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Journal of Tropical Oceanography >

2021 , Vol. 40 >Issue 4: 44 - 49

DOI: https://doi.org/10.11978/2020066

Marine Biology

Morphological and Phylogenetic Studies on Chaetoceros seychellarus

  • NIU Biaobiao ,
  • ZHAI Mengyi ,
  • LI Yang
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  • Guangdong Provincial Key Laboratory of Healthy and Safe Aquaculture, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
LI Yang. email:

Copy editor: YAO Yantao

Received date: 2020-06-19

  Revised date: 2020-08-08

  Online published: 2020-08-18

Supported by

Science & Technology Basic Resources Investigation Program of China(2018FY100200)

Copyright

Copyright reserved © 2021. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

Chaetoceros seychellarus, which belongs to subgenus Phaeoceros of genus Chaetoceros in Bacillariophyta, is a rare species in the world. Present knowledge on the morphology is incomplete, because studies are mainly conducted under LM (light microscope) and lack ultrastructural characteristics under EM (electron microscope). Its systematic information is still unknown. In this study, monoclonal strains of C. seychellarus were established from coastal waters in the southeast China. The morphology was observed using LM and SEM (scanning electron microscope). D1-D3 regions of the large subunit ribosomal DNA (LSU) were amplified to construct the phylogenetic relationship. The key features were straight chains, rectangular apertures and two rimoportulae on each valve that distributed symmetrically along the transapical axis. The phylogenetic tree showed C. seychellarus was a sister to C. danicus. On LSU tree, the section Borealia established based on morphology solely was paraphyletic, which needs revision in further.

Key words： Chaetoceros seychellarus; morphology; phylogeny; section Borealia

Cite this article

NIU Biaobiao , ZHAI Mengyi , LI Yang . Morphological and Phylogenetic Studies on Chaetoceros seychellarus[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2021 , 40(4) : 44 -49 . DOI: 10.11978/2020066

角毛藻属(Chaetoceros Ehrenberg)是海洋浮游硅藻中物种多样性最为丰富的大属之一, 广泛分布于全球海域(Tomas et al, 1997)。依据角毛中是否含有色素体可划分为两个亚属: 有色角毛藻亚属Phaeoceros和无色角毛藻亚属Hyalochaete (Hernández-Becerril, 1996)。角毛藻是海洋浮游植物的优势类群(Tomas et al, 1997; Shevchenko et al, 2006), 也是重要的藻华生物(Tomas et al, 1997)。
塞舌尔角毛藻(C. seychellarus G.Karsten)隶属于有色角毛藻亚属, 是全球罕见种, 最初报道于印度洋(Karsten, 1907), 此后多年未见报道, 而近二三十年来在北美加利福尼亚沿岸、墨西哥湾以及印度洋开始有零星报道(Hernández-Becerril, 1993; Hernández- Becerril et al, 1998)。韩国近年亦曾有报道, 该报道中研究者利用光镜在自然样品中观察到了少数群体, 所提供的有效形态特征相对有限(Lee, 2011)。以往对于塞舌尔角毛藻的认知多限于普通光学显微镜观察, 因而对其形态学了解得不够全面, 导致在分类学上出现争议, 如塞舌尔角毛藻与金色角毛藻是否为同种异名(Taylor, 1966)的问题。对于塞舌尔角毛藻在系统学划分上也存在一些疑问, 有学者将塞舌尔角毛藻归入北方组Section Borealia (Taylor, 1966), 也有学者将其单独成组, 并命名为塞舌尔组Section Seychellari (Hernández-Becerrilet al, 2001)。
为全面界定塞舌尔角毛藻的物种信息, 本文从台湾海峡和海南岛三亚海域分离并建立了单克隆培养株系, 利用光镜和扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)进行了较为详尽的形态学观察, 首次扩增了该种的核糖体大亚基D1~D3区序列, 构建并分析了其分子系统树。相关研究成果丰富了我国海洋硅藻的分类学资料, 也为硅藻系统学研究提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

通过搭载国家自然科学基金委2016年度台湾海峡春季共享航次, 采集了浮游植物活体样品, 此外在海南岛三亚海域也开展了相关样品的采集。采样时, 使用浮游植物网(孔径10µm)进行水平拖网, 并同步记录水温、盐度等水文参数, 回到实验室后进行目标藻株的分离、纯化和扩大培养。

1.2 单克隆培养株系的建立

利用毛细玻璃管分离法在生物倒置显微镜(Mshot MI-12)下挑取目标藻细胞, 经多次复洗后快速转移至滴有L1培养液的48孔培养板内, 待其存活并繁殖达到100个细胞, 再转移到250ml三角瓶中进行扩大培养。藻株保存于光照培养室内, 培养条件是恒温22±2℃、光暗周期比12:12, 光照强度约50~80µmol·m-2·s-1。建立的塞舌尔角毛藻培养株系共5个, 详细信息见表1。
表1 塞舌尔角毛藻培养藻株信息

Tab. 1 Information of monoclonal strains used in this study

株系编号 采样海域 采样时间
MC2034 台湾海峡(117°48'36"E, 22°42'38"N) 2016年4月2日
MC2054 台湾海峡(117°48'36"E, 22°42'38"N) 2016年4月2日
MC2066 台湾海峡(120°20'24"E, 25°33'00"N) 2016年4月8日
MC2083 三亚海域(111°54'00"E, 19°45'94"N) 2017年4月7日
MC2090 三亚海域(111°54'00"E, 19°45'94"N) 2017年4月7日

1.3 休眠孢子的诱导

在上述培养条件下, 分别吸取5mL处于对数生长期的藻液, 转移到100mL三角瓶中, 以L1培养液(缺氮)诱导休眠孢子(Kooistra et al, 2010)。每个藻株均诱导 3 次以上, 每次诱导时间持续两周, 期间观察休眠孢子的产生。

1.4 形态学特征的观察

光镜观察: 取5µL处于对数生长期的藻液, 置于载玻片上, 压片后在显微镜(Olympus BX53)下进行微分干涉(differential interference contrast, DIC)观察, 并使用Olympus DP27数码相机记录其形态特征。
扫描电镜观察: 取3mL处于对数生长期的藻液, 加入等体积浓硫酸(>95%), 酸化10min, 以去除有机质, 用灭菌双蒸水(ddH2O)多次洗涤至中性。将藻细胞过滤到滤膜上, 放置在避光干燥处待其晾干后, 利用碳导电胶贴于SEM样品台, 喷金后置于扫描电镜(Zeiss Ultra 55)下观察和记录其形态特征。

1.5 分子系统学研究

利用离心法收集藻细胞, 提取总DNA, 扩增核糖体大亚基基因D1~D3区(Lundholm et al, 2002; Xu et al, 2020)。LSU rDNA引物为D1R-F(5’-ACC CGC TGA ATT TAA GCA TA-3’)和D3B-R (5’-TCG GAG GGA ACC AGC TAC TA-3’)。采用50µL的PCR反应体系: 25µL的PCR Mix, 正、反向引物各1µL, 21µL灭菌ddH2O和 2µL目标藻株总DNA。扩增条件为: 首先94℃预变性5min; 然后进行如下36个循环: 94℃变性30s, 56℃复性30s, 72℃延伸45s; 之后72℃再延伸7min。PCR产物于4℃保存, 并送往华大基因公司(The Beijing Genomics Institute, BGI)进行测序。从美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载角毛藻物种的LSU nrDNA序列, 运用BioEdit软件进行比对和矩阵分析(Nylander, 2004)。基于MrModeltest 2.3选择最适模型, 分别用RAxML-HPC2(Miller et al, 2010)和MrBayes 3.2(Ronquist et al, 2012)构建最大似然树(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯推理树(Bayesian Inference, BI)。选用冕孢角毛藻C. diadema (EF42 3433)作为群外对照。

2 结果

2.1 塞舌尔角毛藻的形态学描述

Chaetoceros seychellarus G.Kasten
Kasten, 1907: 987, Fig. 4a~e; Hustedt, 1920: Pl. 327, Fig. 12~13; Hendey, 1937: 296; Simonsen, 1974: 32; Hernández-Becerril, 1993: 121, Fig.16~27; Hernández-Becerril et al, 2001: 400, Fig. 1~15.
根据镜下显示(图1), 塞舌尔角毛藻细胞链直、粗壮, 常形成6~23个细胞不等的长链(图1a), 也有单细胞(图1c)。细胞和角毛内散布有数量众多的颗粒状色素体(图1a、1c—f)。细胞宽环面观为矩形, 壳面长轴短于贯壳轴, 壳面长轴介于12.85~14.73µm(中位值±标准差: 13.15±0.60µm), 贯壳轴高20.51~45.51µm (中位值±标准差: 28.55±6.27µm)。窗孔呈矩形(图1e、1f), 高2.56~4.61µm(中位值±标准差: 3.22±0.73µm)。壳套较高, 高度大于贯壳轴的三分之一, 与环带相接处有明显凹沟(图1d—f、1i、1j)。角毛粗壮, 壳面观时角毛长度较为一致, 向四周呈辐射状(图1b)。壳面和壳套上布满细小孔纹(图1g—i), 壳面孔纹散布, 角毛基部孔纹明显密集(图1h)。壳面呈圆形或近圆形(图1h)。
图1 塞舌尔角毛藻(株系编号: MC2054)

a. 群体环面观; b. 群体壳面观; c. 单细胞; d. 上壳面; e. 下壳面; f. 链中细胞(箭头指示壳套与环带连接处); g. 链中相邻壳面(箭头指示唇形突); h. 内壳面观; i. 上壳面; j. 下壳面; k、l. 角毛; m. 角毛截面

Fig. 1 Chaetoceros seychellarus (MC2054).

a: Chain in girdle view; b: chain in valve view; c: solitary cell; d: terminal anterior valve; e: terminal posterior valve; f: intercalary cells and arrows showing connection between mantle and bands; g: sibling valves and arrows showing two rimoportulae; h: valve; i: terminal anterior valve; j: terminal posterior valve; k-l: setae structure; and m: setae section

链中角毛相交于基部, 融合后向外延伸, 末端向链端弯曲(图1a、1e、1f)。链状群体的两个链端壳面形态不同(图1a、1d、1e), 上壳面角毛先向壳面中心延伸, 彼此相交之后再分离(图1a、1d、1i), 下壳面角毛不相交, 从壳面伸出即向两侧延伸(图1a、1e、1j)。单细胞两个壳面亦为异形(图1c)。角毛呈四棱形(图1m), 每条棱上分布有箭头状的刺, 大小介于0.70~3.00µm(中位值±标准差: 1.74±0.59µm), 密度为0.121~0.166个·µm-1(中位值±标准差: 0.150±0.118个·µm-1)。角毛上有两种孔纹, 一种是沿着角毛径向排列的大孔, 密度为0.574~0.890个·µm-1(中位值±标准差: 0.739±0.092个·µm-1); 另外一种是横向排列的小孔, 密度为6.3~9.3个·µm-1(中位值±标准差: 7.6±1.2个·µm-1) (图1k、1l)。
每个壳面均有两个唇形突, 在壳面短轴两侧呈对称分布(图1g、1h)。其在外壳面具有短的外管, 末端呈嘴唇状结构(图1g、1i); 而在内壳面上则为裂缝状, 呈“工”字形(图1h)。
未见休眠孢子。

2.2 塞舌尔角毛藻的生态分布

本文藻株采自我国台湾海峡(117°48'36"E, 22°42'38"N; 120°20'24"E, 25°33'00"N)与三亚海域(111°54'00"E, 19°45'94"N)。根据已有的研究报道, 塞舌尔角毛藻分布于印度洋(Karsten, 1907)、北美加利福尼亚沿岸、墨西哥湾(Hernández-Becerril, 1993; Hernández-Becerril et al, 1998)和韩国沿海(Lee, 2011)等。塞舌尔角毛藻为罕见的暖水种(Hernández- Becerril et al, 2001), 因此主要分布在热带和亚热带海域。

2.3 基于LSU nrDNA部分序列构建的分子系统树分析

使用NCBI的blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能, 检索塞舌尔角毛藻邻近物种的LSUnr DNA D1~D3区序列, 得到31条邻近物种和外类群序列, 另外本文研究获得1条塞舌尔角毛藻藻株序列, 因此共有32条序列用于最终的分子系统学分析。基于核糖体大亚基DNA(LSU nrDNA)部分序列构建的ML和BI系统进化树显示, 两者具有相似的拓扑结构, 其中ML树拓扑结构在本文中展示(图2)。
图2 基于核糖体大亚基部分序列构建的系统发育树

斜杠左侧值为BI, 右侧值为ML, -表示BI值<0.9或者ML值<80

Fig. 2 Phylogenetic analysis inferred from LSU partial sequences

该分子系统树与De luca等(2019)的报道一致, 有色角毛藻亚属的物种聚集在一个大的分支上, 反映出较好的单系起源(BI/ML=1.00/100)。塞舌尔角毛藻首先与丹麦角毛藻(C. danicus)聚在一起(BI/ML= 1.00/81), 之后与扭曲角毛藻(C. convolutus)聚在一个分支(BI/ML=1.00/94)上, 说明它们之间具有较近的遗传关系。

3 讨论

3.1 塞舌尔角毛藻的形态学研究

塞舌尔角毛藻的典型特征是链端壳面异形, 即上壳面与下壳面的特征不一致, 单细胞的上、下壳面亦为异形(图1c), 这一特征也见于秘鲁角毛藻(C. peruvianus)和均等角毛藻(C. aequatoralis) (Hernández- Becerril, 1993; Tomas et al, 1997; Hernández-Becerril et al, 2001)。此外, 本研究还观察到另一新的形态学特征——链中角毛的走势。当从壳面观察漂浮状态群体时, 角毛并非整齐地排列在两侧, 而是以细胞为中心向四周呈放射状(图1b)。角毛走势也是角毛藻物种鉴定的重要依据(Tomas et al, 1997; Hernández- Becerril et al, 2001), 角毛走势作为物种鉴定依据在聚生角毛藻复合群(C. socialis complex)(Chamnansinp et al, 2013)和柔弱角毛藻复合群(C. debilis complex)(Xu et al, 2020)中已有成功应用, 因此本文建议将链中角毛的走势纳入到塞舌尔角毛藻的识别特征中。
本文构建的分子系统树显示(图2), 塞舌尔角毛藻与丹麦角毛藻具有最近的亲缘关系, 它们也具有较多相似的形态特征, 如壳套较高、窗孔狭窄、壳套上有硅质增厚带等(Hernández-Becerril, 1993)。两者之间的形态学差异主要在于: 1) 塞舌尔角毛藻可形成长链状群体, 也可单细胞生活(图1c), 而丹麦角毛藻则常为单细胞生活, 偶见2~3个细胞的短链群体; 2) 塞舌尔角毛藻的链端壳面异形(图1a、1d、1e、1i、1j), 丹麦角毛藻的链端壳面同形; 3) 塞舌尔角毛藻的每个壳面均具有两个唇形突, 而丹麦角毛藻仅具有一个(Hernández-Becerril, 1996)。此外, 塞舌尔角毛藻的相似物种还有北方角毛藻和密连角毛藻, 上述形态学差异也同样适用于塞舌尔角毛藻与后两者之间的区别。
金色角毛藻(C. aurivillius)与塞舌尔角毛藻的形态特征基本一致, 尤其是链端壳面异形。学者们根据优先原则认为塞舌尔角毛藻是金色角毛藻的同种异名(Taylor et al, 1966; 郭玉洁 等, 2003), 同时两者也具有细微的差异, 如塞舌尔角毛藻壳套和环带相接处有凹沟(图1d—f、1i、1j), 而金色角毛藻却没有。但是, 以往关于上述两个物种的研究多以光镜为观察手段, 尤其是金色角毛藻, 其在电镜下的超微形态特征至今未见报道, 有关其分子系统学的研究更是空白。因此有学者持保留观点, 认为在获得详尽的形态特征之前, 仍将它们作为独立的物种(Manguin, 1957; Hernández-Becerril et al, 2001)。本研究并未建立金色角毛藻培养株系, 故未获得其形态学和分子生物学数据, 建议暂时仍将金色角毛藻与塞舌尔角毛藻作为两个独立物种, 待后续研究获取充分的物种信息后再进行分析。

3.2 塞舌尔角毛藻的系统学研究

根据形态特征, 有色角毛藻亚属被划分为7个组(section), 其中塞舌尔角毛藻被划分到北方组Section Borealia, 该组的典型特征是: 1) 细胞和角毛中含色素体; 2) 直链状或单细胞生活; 3) 宽环面呈矩形; 4) 壳面呈椭圆形或圆形; 5) 角毛具刺和孔纹; 6) 窗孔狭窄; 7) 唇形突无明显外管(Hernández- Becerril, 1996)。塞舌尔角毛藻也表现出上述典型特征。本文的分子系统学研究中, 引用了3个北方组物种: 塞舌尔角毛藻、丹麦角毛藻和卡氏角毛藻(C. castracanei), 分子系统树显示它们不在一个分支上。虽然塞舌尔角毛藻与丹麦角毛藻聚在一个分支上, 但是卡氏角毛藻(EF423453)却位于另一个分支, 两分支之间被其他有色角毛藻亚属的物种分割, 如大西洋角毛藻(C. atlanticus)和双刺角毛藻(C. dichaeta)。根据系统树显示, 北方组并非单系起源, 目前该组的划分可能仍存在问题, 后续需要引入更多的分子数据来加以完善和修订。
鉴于塞舌尔角毛藻的每个壳面均具有两个唇形突, 显著区别于北方组的其他物种, Hernández- Becerril等(2001)建议将塞舌尔角毛藻单独划分为塞舌尔组(Section Seychellari)。该组的典型特征为: 1) 适中或较长的链状群体; 2) 链状群体两端细胞不同; 3) 窗孔为窄矩形状; 4) 群体中每个壳面具有两个唇形突, 对称地位于壳面短轴末端, 相邻壳面的唇形突位于相同位置(Hernández-Becerril et al, 2001)。根据本文构建的系统树显示, 塞舌尔角毛藻与丹麦角毛藻相邻, 表明两者之间有较近的亲缘关系。但是, 丹麦角毛藻并不具有上述特征, 以往报道的北方组物种亦不具有上述特征, 因此本文认为上述特征可能是塞舌尔角毛藻独有的特征, 并非其隶属小类群的共有特征, 因而不足以成为系统划分的形态学依据, 更为复杂的复合特征或许能够解答它们之间的系统学关系。至于塞舌尔角毛藻是否应该独立成组, 目前尚不能给出结论, 后续还需要有色角毛藻亚属物种更多分子数据的引入。

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