近年来马氏珠母贝的大规模死亡问题已经引起了广泛重视, 目前普遍认为其死亡的原因是种质退化、环境污染、病原滋生及人工养殖缺乏管理等因素导致其抗逆能力下降所造成的。在养殖生产中, 经常发现一些大型个体的马氏珠母贝的死亡率高于小型个体。针对养殖过程中所出现的问题, 有必要对异速生长个体的抗逆、抗病能力进行比较研究, 为抗病选育和生长选育提供理论指导。Shi等(2014)通过对马氏珠母贝壳长性状极端值个体的转录组学分析, 发现差异基因主要富集在免疫相关的通路, 表明免疫系统与马氏珠母贝的生长速度之间存在着较大的联系, 因此本试验选取免疫器官作为研究对象。

LAMP1主要分布于溶酶体膜和内吞体膜, 是溶酶体膜蛋白的主要组成部分, 可用于检测自噬溶酶体的形成(Winchester, 2001; Solhaug et al, 2020)。CuZn-SOD是机体最重要的抗氧化因子之一, 具有清除有害的氧自由基、维持细胞膜结构的完整和稳定、抵御病原菌的侵害和增强抗病性的作用(Kogawa et al, 1999; Bastian et al, 2003; Bao et al, 2009; Yu et al, 2011)。JRL是凝集素超家族的成员之一, 是贝类抵御外界胁迫的重要免疫因子之一。Rab7作为吞噬作用的关键调控因子, 在抵御病原菌入侵宿主的过程中发挥重要作用, 是调控吞噬体成熟的关键因子。

试验中首先通过qRT-PCR检测了5种免疫基因(LAMP1、CuZn-SOD1、CuZn-SOD2、Rab7和JRL)在LPS和Poly(I:C)刺激后的mRNA相对表达量表达时序变化情况, 比较了极大、小个体之间的5种免疫基因表达模式的差异。免疫刺激后, LAMP1、CuZn-SOD1、CuZn-SOD2、Rab1和JRL基因在不同时段均有显著上调或下调表达, 说明所检测的基因对免疫刺激均有应答。其中, 极小个体的LAMP1、Cu-SOD1和Cu-SOD2基因相对表达量的变化幅度均高于极大个体, JRL和Rab7基因相对表达量的变化幅度低于极大个体, 其中极小个体JRL基因的基础表达量远高于极大个体, 可能导致其变化幅度较小。对比极小个体, 极大个体的Rab7基因对刺激的响应较为敏感。研究表明, Rab7基因不仅与免疫防御有关, 在调节胆固醇水平和甲状腺激素分泌的过程中也发挥重要作用(Bruckert et al, 2000; Croizet-Berger et al, 2002), 我们推测Rab7基因在马氏珠母贝各阶段的发育过程中所行使的功能可能不同, 在调控生长发育方面也发挥一定作用。目前, 有关Rab7基因在贝中的报道较少, 具体的功能机制还有待进一步研究。

通过测定AKP、SOD和CAT 3种主要抗逆酶活在免疫刺激后的变化情况, 进一步分析了极大、极小个体的抗逆能力的差异。AKP是贝类溶酶体酶的重要组成部分, 是机体主要的水解酶类之一, 在清除体外异物方面发挥了不可替代的作用(牟海津 等, 1999)。LPS刺激后, 极大、极小个体的AKP酶活的变化均呈现先降低后升高的趋势, 表现出一定的滞后性, 这可能与LPS会导致AKP的活力受到抑制导致免疫反应延后有关。Poly(I:C)刺激后, 极小个体AKP对胁迫的响应相对滞后。但是, LPS和Poly(I:C)刺激后, 极小个体AKP酶活的最大变化幅度均高于极大个体, 说明极小个体的体液免疫系统对异物的清除能力要强于极大个体。SOD和CAT是贝类的两种重要的抗氧化酶, 具有协同分解过氧化氢, 防止氧代谢产物对机体的损伤的作用, 是测定机体抗逆性的重要指标(刘婷婷 等, 2019; 张志东 等, 2019)。LPS刺激后, 极小个体CAT的活力首先爆发式增加,随后呈现出下降-上升-下降的波动变化特点。而在极大个体中, CAT活力则是先显著升高, 随后迅速持续性下降, 在较长的一段时间内难以恢复到正常水平。同时, 极小个体CAT活力在刺激后的变化幅度要高于极大个体。Poly(I:C)刺激后, 极小个体CAT对于胁迫的响应相对滞后, 但其活力的变化则呈现爆发式增长, 最大变化幅度大约是极大个体的3倍。然而, 在同等条件下, 极大个体SOD的变化幅度高于极小个体, 说明极大个体SOD的活力较强。

总体来说, 从免疫基因相对表达量和免疫酶活力的变化幅度两项指标分析, 极大、极小个体的相关免疫基因和免疫酶均能响应LPS和Poly(I:C)刺激, 而极小个体受到刺激后的变化幅度要远远高于极大个体, 对外界胁迫的反应更加强烈, 说明极小个体相对于极大个体具有更强的抗逆抗病能力。

动物在受到外界病原体刺激时, 会激活机体的免疫系统, 克服外界胁迫对机体造成的负面影响, 维持机体的内稳态。免疫系统激活时, 通过释放细胞因子作用于内分泌系统, 进而影响机体代谢和养分的重分配(Klasing et al, 2007)。在脊椎动物中, 当受到外界刺激时, 会激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)和交感神经系统, 促进其分泌糖皮质激素(glucocorticoids, GC)和儿茶酚胺(catecholamine, CA), 从而调节代谢活动的变化(Koolhaas et al, 1999; Dorshkind et al, 2001; Dunn et al, 2004)。GC和CA分泌的增加, 会引起机体分解代谢增加和合成代谢减少, 促进蛋白质和脂肪的降解、肝糖原分解以及应激蛋白合成, 从而改变动物的代谢和对营养物质的利用及需要, 将用于生长和骨骼肌蛋白质沉积的能量和营养分配于激活的免疫系统以抵御外界胁迫(Bonga, 1997)。贝类属于无脊椎动物, 结构相对简单, 主要通过促肾上腺皮质释放激素-促肾上腺皮质激素-生物胺轴(Ottaviani et al, 1997)神经内分泌轴而发挥作用, 但其对胁迫的反应过程与脊椎动物类似。在生产实践中, 人们观察到动物的生产性能在肮脏和洁净环境的饲养条件下存在较大差异。Dudley-Cash (1994)研究发现, 在清洁的环境中鸡的生长过程较为持续稳定, 而当处于肮脏的环境中时, 则会在多个时期出现生长下降的现象, 最终导致两种环境下肉鸡的生长出现显著性的差异。这是由于肮脏环境中存在大量的病原生物或大分子抗原, 这些病原因子会激活机体的免疫系统, 从而降低了组织生长需要或维持需要的比例, 将更多营养能量用于免疫防御中。C-重复基序结合因子(C-repeat binding factor, CBF)是植物中一种重要的抗逆因子, 在低温等非生物胁迫条件下, 通过结合在植物钙网织/脱水应答元件(calreticulin / dehydration responsive element, CRT/DRE)上激活冷诱导基因(cold-regulated gene, COR)的表达, 提高植物抗逆能力(Doherty et al, 2009; Kim et al, 2013)。CBF的表达水平的提高虽然可以增强植物的抗逆能力, 但会导致植物出现生长迟缓, 开花延迟以及产量降低的现象(Gilmour, 2000; Achard et al, 2008)。因此, 机体对免疫系统营养和能量的投入是以其负面生理影响为代价。综上所述, 从能量分配的角度, 我们推测马氏珠母贝小型个体对胁迫所产生的应激反应消耗了较多的能量, 从而影响了生长发育。下一步工作需从能量代谢方面去研究异速生长个体对免疫刺激或环境因子胁迫的响应差异。