基因表达的影响

2.4.1 高密度对银鲳幼鱼肝脏、肾脏代谢酶基因表达的影响
高密度条件下银鲳幼鱼肝脏AST、ALT、LDH 3个基因mRNA表达量见图3。AST基因mRNA表达水平随着胁迫时间的推移呈先降低, 后升高再降低的趋势, 6h~4d呈下降趋势, 5d后开始表达上调, 至10d为表达量峰值, 约为初始值的5倍, 而后开始回落。ALT基因mRNA表达水平也在5d时显著上调(p<0.05), 至10d为表达量峰值, 约为初始值的4.5倍, 此后同样呈显著下降(p<0.05)。LDH基因mRNA表达量在2d~10d维持较高水平, 峰值也在10d时, 约为初始值的4倍。
图3 高密度组(90尾·m-3)银鲳幼鱼肝脏AST、ALT、LDH 3种酶基因的mRNA表达变化

不同小写字母表示该种酶在不同时间点差异显著(p<0.05)

Fig. 3 Change of mRNA relative expression on three liver enzymes in high density group of juvenile Pampus argenteus. Different small letters above the bars indicate significant differences between different times at the same enzyme (p<0.05)

高密度养殖下银鲳幼鱼肾脏中AST、ALT、LDH基因的mRNA表达量见图4。AST基因mRNA和ALT基因mRNA的表达均呈现单峰型, 呈先上升后下降的趋势。AST基因mRNA在5d表达量最高, 约为初始值的3.5倍; ALT基因mRNA表达量高峰出现在3d时, 约为初始值的2.5倍; LDH基因mRNA表达量呈双峰型, 最高峰值出现更早, 1d时为峰值, 约为初始值的2倍, 10d时为第二峰, 约为前一峰值的0.81倍。
图4 高密度组(90尾·m-3)银鲳幼鱼肾脏AST、ALT、LDH 3种酶基因的mRNA表达变化

不同小写字母表示该种酶在不同时间点差异显著(p<0.05)

Fig. 4 Change of mRNA relative expression on three kidney enzymes in high density group of juvenile Pampus argenteus. Different small letters above the bars indicate significant differences between different times at the same enzyme (p<0.05).

2.4.2 不同密度下银鲳幼鱼肝脏、肾脏中AST、ALT、LDH基因的mRNA表达差异
高密度、中密度和低密度3个处理组10d时幼鱼肝脏AST、ALT、LDH基因mRNA表达量见图5。从图5中得知, 高密度组AST和ALT两种酶基因mRNA表达量均显著高于中、低密度组(p<0.05), LDH基因mRNA表达量虽高于中、低密度组, 但差异不显著。
高密度、中密度以及低密度3个处理组水平下, 10d后银鲳幼鱼肾脏AST、ALT、LDH基因mRNA表达量见图6。高密度组ALT和LDH基因mRNA表达量显著高于中密度组和低密度组(p<0.05), AST基因mRNA表达量也高于中、低密度组, 但差异不显著。中、低密度组间3个基因表达均无显著差异(p>0.05)。
图5 不同密度下银鲳幼鱼肝脏AST、ALT、LDH 3种酶基因的mRNA表达差异

不同小写字母表示该种酶在不同密度下差异显著(p<0.05)

Fig. 5 Difference of mRNA relative expression on three liver enzymes between different density stresses of juvenile Pampus argenteus. Different small letters above the bars indicates significant differences between different densities at the same enzyme (p<0.05)

图6 不同密度下银鲳幼鱼肾脏AST、ALT、LDH 3种酶基因的mRNA表达差异

不同小写字母表示该种酶在不同密度组差异显著(p<0.05)

Fig. 6 Difference of mRNA relative expression on three kidney enzymes between different density stresses of juvenile Pampus argenteus. Different small letters above the bars indicate significant differences between different densities at the same enzyme (p<0.05)

3 讨论

3.1 养殖密度对银鲳幼鱼生长的影响

通常情况下, 养殖密度与鱼类的生长呈负相关, 随着养殖密度的提高, 对养殖鱼类而言将出现拥挤胁迫, 鱼类的生长代谢率则会呈下降趋势(Shelbourn et al, 1973)。9.0kg·m-3组日本黄姑鱼(Nibea japonica)幼鱼增重率显著低于1.9、3.8、7、7.6kg·m-3组, 其成活率也有所下降(王跃斌 等, 2017)。高密度养殖对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫鱼(Carassius auratus)、青石斑鱼(Epinephelus awoara)等的摄食、生长、个体免疫力等存在负面影响(李爱华, 1997; 夏华 等, 2013; 张曦文 等, 2012)。但是并非所有的养殖鱼类的生长代谢与养殖密度皆呈简单的正相关或负相关。放养密度为2.1kg·m-3的点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)实验组的增重率达到最大, 过高或过低的放养密度皆能滞缓该石斑鱼的生长和代谢速度(逯尚尉 等, 2011)。尼罗罗非鱼苗种最佳的苗种培育密度为5.28~10.56kg·m-3, 升高或降低密度苗种的生长都将减慢(孙大川 等, 2009)。随着养殖密度的升高, 吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼特定生长率呈先上升后下降的变化(强俊 等, 2011)。本实验中60尾·m-3中密度组的增重率与特定生长率分别为(235.19±10.23)%、(4.03±0.10)%, 显著高于低密度组(30尾·m-3) (p<0.05), 略高于高密度组(90尾·m-3)但无显著性差异(p>0.05), 表明在实验设置的3个密度下, 过低或过高的养殖密度都不利于银鲳的生长, 这与相关研究结果一致(逯尚尉 等, 2011; 孙大川 等, 2009; 强俊 等, 2011)。有学者认为, 高密度养殖使养殖鱼类体内的激素水平发生改变, 鱼体积极动员自身的能量储存物质, 以满足额外的能量需求, 加强糖异生途径使流向生长的能量逐渐减少, 从而使鱼体的生长受到负面的影响(张廷军 等, 1998)。也有报道认为, 养殖鱼类生长受到抑制的原因在于个体的生存空间减少, 种间对于溶氧、饵料等资源竞争加剧, 从而导致个体的生长受到阻碍(Baker et al, 1990)。银鲳幼鱼在低密度下生长状况不及中密度组的原因可能与银鲳的群居习性有关, 过低的养殖密度反而会不利于其生长。研究指出, 集群性鱼类具有社会性, 集群性鱼类若单独饲养, 通常可以看到该个体行为古怪、进食量减少、生长速度减慢, 而当其集群生活时, 则会恢复为行为活泼、积极进食、生长加快的状态(李大鹏 等, 2004)。上文提到的点带石斑鱼、罗非鱼等群居性鱼类也具有类似的互利性现象, 在各试验组中, 密度最低的实验组幼鱼的增重率和特定生长率出现显著低于其他各实验组的现象(逯尚尉等, 2011; Hoener et al, 1987)。

3.2 养殖密度对银鲳幼鱼肝脏、肾脏中3种代谢酶活力的影响

作为环境胁迫因子的高密度养殖会导致鱼对额外能量的需求增加, 从而增强糖原异生途径。在胁迫环境下, 鱼类会消耗糖类、乳酸、氨基酸等来满足能量的需求, 同时LDH、AST、ALT和其他相关酶活力也会有所变化(逯尚尉, 2010; Vijayan et al, 1990)。
研究表明, 在黄姑鱼(Nibea albiflora)的4个密度胁迫实验中, 60尾·m-3实验组黄姑鱼LDH活力显著高于其他3个密度组(薛宝贵 等, 2013)。高密度组(G40)点带石斑鱼幼鱼LDH酶活力最高, 且与两个低密度组(G10、G20)差异非常显著(逯尚尉 等, 2010)。LDH酶活力随养殖密度的增加而增加, 表明高密度养殖导致实验幼鱼产生应激胁迫作用, 影响了其正常的生理代谢活动。本实验中, 幼鱼肝脏、肾脏组织内的LDH酶活力随养殖密度的增加而增加, 设置的高密度组(90尾·m-3)对银鲳幼鱼造成了胁迫作用, 糖异生作用加强, 乳酸作为糖异生前体的优先替代物大量增加, 诱导LDH的合成与分泌, 使得LDH酶活力水平显著提升。这与相关研究结果相一致(逯尚尉, 2010; 薛宝贵 等, 2013)。3h急性拥挤胁迫的鲤(Cyprinus carpio)血清乳酸水平上升, 与对照组相比差异显著(p<0.05), 之后逐渐下降, 其中12h~96h血清乳酸水平一直处于下降和恢复的波动状态(于淼 等, 2008)。本实验高密度组幼鱼肝脏、肾脏中的LDH酶活力在拥挤胁迫初期(0h~1d)显著增加, 并分别于6h和1d达到最大值, 而后总体呈下降趋势, 在胁迫中期(1d~5d)活力稍有提高, 而在胁迫后期(5d~40d)则没有显著变化, 说明在拥挤胁迫初期, 银鲳幼鱼主要利用乳酸进行糖异生活动, 诱导LDH的合成与分泌, 消耗自身乳酸产生丙酮酸来满足机体的需要。拥挤胁迫中、后期LDH活力变化不显著, 这被认为是鱼体会通过自身的调节机制快速遏制拥挤胁迫带来的不良影响(强俊 等, 2014; 王春枝 等, 2014)。本实验中随着养殖时间的延长, 银鲳幼鱼体内LDH酶活力的调节可能超过了鱼体自身的调节能力, 酶活力呈现急速下降的趋势。也可能在胁迫中期由其他糖异生相关的酶开始起主导作用, 而使得LDH酶活力有所降低。中密度组、低密度组LDH酶活力虽然某些时间点之间差异显著, 但整体没有如高密度组一样出现大幅度的变化, 而是呈不规则的波动起伏变化, 说明中、低密度胁迫对银鲳幼鱼LDH酶活力影响不如高密度组显著。
研究发现, 麦瑞加拉鲮鱼(Cirrhinus mrigala)和团头鲂(Megalobrama amblycephala)受到拥挤胁迫后, ALT和AST活力显著升高, 糖异生途径加强, 产生葡萄糖来对抗不利环境(Tejpal et al, 2009; 亓成龙, 2016)。高密度组鲤血清中ALT、AST酶活力水平极显著高于低密度组和中密度组(p<0.01) (张磊 等, 2007)。青石斑鱼血清的ALT酶活力及肝脏和鳃的ALT酶活力均随着养殖密度的增加而明显升高(p<0.01) (张曦文 等, 2012)。施氏鲟(Acipenser schrenckii) AST酶活力随着养殖密度的增大而显著升高(任源远, 2014)。本实验结果显示, 高密度组银鲳幼鱼肾脏ALT酶活力水平总体上显著高于中、低密度组, 而高、中密度组幼鱼肝脏ALT酶活力水平显著高于低密度组。高密度组幼鱼肝脏AST酶活力显著大于中、低密度组, 肾脏AST酶活力水平除1d、2d、40d点外均高于中、低密度组, 特别是5d时显著高于中、低密度组(p<0.05)。这表明高密度组已经对养殖银鲳幼鱼造成了拥挤胁迫, 丙氨酸、天冬氨酸被大量利用产生能量, 使得ALT、AST酶活力水平显著提升, 这与相关研究结论(Tejpal et al, 2009; 任源远, 2014)相一致。中密度组幼鱼肝、肾组织中AST和ALT活力水平均普遍较高, 说明银鲳幼鱼在中密度(60尾·m-3)已经感受到了拥挤胁迫信号, 导致其在中密度养殖中也出现了拥挤胁迫症状, 表现为肝、肾组织中AST和ALT活力水平提高。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)随着密度胁迫时间的延长, 鱼体内AST、ALT酶活力变化为先降低后升高再降低(强俊 等, 2014)。史氏鲟的拥挤胁迫后AST酶活力水平在胁迫后的5min下降, 接下来的8h内持续升高, 而后8h~3d期间呈下降趋势, 最后一直上升至15d达到最高值(石小涛, 2006)。本实验高密度组幼鱼的肝脏、肾脏两组织内的AST、ALT酶活力水平均呈现先下降后上升再下降的趋势。因此, 银鲳幼鱼受拥挤胁迫后, 肝脏、肾脏内的ALT、AST酶活力变化趋势与尼罗罗非鱼、史氏鲟的密度胁迫实验较为吻合。结果表明, ALT、AST酶主要在银鲳幼鱼受到拥挤胁迫的中期发生作用, 动员丙氨酸、天冬氨酸进入糖异生途径。而关于ALT、AST酶活力在实验后期有所下降, 有学者认为这与鱼体自身的调节机制有关, 增加糖异生相关酶活力, 在一定程度上降低了拥挤胁迫带来的不良影响, 从而ALT、AST酶活力开始呈下降趋势(强俊 等, 2014; 王春枝 等, 2014)。

3.3 养殖密度对银鲳幼鱼肝脏、肾脏代谢相关酶基因表达的影响

为进一步探讨AST、ALT、LDH代谢酶基因在不同养殖密度下是否参与了糖代谢中的糖异生作用, 本实验利用实时荧光定量PCR技术进行了验证。重点关注了高密度组银鲳幼鱼肝脏和肾脏两类组织内上述代谢酶mRNA表达量。比较了3个密度组在拥挤胁迫处理10d后银鲳幼鱼肝脏、肾脏的代谢酶mRNA表达量的结果表明, 代谢酶基因参与了拥挤胁迫下的糖异生途径。
实时荧光定量PCR结果显示, 高密度组幼鱼的肝脏、肾脏两组织内的AST、ALT基因mRNA表达量变化趋势均与其酶活力水平变化趋势一致。幼鱼肾脏中的LDH基因mRNA表达量变化趋势与对应酶活力水平相吻合; 肝脏LDH基因mRNA表达量在0h~4d上调, 至4d达到最高值, 约为初始值的4倍, 而后一直呈下降趋势。与肝脏LDH酶活力变化不同的是, 6h时LDH酶活力达到最大值, 而此时其mRNA表达量变化不显著。研究认为, 在胁迫前期, 鱼体可能利用先前自身合成存储的酶原, 随着体内酶不断地失活而后被降解, 相关基因开始转录、翻译以及合成, 因而mRNA响应在时间上出现了延迟(王春枝 等, 2014; 梁丛飞, 2015)。本实验胁迫6h后, 肝脏LDH活力水平显著提升, 而其mRNA表达水平并没有显著提高, 应该在胁迫前期银鲳体内储存有部分酶原, 应激后酶原被激活为酶, 从而使得酶活力水平上升, 而基因mRNA表达并没有显著上调。本研究得到了酶活水平与对应的酶基因mRNA表达量之间的相互呼应, 结果表明高密度组对银鲳幼鱼代谢相关酶活力及其mRNA表达量产生了影响。
综上所述, 适当提高养殖密度对银鲳幼鱼的生长有促进作用。但在高密度养殖下, 银鲳幼鱼则会受到拥挤胁迫的影响, 肝脏、肾脏中LDH、ALT、AST酶活力显著升高。LDH主要参与胁迫早期的糖异生行为, 而ALT、AST则主导胁迫后期的氨基酸异生途径, 这些生理代谢过程也从相关酶基因mRNA表达量变化得到了印证, 说明这些胁迫应激反应受相关基因的调控。

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