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Journal of Tropical Oceanography >

2021 , Vol. 40 >Issue 4: 22 - 34

DOI: https://doi.org/10.11978/2020067

Marine Biology

Physiological and genomic characteristics of two lytic phages infecting Vibrio alginolyticus

  • ZHONG Wanxuan , 1, 2 ,
  • YANG Yunlan 3 ,
  • LI Xiangfu 1, 4 ,
  • XU Jie , 1, 2, 4
Expand
  • 1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. College of Marine Science, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 3. College of the Environment and Ecology, State Key Laboratory for Marine Environmental Science, Xiamen University, Xiamen, 361102 China
  • 4. Innovation Academy of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510301 China
XU Jie. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2020-06-24

  Revised date: 2020-07-26

  Online published: 2020-07-29

Supported by

Project of Program of Science and Technology of Guangzhou(20190420029)

National Natural Science Foundation of China(41506095)

National Natural Science Foundation of China(41676075)

Project of Innovation Academy of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences(ISEE2019ZR02)

Project of Department of Science and Technology of Guangdong Province(2018B030320005)

China Postdoctoral Science Foundation(2019M662237)

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Copyright reserved © 2021. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

Phage therapy of bacterial diseases was considered to be effective and environmentally friendly in aquaculture. To obtain the biological agents that prevent Vibro alginolyticus, two jumbo phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z were isolated from prawn farming waters and the sewage in fishery markets in Dongshan Island, Fujian Province, using Vibrio alginolyticus ATCC 17749 T as the host. The morphology, host range, life cycle, and genome were identified and analyzed. Phages R10Z and R11Z had similar morphology of plaques and virions, and shared the same host range of infecting other V. owensii strain JL3186. Both phages were not sensitive to chloroform, indicating that the capsid did not contain lipids. They had the same latent period of 20 min but different blast sizes of 45 PFU·cell -1 for R10Z and 114 PFU·cell-1 for R11Z. The genomic sizes of phages R10Z and R11Z were 247167 bp and 246831 bp with G+C content of 41.30% and 41.33%, respectively. Furthermore, their genomes had a similarity of 99.45%, without virulence genes and antibiotic resistance genes. Our phylogenetic analysis showed that they belonged to genus Schizotequatrovirus, subfamily Tevenvirinae, family Myovirdae. Their homologous genes were distributed in the environment widely. Phages R10Z and R11Z had good capability and great potentials for their usage as phage therapy agents of vibriosis in aquaculture.

Key words： Vibrio; phage; phage therapy; physiological properties; genome

Cite this article

ZHONG Wanxuan , YANG Yunlan , LI Xiangfu , XU Jie . Physiological and genomic characteristics of two lytic phages infecting Vibrio alginolyticus[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2021 , 40(4) : 22 -34 . DOI: 10.11978/2020067

弧菌(Vibrio)是一类嗜盐、兼性异养的革兰氏阴性海洋细菌, 其广布于河口和沿海生态系统中(张晓华 等, 2018)。在亚洲, 弧菌引起的弧菌病(Vibriosis)是水产养殖业中导致虾、鱼和贝类大量死亡的最常见疾病之一(Egidius, 1987; Ina-Salwany et al, 2019; Mohamad et al, 2019)。常见的致病性弧菌有鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌等(Mohamad et al, 2019)。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种条件致病性弧菌, 可危害鱼类、节肢类、头足类、棘皮类等多种水产动物(黄瑞芳, 2005; 刘淇 等, 2007; Lv et al, 2019; Xie et al, 2020), 且对人有致病性(Schmidt et al, 1979; Liu et al, 2015)。我国海水养殖产品需求量大, 养殖集约化程度高, 因此病害问题对养殖产业影响严重, 仅2019年就已造成261259.43万元的经济损失, 仅次于台风、洪涝、干旱等气象因素(农业农村部渔业渔政管理局 等, 2019)。投放抗生素是最常用、最高效的细菌性病害治疗手段, 但由于药物残留和耐药性问题, 近年来生物防治成为备受关注的替代性方法(Pérez-Sánchez et al, 2018; Mohamad et al, 2019)。噬菌体疗法利用噬菌体对细菌的裂解作用杀灭致病细菌, 可达到治疗和预防水产动物细菌性病害的目的(张昕 等, 2004)。噬菌体的自限性强、专一性程度高, 对细菌有良好杀灭作用, 同时对环境友好, 在农业、水产养殖和临床医疗中, 噬菌体是控制耐药菌株的抗生素替代品之一(Nakai et al, 2002; Sharma et al, 2017)。
已有很多研究分离获得了弧菌噬菌体, 并对其进行了测序分析, 根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV; https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)2019版分类目录, 大多数已分离的弧菌噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)。部分已分离的弧菌噬菌体在治疗水产动物弧菌病的实验中取得了进展, 如Zhang等(2015)利用噬菌体PVA1和PVA2混合制剂治疗溶藻弧菌病, Chen等(2019)用5株裂解性弧菌噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒(phage cocktail)治疗Litopenaeus vanname的弧菌感染, Stalin等(2017)用多株噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒控制Penaeus monodon幼体的哈维氏弧菌感染, 均能使致病细菌的载量显著降低, 提高水产动物成体及幼体的存活率。这些研究表明, 噬菌体治疗是非常有效的治疗水产养殖病害的措施。Tevenvirinae类噬菌体是研究最深入的噬菌体类群之一, 可侵染埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)等宿主, 侵染弧菌的Tevenvirinae类噬菌体也早在1976年就被分离获得(Zachary, 1976)。目前已分离的Tevenvirinae类弧菌噬菌体主要为Schizotequatrovirus属, 包括噬菌体ValKK3、VH7D、φSt2、φGrn1、KVP40、φpp2和nt-1, 该类噬菌体在噬菌体治疗研究中已有一定的研究基础。例如, Kalatzis等(2016)向Artemia孵化池中投放的φSt2、φGrn1和饵料的混合物能够显著减少溶藻弧菌的数量, 降低幼体感染风险, 但不彻底杀死细菌, 保留了幼体对溶藻弧菌产生免疫的可能, 因而有较好的应用效果。
本文分离获得噬菌体的主要目的是预防和治疗养殖水产细菌性病害, 从水产动物生存环境中分离获得噬菌体再运用于原位环境, 能够在一定程度上减少人为带来的环境影响。近海海域和海水养殖场是水产动物养殖的主要场所, 而水产市场是水产动物的主要去处。福建省具有十分优越的自然海洋环境和丰富的海洋资源, 是水产养殖的理想地区。因此, 本研究从福建省的近海海域、海水养殖场和水产市场采集水样进行噬菌体的分离实验, 并对噬菌体的形态、宿主范围、氯仿敏感性、潜伏期和裂解量等生理生态特性进行鉴定, 通过基因组分析对噬菌体进行分类, 筛查毒力基因和抗药性基因, 评价噬菌体的应用前景。

1 材料与方法

1.1 噬菌体的分离与纯化

本实验使用的宿主细菌Vibrio alginolyticus ATCC 17749T购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC), 菌株全基因组序列的GenBank保存编号为CP006718和CP006719(Liu et al, 2015)。V. alginolyticus ATCC 17749T分离自腐败海产品中, 可使人食物中毒, 对人和水产动物都有致病性(Liu et al, 2015)。本实验中, 弧菌以2216E液体培养基和2216E固体平板(1.5%琼脂)培养基为营养源, 在30℃下进行培养。
本实验采用双层平板法从海水样品中分离噬菌体(Lu et al, 2017)。噬菌体分离所用的水样采集于我国近岸海域、海水养殖场和水产市场排污口, 经0.22μm滤膜过滤除菌。分离实验前, 采用对数生长初期的V. alginolyticus ATCC 17749T宿主菌培养液与海水样品混合培养1d, 以扩大培养样品中可能存在的噬菌体。所得培养液经过滤除菌后, 用SM缓冲液(1L蒸馏水, 5.844g NaCl, 2.4647g MgSO4·7H2O, 6.057g Tris, 0.1g Gelatin, pH=7.50, 110℃高压灭菌30min)进行梯度稀释, 与对数生长初期的宿主菌培养液混合制备双层平板。双层平板在30℃下进行培养, 定时观察是否有噬菌斑出现。待双层平板上出现透明的噬菌斑后, 收集形态清晰的单个噬菌斑, 放入SM缓冲液中于4℃保存。为了获得纯噬菌体, 分离获得的噬菌体需要经过至少3次双层平板实验重复分离纯化。

1.2 噬菌体的扩大培养与富集

将纯化后的噬菌体接入到宿主菌液中扩大培养至1L体系, 然后加入DNase I和RNase A处理, 采用0.22μm滤膜过滤除菌, 得到约1L噬菌体液。在噬菌体液中加入终浓度为10%(wt/vol)的PEG 8000, 于4℃下避光静置1~3d以聚集沉降噬菌体颗粒, 通过12000×g离心1h后收集沉淀物并重悬于约6mL的SM缓冲液中(Lu et al, 2017)。重悬后的噬菌体(丰度不小于1010PFU·mL-1)采用CsCl密度梯度超速离心法进行离心纯化(张正福 等, 1981; Lu et al, 2017), 首先将样品加入预先配置的CsCl密度梯度溶液上进行超速离心(200000×g, 4℃, 24h), 然后取出蓝色或白色的浓缩噬菌体条带, 用30kDa超滤管透析, 以去除CsCl, 最终得到高浓度的纯噬菌体液。富集后的噬菌体置于4℃条件下避光保存, 用于后续噬菌体形态观察和核酸提取等实验。

1.3 宿主范围测定

本实验选用了21株弧菌属(Vibrio)细菌进行宿主范围测定, 其中9株为致病菌, 12株为海洋浮游细菌, 包括Vibrio alginolyticus、Vibrio campbellii、Vibrio parahemolyticus、Vibrio harveyi、Vibrio caribbeanicus、Vibrio fortis、Vibrio chagasii、Vibrio inhibens、Vibrio owensii、Vibrio cholerae、Vibrio variabilis等。将培养至对数生长初期的待测弧菌制成双层平板, 然后将10μL无菌的高浓度(108PFU·mL-1)噬菌体液滴于凝固的双层平板上, 于30℃培养箱中静置培养, 定时观察是否有噬菌斑出现。实验设置3个平行样, 同时以V. alginolyticus ATCC 17749T作为阳性对照, 用SM缓冲液代替噬菌体液作为阴性对照。

1.4 氯仿敏感性实验

参考Yang等(2017)采用的方法, 分别取0μL、20μL、200μL氯仿与1mL纯化后的噬菌体样液(丰度为108PFU·mL-1)混合, 振荡30s后于25℃静置30min。离心(5000×g, 5min, 4℃)分相后取出10μL上清液, 滴于事先准备好的宿主菌双层平板上, 于30℃培养箱中静置培养, 并观察是否有噬菌斑出现。实验设置3个平行样, 同时用SM缓冲液作为阴性对照。

1.5 形态观察

参考Yang等(2017)的方法, 取20μL浓缩后的噬菌体滴至200目覆有碳膜的铜网上, 黑暗吸附10~30min后, 用1%的磷钨酸负染色约20min, 干燥30min以上, 使用JEM 2100型透射电镜, 在120kV电压下对样品进行观察, 图像使用GATAN INC CCD图像传输系统进行采集。

1.6 一步生长曲线实验

一步生长曲线实验可以研究噬菌体的侵染和复制能力(Middelboe et al, 2010), 本文参考李自强(2018)的方法进行实验。为了提高噬菌体的可见性, 本实验使用RO培养基(1L采集自厦门五缘湾的近岸海水, 加入1g酵母提取物、1g蛋白胨和1g乙酸钠, pH=7.4~7.8; 固体培养基加入1.5%技术琼脂粉, 半固体培养基加入0.5%琼脂粉; 110℃高压灭菌30min)。实验前, 将纯噬菌体丰度调整到2×106PFU·mL-1, 宿主用RO液体培养基培养至OD600=0.2。将1000μL宿主菌液与100μL噬菌体样品混合, 黑暗静置5min使噬菌体浸染细菌。将样品离心(5000×g, 4℃, 4min)并用干净的RO培养基洗涤沉淀两次, 以去除游离的噬菌体, 耗时20min。样品洗涤后立即加入100mL的RO培养基中摇匀, 置于摇床培养(160rpm, 30℃)。实验中每10min取样一次, 用双层平板法测定噬菌体丰度, 同时设置3个平行样。

1.7 DNA提取与测序

本研究用酚-氯仿抽提法提取噬菌体纯株的DNA(Yang et al, 2017), 具体步骤如下: 向富集后的高浓度噬菌体悬液中分别添加蛋白酶K溶液、SDS溶液和EDTA溶液, 于55℃恒温水浴中消化3h; 先后用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:l)核酸提取液、等体积的氯仿-异戊醇混合液(24:1)去除样品中的蛋白等杂质; 加入等体积异丙醇液体混匀, -20℃静置至少1h后再次离心(12000×g, 4℃, 5min), 收集所得噬菌体核酸沉淀, 用事先预冷的70%乙醇溶液冲洗沉淀两次并风干; 将该核酸沉淀溶解于100μL的TE缓冲液中(10mmol·L-1 Tris-HCl, 1mmol·L-1 EDTA, pH=8.0), 置于-20℃保存。
噬菌体全基因组测序由(中国)上海翰宇生物科技有限公司完成。测序文库由NEBNext® UltraTM DNA文库制备试剂盒构建, 使用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。采用Trimmomatic v0.32和Velvet v1.2.03软件分析原始数据和组装基因组(Zerbino et al, 2008; Bolger et al, 2014)。

1.8 基因组和系统发育分析

噬菌体基因组由GeneMarkS (http://exon.gatech.edu/GeneMark/index.html)在线软件和ORF Finder在线软件 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)进行开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)预测。根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov)非冗余(Non-Redundant, NR)蛋白数据库的protein-protein BLAST(Blastp)搜索算法, 以E-value≤10-5为阈值, 对每个翻译后的ORF进行搜索比对, 根据得到的同源基因编码的蛋白功能对ORF进行注释和功能预测。采用tRNAscan-SE v.2.0在线软件 (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)识别基因组中的tRNA编码序列(Lowe et al, 2016)。此外, 本文利用致病菌毒力因子数据库(Virulence Factor Database, VFDB; http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和综合抗生素耐药性数据库(Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD; https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)检测噬菌体的毒力基因和抗药性基因(Chen et al, 2005; Alcock et al, 2020)。由于DNA聚合酶是重要的功能蛋白, 在噬菌体基因序列中具有较高保守度, 因此本文不仅利用噬菌体全基因组构建系统发育进化树, 同时也采用DNA聚合酶研究噬菌体基因的系统发育关系。采用MEGA 6.0软件, 用最大似然法构建全基因组和DNA聚合酶基因的系统发育进化树, bootstrap检验1000次。根据系统发育分析结果, 参考ICTV的2019版分类目录对噬菌体进行分类。比较基因分析采用Blast 2.7.1+和Easyfig 2.2.3进行。
本文分离获得的噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ ValM_R11Z的基因组信息已提交至NCBI GenBank数据库, 序列号分别为MT612988和MT612989。

1.9 噬菌体环境分布分析

为了了解弧菌噬菌体在水体环境中的分布情况, 本文将噬菌体的氨基酸序列在太平洋宏基因组数据库(Pacific Ocean Viromes, POV)和全球海洋调查数据库(Global Ocean Sampling, GOS)中进行同源序列搜索。采用tBlastn比对方法, 设置比对阈值为E-value≤10-5, 保留比对得分≥40且氨基酸长度≥30aa的结果。

2 结果

2.1 噬菌体分离与鉴定

在本文的噬菌体分离实验中, 我们成功分离得到两株巨型噬菌体, 分别为vB_ValM_R10Z(以下简称为R10Z)和vB_ValM_R11Z(以下简称为R11Z)。两株噬菌体的分离地点为福建省漳州市东山岛, 其中R10Z分离自2018年10月采集的对虾养殖水样, R11Z分离自2019年5月采集的水产市场水样。经过双层平板培养12~24h后, 两株噬菌体均可在双层平板上形成清晰透明空斑, 两者产生的噬菌斑形态相似, 直径约0.6mm, 空斑外有1mm宽的淡白色圆环(图1a、1b)。R10Z形成的单个噬菌斑中具侵染活性的噬菌体约104个, R11Z约106个, 表明噬菌体R11Z比R10Z具有更高的侵染活性。
图1 噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的噬菌斑形态图与电镜形态图

a. vB_ValM_R10Z的噬菌斑形态图; b. vB_ValM_R11Z的噬菌斑形态图; c. vB_ValM_R10Z的电镜形态图; d. vB_ValM_R11Z的电镜形态图

Fig. 1 Phage plaques on double-layer plate and morphology in transmission electron microscopy of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

a. Phage plaques of vB_ValM_R10Z; b. phage plaques of vB_ValM_R11Z; c. transmission electron microscopy images of vB_ValM_R10Z; d. transmission electron microscopy images of vB_ValM_R11Z

透射电镜照片显示, 噬菌体R10Z和R11Z在形态及大小上相似, 具有纵向拉长的二十面体头部, 延纵轴中心对称, 拥有可伸缩的尾部结构, 可见若干尾丝, 属于肌尾噬菌体(图1c、1d)。两株噬菌体头部长度约为147±1nm, 头部宽度约为79±2nm, 尾长约为117±3nm。氯仿敏感性实验结果显示两株噬菌体均对氯仿不敏感, 说明其外层衣壳和衣壳周围不含脂质, 符合有尾噬菌体目的特征(冯书章 等, 2007), 并且电镜图像中未见脂膜结构也验证了这一结果。此外, 在噬菌体颗粒头部的顶端, 可以看到模糊的短丝状结构, 这一结构在噬菌体φSt2和φGrn1中也有发现(Kalatzis et al, 2016)。

2.2 宿主范围

根据实验结果, 噬菌体R10Z和R11Z具有一致的宿主范围(表1)。除了实验宿主V. alginolyticus ATCC 17749T外, 两株噬菌体均能感染海洋浮游细菌V. owensii JL3186, 但不能感染另一株溶藻弧菌V. alginolyticus JL2674和其他实验菌株。两株噬菌体可侵染至少一种弧菌, 但不能侵染同种弧菌的所有株系, 这种现象在弧菌噬菌体中较常见。此外, R10Z、R11Z和φpp2都能够侵染V. alginolyticus ATCC 17749T, 但只有φpp2能够侵染V. parahaemolyticus ATCC 17802T(Lin et al, 2012)。
表1 噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的裂解谱

Tab. 1 The host ranges of vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

细菌种属 株系 致病性 vB_ValM_R10Z vB_ValM_R11Z
V. alginolyticus ATCC 17749T 可致病 + +
V. alginolyticus JL2674 未知 - -
V. campbellii JL2671 未知 - -
V. campbellii JL3506 未知 - -
V. parahemolyticus ATCC 17802T 可致病 - -
V. parahemolyticus BVP2 未知 - -
V. parahemolyticus 20160623-13 可致病 - -
V. parahemolyticus 20160719-2 可致病 - -
V. parahemolyticus 20160615-5 可致病 - -
V. harveyi BVH1 可致病 - -
V. harveyi 20150916-2 可致病 - -
V. owensii JL2581 未知 - -
V. owensii JL3186 未知 + +
V. owensii JL3187 未知 - -
V. caribbeanicus JL3219 未知 - -
V. fortis JL3515 未知 - -
V. chagasii JL3518 未知 - -
V. inhibens JL3707 未知 - -
V. cholerae 20161020-5 可致病 - -
V. variabilis JL3833 未知 - -

注: “+”表示噬菌体能够侵染该细菌; “-”表示噬菌体不可侵染该细菌

2.3 一步生长曲线

对两株噬菌体分别进行了一步生长曲线实验, 结果如图2所示。两株噬菌体都有显著的潜伏期、爆发期和平台期, 爆发期噬菌体丰度呈S型增长, 增长速度快。噬菌体R10Z的潜伏期为20min, 裂解量为45PFU·cell-1, 于第50min进入平台期; 噬菌体R11Z的潜伏期为20min, 裂解量为114PFU·cell-1, 于第40min进入平台期。两株噬菌体潜伏期大致相同, 都在40~50min时达到平台期, 但R11Z的裂解量显著大于R10Z, 说明R11Z的复制能力优于R10Z。若两种噬菌体侵染复制一轮均用时1h, 裂解量始终差2.5倍(114/45≈2.5), 以及无其他生长限制条件时, 噬菌体复制5~6轮后, 两者的丰度差异即可达到两个数量级(2.5^6≈97.7), 这就是R11Z产生的单个噬菌斑中含有的噬菌体数量远大于R10Z的原因。
图2 噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的一步生长曲线图

两株噬菌体分别进行生长曲线实验, 同时测试3个平行样品并取平均值, 误差线表示3个平行样品的标准差

Fig. 2 One-step growth curves of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

Two phages were tested separately. Three parallel samples were tested at the same time, and the mean value was taken. The error bar represents the standard deviation of the parallel samples

2.4 基因组和系统发育分析

弧菌噬菌体R10Z和R11Z都具有线性的双链DNA, 总长度分别为247167bp和246831bp, G+C含量分别是41.30%和41.33%。通过GeneMarkS预测R10Z和R11Z的基因组, 分别得到386个和385个开放阅读框(ORF), 预测得到的全部ORF均能在NCBI数据库中找到同源基因(图3)。噬菌体R10Z和R11Z分别有111个ORF(28.8%)和110个ORF(28.6%)的功能得到识别, 其中110个注释为具有功能的基因属两者所共有。在共有的110个已知功能基因中, 约50%是与DNA复制、代谢和转录功能相关的基因, 如DNA helicase、DNA methyltransferase、DNA polymerase、RNA ligase、thymidylate synthase、ribonucleoside-diphosphate reductase等基因; 有30%的基因与结构和组装相关, 包括large/small terminase protein、capsid protein、neck protein、baseplate structural protein、tail tube protein、tail fiber等基因; 有2个与裂解相关的基因, 分别是protein rIIA和protein rIIB; 同时, 噬菌体R10Z和R11Z基因组中存在一些与宿主代谢相关的辅助代谢基因, 如噬菌体携带的phoH基因能够在磷限制环境下增强宿主对于磷酸盐的吸收, que(包括QueC、QueD、QueE、QueF和folE)基因可能通过修饰噬菌体DNA以避免受到宿主限制性内切酶的影响, 或通过修饰tRNA调整宿主蛋白的合成以提高翻译效率(Sullivan et al, 2010; Crummett et al, 2016; Hutinet et al, 2019)。噬菌体R10Z具有4个特有的ORF, 其中3个ORF被注释为未知功能的假设蛋白(vB_ValM_R10Z_325、vB_ValM_R10Z_337和vB_ValM_R10Z_384), 另一个被注释为Seg-like homing endonuclease(vB_ValM_R10Z_92)。Seg-like homing endonuclease(Seg-HE)隶属于GIY-YIG域, 与φSt2(GenBank: KT919973)的同源基因相似度超过98%, 与其他同源基因相似度则低于50%。噬菌体R11Z有3个特有的ORF, 其中2个ORF(vB_ ValM_R11Z_79和vB_ValM_R11Z_84)被注释为假设蛋白, 另一个ORF(vB_ValM_R11Z_381)被预测为GIY-YIG保守域的未知功能蛋白, 其同源基因在噬菌体中均被注释为假设蛋白(相似度高达94%), 而在宿主中则被注释为GIY-YIG nuclease family protein(相似度低于40%)。通过tRNAscan-SE识别出噬菌体R10Z和R11Z基因组中都具有31个编码tRNA的基因, 分别分布在基因组的164151~ 172242bp和163682~171440bp序列范围内, 对应了全部的20种氨基酸(表2)。弧菌病的爆发和弧菌的致病能力都与毒力基因有关, 此外存在抗药性基因会给其他弧菌病害治疗手段带来困难, 因此噬菌体编码的毒力基因和抗药性基因可能会增加宿主的致病性和耐药能力(Kalatzis et al, 2018; Mohamad et al, 2019)。利用VFDB和CARD数据库进行比对, 噬菌体R10Z和R11Z基因组中既未发现毒力因子, 也未发现耐药性基因, 这有利于噬菌体的应用。
图3 Schizotequatrovirus(属)噬菌体的比较基因组分析

本图采用Easyfig 2.2.3绘制; 红色箭头表示ORF, 深灰色连线表示相似度较高, 浅灰色连线表示相似度较低, 白色表示不相似

Fig. 3 Genomic comparison of genus Schizotequatrovirus

Drawn with EasyFig 2.2.3; ORFs are indicated by arrows; the dark gray vertical blocks represent close similarity whereas the light gray areas show low similarity and white areas do not show any similarity

表2 噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的tRNA基因

Tab. 2 tRNA genes of phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z

vB_ValM_R10Z vB_ValM_R11Z
tRNA基因
序号		 位置 氨基酸 反密码子 tRNA基因
序号		 位置 氨基酸 反密码子
1 164151~164264 Phe AAA 1 163682~163794 Phe AAA
2 164275~164399 Asn GTT 2 163805~163929 Asn GTT
3 164784~164861 Met CAT 3 164314~164391 Met CAT
4 166706~166779 Pro TGG 4 166236~166309 Pro TGG
5 166789~166865 Pro TGG 5 166319~166395 Pro TGG
6 166873~166948 Arg ACG 6 166404~166479 Arg ACG
7 167302~167378 Leu TAG 7 166833~166909 Leu TAG
8 167380~167454 Phe GAA 8 166911~166985 Phe GAA
9 167544~167618 Lys TTT 9 167075~167149 Lys TTT
10 167630~167706 Lys TTT 10 167161~167237 Lys TTT
11 167770~167844 Glu TTC 11 167301~167375 Glu TTC
12 167851~167936 Tyr GTA 12 167382~167467 Tyr GTA
13 168039~168115 Met CAT 13 167570~167646 Met CAT
14 168411~168509 Ser TGA 14 167942~168040 Ser TGA
15 168574~168647 Ile GAT 15 168105~168178 Ile GAT
16 168654~168727 Trp CCA 16 168185~168258 Trp CCA
17 168803~168877 Asn GTT 17 168334~168408 Asn GTT
18 168879~168954 Asn GTT 18 168410~168485 Asn GTT
19 169024~169099 Asp GTC 19 168554~168629 Asp GTC
20 169119~169192 Gln TTG 20 168649~168722 Gln TTG
21 169322~169396 Thr TGT 21 168850~168925 Thr TGT
22 169968~170042 Ala TGC 22 169167~169241 Ala TGC
23 170117~170192 Arg TCT 23 169316~169391 Arg TCT
vB_ValM_R10Z vB_ValM_R11Z
tRNA基因
序号		 位置 氨基酸 反密码子 tRNA基因
序号		 位置 氨基酸 反密码子
24 170717~170792 Met CAT 24 169915~169990 Met CAT
25 170982~171055 Gly TCC 25 170180~170253 Gly TCC
26 171062~171135 Val TAC 26 170260~170333 Val TAC
27 171551~171627 His GTG 27 170749~170825 His GTG
28 171640~171713 Cys GCA 28 170838~-170911 Cys GCA
29 171716~171792 Leu TAA 29 170914~170990 Leu TAA
30 171909~171985 Leu CAA 30 171107~171183 Leu CAA
31 172154~172242 Ser GCT 31 171352~171440 Ser GCT
根据全基因组构建的系统发育树结果显示, 噬菌体R10Z和R11Z具有十分相近的亲源关系, 并与噬菌体ValKK3聚为一类(图4a)。噬菌体的全基因组核酸序列比对结果显示, R10Z和R11Z的基因组相似度高达99.45%, 两者与噬菌体ValKK3的相似度分别为98.29%和98.44%。基于DNA polymerase的系统发育分析显示, 噬菌体R10Z和R11Z与ValKK3、VH7D、φSt2、φGrn1、KVP40、φpp2、nt-1聚在同一分支(图4b)。根据ICTV发布的2019版分类目录, 该分支噬菌体属于Myoviridae (科), Tevenvirinae (亚科), Schizotequatrovirus (属), 该属噬菌体的详细信息见表3。噬菌体R10Z和R11Z与同属噬菌体ValKK3、VH7D、φSt2和φGrn1的相似度达到96%~98%, 与KVP40、φpp2和nt-1的相似度相对较低, 约为86%(图3)。
图4 噬菌体全基因组(a)和DNA聚合酶基因(b)的系统发育进化树

系统发育进化树由最大似然法构建, Bootstrap 检验1000次,检验可信度低于90的值隐藏; vB_ValM_R10Z 和vB_ValM_ RI0Z 加粗显示,括号内为噬菌体的GenBank序列号。系统发育树中包括本文分离获得的噬菌体vB__ValM_R10Z、vB__ValM_R1IZ和所有前人已发表的Schizotequatrovirus类噬菌体,以及其余类群的部分代表性噬菌体

Fig. 4 Phy logenetic trees of complete genome (a) and DNA polymerase (b) of phages vB_ ValM_ R10Z, vB_ ValM_R11Z and other known phages

Maximum likelihood analyses with 1000 bootstrap replicates were used to derive the trees based on amino-acid sequences. Bootstrap values are shown above the major nodes, and the values below 90 are hidden. Phages vB_ValM_R10Z and vB_ValM_R11Z are marked in bold. Numbers in brackets represent corresponding GenBank ID. The phylogenetic trees include phages vB_ValM_ R10Z and vB_ValM_ R11Z, as well as all published Schizotequatrovirus phages and some representative phages of other genera

表3 Schizotequatrovirus噬菌体的对比

Tab. 3 Comparison of Schizotequatrovirus phages

噬菌体 vB_ValM_R10Z vB_ValM_R11Z VH7D φSt2 φGrn1 ValKK3 KVP40 φpp2 nt-1
宿主菌 V. alginolyticus V. alginolyticus V. sp. 7D V. alginolyticus V. alginolyticus V. alginolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. natrigens
地点 中国东山岛 中国东山岛 中国厦门 希腊克里特岛 希腊克里特岛 马来西亚 日本Urado湾 中国台湾南部 大西洋
分离环境 养殖水体 污水 养殖水体 海水 海水 沉积物 污水 养殖水体 沉积物
头长/nm 147 148 155 151 138 140 140 150 120
头宽/nm 78 81 75 81 74 79 70 90 70
尾长/nm 120 114 132 134 120 130 110 110
潜伏期/min 20 20 30 30
裂解量/PFU·cell-1 43 114 97 44
噬菌体 vB_ValM_R10Z vB_ValM_R11Z VH7D φSt2 φGrn1 ValKK3 KVP40 φpp2 nt-1
GenBank
收录号		 MT612988 MT612989 KC131129.1 KT919973.1 KT919972 KP671755.1 AY283928 JN849462 HQ317393
基因组大小/bp 247167 246831 246964 250485 248605 248088 244835 246421 247489
G+C值 41.30% 41.33% 41.31% 42.60% 38.80% 41.20% 42.60% 42.55% 41.33%
ORF数量/个 386 385 387 412 410 390 386 383 379
tRNA数量/个 31 31 27 29 28 30 30 28
毒力基因 无 无 无 无 无 无 无 无 无
抗药性基因 无 无 无 无 无 无 无 无 无
参考文献 本文 本文 Luo et al, 2015 Kalatzis et al, 2016; Skliros et al, 2016 Kalatzis et al, 2016; Skliros et al, 2016 Lal et al, 2016 Matsuzaki et al, 1992; Miller et al, 2003 Lin et al, 2012 Zachary, 1976

注: 表中空白表示无数据

2.5 环境分布

将噬菌体R10Z和R11Z的ORF在POV和GOS数据库中进行比对搜索, 结果显示R10Z和R11Z的同源基因在海洋环境中分布非常广泛(图5)。噬菌体R10Z在GOS近岸、河口和外海环境中分别找到同源基因114个(29.53%)、99个(25.64%)和95个(24.61%), 相似度范围分别为20.35%~75.93%、20.95%~65.30%和20.35%~73.33%; 在POV近岸、河口和外海环境中同源基因的比例分别约为30.05% (相似度为22.00%~83.33%)、21.24% (相似度为23.58%~77.51%)和25.38% (相似度为22.84%~82.82%)。基于噬菌体R11Z和噬菌体R10Z在基因组水平上具有高度的相似性, 两者在POV和GOS不同环境中具有一致的分布规律。
图5 噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z的ORF在POV和GOS数据库中的分布

Fig. 5 Prevalences of vB_ValM_R10Z ORFs and vB_ValM_R11Z ORFs in the environmental viral metagenomic databases of POV and GOS

3 讨论与结论

为获取可用于海水养殖中防治弧菌病害的生物杀菌剂, 本研究分别从福建省东山县的对虾养殖场与水产市场废水环境中分离获得了噬菌体vB_ValM_R10Z和vB_ValM_R11Z。其中, 噬菌体R10Z分离自2018年10月采集的养殖场水样, R11Z分离自2019年5月采集的水产市场污水, 两者的分离地点较近。系统发育分析表明, R10Z和R11Z具有相近的亲缘关系, 属于Tevenvirinae (亚科), Schizotequatrovirus(属)。通常认为基因组超过200kbp的噬菌体即为巨型噬菌体(jumbo phage), 本研究分离的两株噬菌体基因组大小近250kbp, 已报道的Schizotequatrovirus噬菌体的基因组大小均在250kbp左右(表3), 符合巨型噬菌体特征, 因而均属于巨型噬菌体(Yuan et al, 2017)。
R10Z和R11Z都拥有31个编码tRNA的基因, 对应了全部的氨基酸类型, 同属的其他噬菌体也至少有28个tRNA基因(表3), 说明tRNA数量多是Schizotequatrovirus噬菌体的共同特征, 有利于提高噬菌体特异性基因的翻译效率(Kiljunen et al, 2005)。在两株噬菌体已知功能的共有基因中, 高达50%的基因与DNA复制、代谢和转录功能相关, 其编码的蛋白质可以替代宿主部分蛋白的功能, 有利于提高噬菌体的复制效率(O'Donnell et al, 2013)。此外, 噬菌体通常会保留对自己生存有益的基因, 虽然两株噬菌体中出现的辅助代谢基因不直接参与复制过程, 但其对宿主代谢系统的改造显然是有利的, 能够帮助宿主获取更多的营养物质供其使用(Skliros et al, 2016; Al-Shayeb et al, 2020)。这些特性使得R10Z和R11Z等Schizotequatrovirus类群巨型噬菌体能更少地依赖宿主的代谢体系和拥有更强的复制能力, 从而有利于噬菌体的裂解性感染(Wilson, 1973; Yuan et al, 2017)。
尽管两株噬菌体具有高度相似的形态和基因组, 但两者的复制能力有明显的差异, 一步生长曲线结果显示两者的裂解量相差2.5倍。类似的现象在其他研究中也有报道(Liu et al, 2014; Kalatzis et al, 2016)。例如, Kalatzis等(2016)分离的两株噬菌体φSt2和φGrn1基因相似度为98.57%, 裂解量则相差两倍; Liu等(2014)分离的两株短尾噬菌体基因相似度为99.99%, 裂解量却相差7倍, 其中噬菌体φ318的裂解量为72PFU·cell-1, 而φAs51的裂解量仅为10PFU·cell-1, 这是由关键碱基的突变造成了两者复制能力的差异。本文推测, 噬菌体R10Z和R11Z的HE基因差异是导致两者复制能力明显不同的原因。噬菌体R10Z和R11Z的基因组具有高度相似性, 仅有少数基因(分别具有4个和3个)为各自特有。噬菌体R10Z的特有基因Seg-HE隶属于GIY-YIG保守域, 与噬菌体R11Z中的特有基因GIY-YIG域的覆盖度仅为26%, 相似度只有22.22%。Seg-HE分布在许多Tevenvirinae噬菌体及其部分宿主的基因组中, HE在原核生物中有修复受损DNA的作用, 噬菌体基因组中HE能够裂解并利用宿主DNA以用于自身DNA的复制(Mak et al, 2010)。也有研究指出, HE基因能够在宿主和噬菌体之间转移, 可将其复制到缺乏HE基因的同源位点(Zeng et al, 2009; Skliros et al, 2016)。本文进一步推测, HE的水平基因转移作用可能是噬菌体R10Z和R11Z中GIY-YIG域存在差异的原因。HE可能会使抗药性基因在宿主中转移扩散, 然而已报道的Schizotequatrovirus类噬菌体基因组中均未发现毒力基因和抗药性基因(表3)。因此, 噬菌体基因组中虽然存在HE等转座因子, 但对此类噬菌体在水产病害防治中的应用尚不构成威胁。
在噬菌体R10Z和R11Z的电镜照片中, 可见噬菌体颗粒头部顶端有成簇的短丝状结构, Schizotequatrovirus类噬菌体φSt2和φGrn1中也有出现(Kalatzis et al, 2016), 但这一结构在已有的Tevenvirinae类噬菌体中未见深入研究。对侵染Caulobacter crescentus的长尾噬菌体φCb13和φCbK头部丝状结构的研究则较为完善, 研究认为噬菌体在侵染过程的前期, 为了吸附具有较强运动能力的宿主菌, 利用该丝状结构在宿主表面起固定作用(Guerrero-Ferreira et al, 2011)。但两类噬菌体差异较大, φCb13和φCbK的头部丝状物较长, Schizotequatrovirus类噬菌体的丝状结构短而密集, 其功能不一定相同。
本研究分离获得的Schizotequatrovirus类巨型噬菌体R10Z和R11Z的形态和基因相似度高, 均能跨种侵染细菌, 自我增殖能力强, 裂解宿主的时间短, 是强有力的生物杀菌物质。两株噬菌体的基因组中均未检出毒力基因, 故噬菌体感染造成病害弧菌致病性增强的可能性较低; 此外也未检出抗药性基因, 因而投放噬菌体制剂不会造成养殖环境和周围水体生态环境的抗药性基因污染, 不会增大病害治理难度。噬菌体R10Z和R11Z的生理性状优良, 无毒害, 具有作为水产弧菌病生物防治药物的研发潜力。

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