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Journal of Tropical Oceanography >

2022 , Vol. 41 >Issue 3: 111 - 118

DOI: https://doi.org/10.11978/2021109

Marine Biology

Molecular cloning and functional study of mitochondrial manganese superoxide dismutase in Macrobrachium rosenbergii

  • LI Yanan , 1 ,
  • LU Linqing 1 ,
  • ZHANG Peng 2 ,
  • QIN Zhendong 1 ,
  • LIN Li 1 ,
  • YAN Lei , 2
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  • 1. College of Animal Sciences and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangdong Provincial Water Environment and Aquatic Products Security Engineering Technology Research Center, Guangzhou Key Laboratory of Aquatic Animal Diseases and Waterfowl Breeding, Guangzhou 510222, China
  • 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China
YAN lei. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2021-08-26

  Revised date: 2021-11-04

  Online published: 2021-11-09

Supported by

National Natural Science Foundation of China(42006115)

Fund of Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment(FEEL-2021-10)

Guangdong Provincial Rural Revitalization Strategy Special Fund(200-2018-XMZC-0001-107-0298)

Fold

Abstract

Macrobrachium rosenbergii is one of the important shrimps for consumers in China. In recent years, bacterial diseases have occurred frequently and caused huge economic losses in M. rosenbergii aquaculture. Therefore, understanding its immune mechanism is essential to guide disease prevention and control. Mitochondrial manganese superoxide dismutase (mMnSOD) is considered to be the first line against oxidative stress, playing a vital role in innate immunity. However, the immune function of mMnSOD is still unclear. To this end, we cloned the mMnSOD of M. rosenbergii (MrmMnSOD), prepared its polyclonal antibodies, and analyzed its expression patterns under Aeromonas hydrophila infection. On the gene expression levels, MrmMnSOD reached a peak after 3- and 6-h infection in hepatopancreas and intestine tissue, respectively. Tissue immunofluorescence analysis showed that the maximum fluorescence intensity occurred at 12 h after infections in both hepatopancreas and intestine tissue. The above results indicated that MrmMnSOD is involved in the immune response against A. hydrophila. Further antibacterial assays showed that MrmMnSOD significantly inhibited the growth of Escherichia coli, A. hydrophila, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, and Streptococcus agalactiae, suggesting that MrmMnSOD may belong to an immune-related molecule, which exerts immune function by antibacterial effect. These results enrich the basic theory in crustacean innate immunity, and provide a new target for disease control and drug research for M. rosenbergii breeding in the future.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; SOD; expression pattern; antibacterial assay

Cite this article

LI Yanan , LU Linqing , ZHANG Peng , QIN Zhendong , LIN Li , YAN Lei . Molecular cloning and functional study of mitochondrial manganese superoxide dismutase in Macrobrachium rosenbergii[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2022 , 41(3) : 111 -118 . DOI: 10.11978/2021109

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)原产于东南亚淡水和咸淡水水域, 现今已在巴西、孟加拉国、厄瓜多尔、马来西亚、印度等许多国家都有养殖(De Almeida Marques et al, 2012)。我国最早于1976年从日本引进罗氏沼虾, 1977年实现繁育成功。由于罗氏沼虾养殖周期短、生长速度快、适应性强, 深受养殖户喜爱, 目前已在江苏、福建、上海、广东、广西等20多个省进行推广养殖(肖楚康 等, 2019), 是我国重要的经济虾类之一(Miao et al, 2020)。然而, 随着罗氏沼虾高密度养殖的迅猛发展, 由病毒和细菌引起的各种疾病给该养殖行业带来了巨大的经济损失 (Khuntia et al, 2008; Lin et al, 2010; 董学洪 等, 2015)。据报道, 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害罗氏沼虾养殖业的主要病原之一(Onming et al, 2018)。因此, 进一步了解罗氏沼虾的免疫机制对于指导其疾病防控至关重要。
罗氏沼虾属于无脊椎动物, 主要依靠先天免疫系统来抵御病原入侵, 包括免疫识别、体液免疫、免疫稳态维持和信号传导几个方面(Li et al, 2013a, b)。当病原入侵机体时, 宿主可产生大量具有杀菌作用的活性氧分子(reactive oxygen species, ROS), 如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(OH-)等(Bogdan et al, 2000), 但是过多的ROS积累会对机体造成氧化应激, 进而损害生物大分子, 破坏机体内稳态, 加快疾病病程(Li et al, 2020)。生物体通过抗氧化系统调节体内氧化还原稳态, 因此, 抗氧化系统也被认为是先天性免疫非常重要的组成部分(Li et al, 2018; 李亚男 等, 2018)。抗氧化系统主要由抗氧化酶系统以及一些非酶类小分子组成, 如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽、维生素E等(Li et al, 2018)。其中, SOD因其对O2-的快速特异性解毒效应而备受关注(Noor et al, 2002; Muth et al, 2004; Li et al, 2019)。依据其金属配体的不同, SOD又分为CuZnSOD、MnSOD和FeSOD三种主要类型(Li et al, 2019)。其中, MnSOD主要定位于胞质和线粒体中。
有研究表明, 线粒体呼吸链是产生ROS的主要场所之一(Mazat et al, 2020), 因此线粒体MnSOD(mMnSOD)被认为是机体抵御氧化应激的第一道防线, 作用至关重要。但是目前关于甲壳动物mMnSOD的研究还处于初级阶段, 除了认识到mMnSOD可通过调节机体氧化还原稳态参与非特异免疫外, 对该蛋白其他免疫功能的认识还非常有限。虽已有学者从罗氏沼虾中成功克隆了mMnSOD基因(MrmMnSOD), 但并未对蛋白功能开展深入研究(Cheng et al, 2006)。近年来有学者发现, 魁蚶(Scapharca broughtonii)MnSOD具有一定的抑菌功能(Zheng et al, 2015)。因此, 本研究克隆了MrmMnSOD, 制备了多克隆抗体, 首次分析了嗜水气单胞菌刺激下, 该基因在不同组织中的表达模式, 并对该蛋白的抑菌功能进行初步探究, 研究结果不仅丰富了甲壳动物先天性免疫基础理论, 也将为罗氏沼虾养殖与病害防控提供依据。

1 材料方法

1.1 实验材料与采样

实验所用罗氏沼虾购自广州市金洋水产公司, 体长10±2cm, 暂养于28℃充气循环水中适应一周后开始实验。实验所用嗜水气单胞菌于37℃无抗LB培养基中过夜培养活化, 使用无菌PBS清洗菌体三次后, 使用无菌PBS重悬菌液浓度至1×106 CFU·mL-1 (Srisapoome et al, 2018)。将暂养的罗氏沼虾随机分为实验组和对照组, 每尾虾分别腹肌注射100 mL 1×106CFU·mL-1嗜水气单胞菌或等量无菌PBS, 注射后0、3、6、12和24h, 采集肝胰腺和肠组织进行总RNA提取和基因表达模式分析。每个时间点取3只虾进行混样, 平均取3次。

1.2 总RNA提取与基因克隆

使用Trizol法提取总RNA, 使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, 使用超微量分光光度计NP80(德国, IMPLEN)检测RNA的纯度。根据GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit(北京擎科生物有限公司)操作说明, 逆转录合成cDNA。根据GenBank中罗氏沼虾mMnSOD开放阅读框序列(ABU55004.1), 设计PET-32a载体一步克隆引物MrmMnSOD-32a S和MrmMnSOD-32a A(表1), 以cDNA为扩增模板, 扩增罗氏沼虾MrmMnSOD基因序列。
表1 引物序列

Tab. 1 Primers used in the study

引物 序列 (5′—3′) 用途
MrmMnSOD S1 CCCTGAAGTTCAATGGAGGAGGT qRT-PCR
MrmMnSOD A1 TTGGGACAAGTAGCAATTTGTAGTG
Mr18S F TAGCAATTCGCCGTCGTTATTC qRT-PCR内参
Mr18S R CTACCCCCGGAACTCAAAGACT
MrmMnSOD-32a S TATTTTCAGGGATCCGAATTCATGCTCAGTTTCAGCCGTCTG
MrmMnSOD-32a A GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCACTTTGCAGCAGCAAATCTT 载体构建

1.3 重组蛋白表达与纯化

参照ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)使用说明, 将一步克隆引物扩增得到的罗氏沼虾mMnSOD基因序列与相应双酶切(EcoRⅠ和Xhol)线性化的PET-32a载体进行同源重组反应。反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 进行阳性克隆子筛选。阳性克隆子测序检验正确后, 提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株进行重组蛋白表达。使用0.5mmol·L-1 IPTG在180r·min-1、37℃下震荡培养5~6h, 以7000r·min-1离心5min, 收集菌体, 使用PBS清洗菌体三次并重悬, 低温下超声波破碎菌体, 12% SDS-PAGE胶检测融合蛋白的表达情况。之后, 根据福因德生物《蛋白表达与抗体制备》技术手册对包涵体进行纯化与复性回收。首先使用PBS在4℃下, 8000r·min-1, 10min洗涤菌体4~5次。然后分别用20mL buffer A(50mmol·L-1Tris-HCI, 25mmol·L-1 EDTA-2Na, pH=8.0)、20mL buffer B(50mmol·L-1 Tris-HCI, 5mmol·L-1 EDTA-2Na、2mol·L-1脲, pH为8.0)溶解杂质, 于4℃, 8000r·min-1下离心10min, 去上清。最后使用10mL buffer c(0.1mol·L-1 Tris-HCI, 10mmol·L-1 MDTT, 8mol·L-1脲, pH为8.0)溶解蛋白质, 4℃ 10000r·min-1离心10min保留上清, 去沉淀。将前述上清装入透析袋中, 置于50倍体积透析液(0.1mol·L-1 Tris-HCl, 5mmol·L-1 EDTA-2Na, 5mmol·L-1 Cysteins, pH为8.0)中, 4℃下透析16h以上, 之后再使用PBS于4℃下透析16h以上, 最终得到纯化复性后的重组蛋白。

1.4 抗体制备与检测

用上海碧云天公司Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化回收的重组蛋白浓度, 达到送样要求后送至武汉福因德公司免疫新西兰大白兔, 制备兔源性MrmMnSOD多克隆抗体血清。抗体制备完成后, 采用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测抗体效价, 具体操作如下: 用50mmol·L-1的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原, 使抗原浓度为10~20μg·mL-1, 每孔加100μL到96孔酶标板, 4℃过夜。第二天弃去包被液后, 用PBST洗涤3次, 每孔加入150μL 1% BSA 37℃封闭1h。PBST洗涤后, 每孔加入不同浓度的血清和对照样品, 37℃孵育2h。然后洗去血清 一抗加入HRP标记的二抗, 37℃孵育1h。最后清洗二抗加入显色剂显色20min后, 酶标仪上读取A405吸收值。

1.5 mRNA水平表达模式分析

cDNA经4倍稀