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Journal of Tropical Oceanography >

2022 , Vol. 41 >Issue 5: 170 - 179

DOI: https://doi.org/10.11978/2021185

Marine Biology

Ovarian development, histology of oogenesis and yolk formation of Tapes conspersus from the Beihai Yingpan, Guangxi

  • LIAN Changpeng ,
  • WU Tao ,
  • WANG Chaoqi ,
  • YANG Ling ,
  • PAN Ying
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  • College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Key Laboratory of Aquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation of Guangxi Universites, Nanning 530004, China
PAN Ying. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2021-12-29

  Revised date: 2022-02-16

  Online published: 2022-02-18

Supported by

Guangxi Innovation Driven Development Project(AA19254032)

National Basic Research and Development Program of China(2018YFD0901400)

Fold

Abstract

The ovary development, oogenesis histology and ultrastructure of vitellogenesis of Tapes conspersus from the Beihai Yingpan, Guangxi were studied using tissue sectioning and transmission electron microscopy based on the samples taken from November 2020 to October 2021. The results showed that the ovary development of T. conspersus had a one-year cycle, consisting of the proliferating stage (from the end of June to July), the growth stage (from mid-July to mid-October), the maturing stage (from November to the end of February of the following year), and the spawning stage (from March to April) and the resting stage (from May to June). Ovary development is strongly affected by water temperature and seasons. Gonadal development among individuals is not completely synchronized. Gonads begin to develop in the proliferating stage each year, and a large number of mature eggs are discharged at the spawning stage. According to the characteristics of the oocyte cell development of T. conspersus, it can be divided into four stages: oogonium, primary oocyte, secondary oocytes and mature oocyte. Based on the observation of the occurrence of vitellogenesis of T. conspersus by transmission electron microscope, it can be divided into three periods: early period of vitellogenesis, period of vitellogenesis, and late period of vitellogenesis. The results of this study provide basic data for the reproduction biology and artificial breeding of the T. conspersus.

Key words： Tapes conspersus; ovary development; oogenesis histology; ultrastructure; tissue section observation

Cite this article

LIAN Changpeng , WU Tao , WANG Chaoqi , YANG Ling , PAN Ying . Ovarian development, histology of oogenesis and yolk formation of Tapes conspersus from the Beihai Yingpan, Guangxi[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2022 , 41(5) : 170 -179 . DOI: 10.11978/2021185

钝缀锦蛤(Tapes conspersus)隶属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veneridae)、缀锦蛤属(Tapes), 俗称沙包, 是一种大型热带、亚热带海洋经济贝类, 主要分布于西南太平洋(庄启谦, 2001)。中国主要分布在广东、广西、海南沿海等地, 喜砂质底, 为埋栖型贝类。由于钝缀锦蛤生长速度快、味道鲜美、营养价值高、个体大等优点, 潜在的消费和养殖市场十分广阔。然而, 钝缀锦蛤人工养殖规模较小, 自然资源短缺, 影响了其产业发展。目前, 国内对钝缀锦蛤的研究主要集中在群体选育(聂振平 等, 2020)、形态性状(巫旗生 等, 2018)、滤食率(杨家林 等, 2019)等方面; 国外相关研究主要在养殖方式(Paterson et al, 1997)、多倍性研究(Nell et al, 1995)等。有关钝缀锦蛤生殖发育方面的研究报道仅见于繁殖周期和胚胎发育(巫旗生 等, 2017)。
在双壳贝类繁殖生物学中, 贝类性腺发育的研究一直是国内外学者密切关注的重点领域。了解贝类卵巢及卵子的特征, 对于研究贝类的繁殖规律、资源调查、人工育苗等具有重要意义。国内外学者对贝类卵子发生及卵巢的组织学观察、细胞学、超微结构等做了大量研究(曹伏君 等, 2010; 顾海龙 等, 2013; 区小玲 等, 2015; 吴明灿 等, 2015; Konuma et al, 2021; Qin et al, 2021)。对于贝类卵子发生及卵巢发育分期的划定通常根据生殖细胞的发育情况、卵径的大小以及滤泡中不同发育时期生殖细胞所占的比例等, 从而掌握双壳贝类性腺发育规律、生殖周期以及繁殖季节(宁军号 等, 2015)。迄今为止, 国内外对于钝缀锦蛤卵母细胞不同时期的超微结构、卵细胞发育、卵黄发生过程的变化尚无相关报道。本研究采用组织切片和透射电镜技术对广西北海营盘沿海钝缀锦蛤卵巢发育、卵子发生和卵黄的发生进行观察和研究, 以期阐明卵巢的发育及卵子、卵黄发生过程, 旨在为深入研究钝缀锦蛤繁殖生物学提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样本来源于广西北海营盘海域, 栖息水深5~ 20m, 砂质底生活。2020年11月—2021年10月, 采用2~3龄的钝缀锦蛤每月取样1次, 每次挑选大小一致、活力较好、壳形正常、无损伤的20个个体。在12个月的采样过程中, 共采集到138个雌性钝缀锦蛤, 102个雄性钝缀锦蛤。壳长范围为59.85~ 92.15mm, 均值为73.36mm; 壳宽范围24.65~ 43.86mm, 均值为32.01mm; 壳高范围30.95~ 62.70mm, 均值为49.45mm; 全湿重范围37.10~169.14g, 均值为76.51g。同龄雌性个体和雄性个体外表、大小几乎一致, 无明显区别。

1.2 方法

1.2.1 数据测量

钝缀锦蛤的壳长、壳宽、壳高采用数显游标卡尺(精度为0.02mm), 采用精度为0.01g的电子天平称量钝缀锦蛤的全湿重。

1.2.2 组织切片的制作及观察

对每个月采集的样品进行测量, 测量结束后进行解剖及显微镜下观察并分辨雌、雄, 用剪刀和镊子剪取1~2g的雌性性腺组织块, 采用Bouin’s液进行常温固定24~36h, 送往广西医科大学医学实验中心进行制样。制样步骤为首先用70%的酒精替换波恩氏液保存组织块, 然后分别用70%、80%、95%和100%的酒精依次脱水2次, 脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液(v:v=1:1) 30min, 再移入二甲苯中15~20min, 采用石蜡进行包埋。组织切片的厚度约为6µm, 37℃下进行烤片, 苏木精-伊红染色, 中性树脂封片。采用尼康显微镜(Nikon Eclipse E100, 尼康公司)进行组织切片的观察及拍照。

1.2.3 透射电镜的制样及观察

从每个月获得的样品中随机取2个雌性个体, 用剪刀剪取卵巢组织1~2g, 立即放入装有2.5%戊二醛的电镜固定液中, 室温固定2h, 转移至4℃保存过夜, 将过夜的样品切成1mm3的小块, 再将切割好的组织块转移至装有新的2.5%戊二醛离心管内继续固定, 4℃固定保存, 送至武汉赛维尔生物科技有限公司制样及电镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 钝缀锦蛤卵巢发育分期

根据组织切片观察的结果, 依据滤泡中不同发育时期的卵细胞占比及滤泡、结缔组织等相关特点, 将钝缀锦蛤的卵巢发育划分为5个主要时期: 增殖期(Ⅰ期)、生长期(Ⅱ期)、成熟期(Ⅲ期)、排放期(Ⅳ期)、休止期(Ⅴ期), 每个时期的特征如图1所示。
图1 钝缀锦蛤卵巢不同发育时期的组织切片

a. 增殖期; b. 生长期; c. 成熟期; d. 排放期; e. 休止期

Fig. 1 Histological section of different gonadal development stages in Tapes conpersus. (a) Proliferating stage; (b) Growing stage; (c) Maturing stage; (d) Spawning stage; (e) Resting stage

2.1.1 增殖期(Ⅰ期)

增殖期滤泡中以卵原细胞为主(图1a)。此时期从性腺颜色上难以区分雌雄, 性腺主要由滤泡构成, 生殖上皮和结缔组织构成了滤泡壁; 每年7月中旬开始, 滤泡的生殖管分支末端呈树枝状分布, 末端由小变大, 由少到多。此期滤泡无规则的形状, 周围包裹着结缔组织, 滤泡腔的大小不一致, 腔内有少量卵母细胞。卵原细胞的来源主要是滤泡壁上的生殖上皮, 通过不断发育分化进一步成为初级卵母细胞。

2.1.2 生长期(Ⅱ期)

生长期滤泡中以卵母细胞为主(图1b)。从性腺的颜色上难以区分雌雄, 随着时间的推移至9月中旬, 生殖腺的滤泡逐渐增多, 滤泡壁上增殖了大量的卵原细胞, 成熟的卵原细胞会逐渐从滤泡壁上慢慢脱落, 落入到滤泡腔中, 大多数卵母细胞呈梨形或椭圆形。

2.1.3 成熟期(Ⅲ期)

成熟期滤泡中以卵母细胞为主(图1c)。从性腺颜色上可以区分雌雄, 卵巢颜色为乳白色, 卵子成熟遇水即散开, 可以清晰地观察到卵子成熟的形态、核仁等。滤泡间没有比较大的空隙, 滤泡此时期也达到最大, 滤泡内有大量成熟的卵细胞, 有少部分带有卵柄的卵原细胞和卵母细胞依旧附在滤泡壁上, 成熟时会进一步脱落到滤泡腔中。随着时间的推移至11月底, 生殖腺体积持续膨胀, 并逐步延伸到足部、外套膜及内脏团表面。

2.1.4 排放期(Ⅳ期)

排放期滤泡中以成熟的卵母细胞为主(图1d)。生殖腺布满整个软体部, 有些滤泡腔中已经排放完卵子, 破裂后呈不规格的形态。滤泡腔中可以看到部分成熟的卵子及卵原细胞未排放, 后期逐步退化。卵子在合适的时机排放后会在滤泡腔中形成大量大小不一的空腔, 滤泡开始慢慢萎缩, 结缔组织开始快速增殖发育, 导致滤泡被覆盖。

2.1.5 休止期(Ⅴ期)

休止期滤泡腔已经萎缩, 软体部透明消瘦, 难以区分雌雄, 雌雄性腺颜色也没有区别。滤泡之间的空隙逐步增大, 难以观察到卵子, 可观察到大量的结缔组织, 形状不规则。钝缀锦蛤性腺发育由增殖期开始, 至最后的休止期结束。

2.2 钝缀锦蛤卵巢发育各期的周年分布规律

由表1可知, 在广西北海营盘海域钝缀锦蛤12个月采集得到的240个样品中, 雌性个体为138只, 占总数的57.5%, 雌雄比例为1.35:1。雌性钝缀锦蛤生长群体增殖期主要出现在每年6月底—7月初, 水温为22.97~30.5℃; 7月中旬—10月中旬为主要生长期, 水温范围为25.5~29.8℃; 11月—翌年2月底为成熟期, 水温范围为15.6~22.0℃; 每年3月—4月底为排放期, 水温范围为21.0~27.5℃; 每年5月—6月为休止期, 水温范围为29.5~30.5℃。本研究表明, 广西北海营盘海域钝缀锦蛤繁殖盛期为每年3月份前后, 与水温的变化密切相关。
表1 广西北海营盘海域钝缀锦蛤卵巢发育各期的周年分布

Tab. 1 Annual distribution of ovarian development stages of Tapes conspersus in the Beihai Yingpan, Guangxi

取样日期 雌性发育分期的个体数(占比) 雌性总数/只 盐度‰ 水温/℃
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
2020-11-29 4 (28.6%) 10 (71.4%) 14 27.4 22.0
2020-12-21 5 (26.3%) 14 (73.7%) 19 27.5 17.2
2021-01-08 2 (16.7%) 10 (83.3%) 12 29.4 15.6
2021-02-24 1 (7.1%) 13 (92.9%) 14 30.9 17.3
2021-03-18 6 (100%) 6 30.0 21.0
2021-04-22 9 (100%) 9 30.0 27.5
2021-05-20 2 (25%) 6 (75%) 8 28.0 29.5
2021-06-23 1 (12.5%) 7 (87.5%) 8 28.4 30.5
2021-07-15 4 (25%) 12 (75%) 16 29.0 29.7
2021-08-18 6 (75%) 2 (25%) 8 30.0 29.8
2021-09-17 1 (7.1%) 12 (85.8%) 1 (7.1%) 14 31.0 29.8
2021-10-20 7 (70%) 3 (30%) 10 29.0 25.5

2.3 钝缀锦蛤各期雌性生殖细胞特征

根据钝缀锦蛤雌性生殖细胞的形态、结构、大小、发育程度及分布特点, 将钝缀锦蛤雌性生殖细胞的发生划分4个阶段: 第一阶段为卵原细胞期, 第二阶段为初级卵母细胞期, 第三阶段为次级卵母细胞期, 第四阶段为成熟卵母细胞期。钝缀锦蛤各时期雌性生殖细胞发育的特征见图2和表2。
图2 雌性钝缀锦蛤各期生殖细胞组织切片

a. 卵原细胞期, 示卵原细胞(Og); b. 初级卵母细胞期, 示初级卵母细胞(Po)、滤泡(F); c. 次级卵母细胞期, 示次级卵母细胞(So)、核仁(Nu); d. 成熟卵母细胞期, 示成熟卵母细胞(Ov)、嗜酸性颗粒(A)

Fig. 2 Germ cell tissue sections of female Tapes conspersus at each stage. (a) oogonium period, shows oogonium (Og); (b) primary oocyte period, shows primary oocyte (Po), Follicle (F); (c) secondary oocyte period, shows Secondary oocyte (So), Nucleolus (Nu); (d) mature oocyte, shows Ovum (Ov), Acidophilic granule (A)

表2 钝缀锦蛤各期雌性生殖细胞特征

Tab. 2 The female reproductive cell of Tapes conspersus

分期 细胞特点 出现时期及位置 细胞核特点
卵原细胞期 呈圆形, 细胞直径约为4.34~6.71µm, 细胞体积小, 在滤泡中排列疏松 除休止期外, 其他期均可见, 增殖期和生长期数量最多, 常常附在滤泡壁的基膜上 细胞整体染色较深, 可以观察到清晰的细胞核, 核仁在这一时期不明显, 细胞核的位置常位于中央
初级卵母细胞期 常被周围的结缔组织包裹着, 细胞形状多呈圆形, 直径约为9.47~ 10.22µm, 细胞体积较前期的卵原细胞大 增殖期及生长期数量最多, 常附于滤泡壁的基膜上 可见聚集成团的核仁, 染色质数量少且不清晰, 在细胞中呈絮状。细胞核染色较细胞质浅
次级卵母细胞期 可以清晰观察到此期的卵母细胞卵柄依旧存在, 形状未呈圆形, 常呈梨形, 细胞直径约为18.02~20.73µm 生长期、成熟期、排放期可见大量此期细胞, 由初级卵母细胞发育成熟而得, 附着于基膜 核膜清晰, 染色质逐渐清晰, 数量增多, 互相缠绕, 核仁染色最深, 其次是细胞质, 核仁位于细胞核一侧
成熟卵母细胞期 成熟的卵母细胞呈圆形, 未成熟的呈梨形或者椭圆形等, 细胞直径约为39.57~62.71µm, 经过不断发育, 卵母细胞内的细胞质中充满了大小不一的卵黄颗粒, 此时的卵母细胞的体积达到了最大, 处于成熟待排放阶段 滤泡腔中存在大量圆形或者椭圆形、梨形的卵母细胞, 此时卵柄已经脱落。在成熟期、排放期以成熟的卵母细胞为主, 因为大量成熟的卵母细胞挤压在狭小的滤泡腔中, 导致部分卵母细胞变形 细胞核体积达到最大直径为23.49~ 25.87µm, 核仁直径约为4.49~ 5.74µm。常有1~2个核仁分布在细胞核中, 细胞整体染色较深

2.4 卵母细胞卵黄粒发育的超微结构特征

根据对钝缀锦蛤雌性生殖腺透射电镜的观察结果, 卵母细胞细胞质中的线粒体、高尔基体、粗面内质网、溶酶体、囊泡等细胞器都可能直接或间接影响了卵黄粒的发生与卵的发育, 部分细胞器后期退化形成了卵黄颗粒。

2.4.1 线粒体

细胞中的能量供应主要来自线粒体, 部分线粒体直接参与了卵黄的发生, 线粒体初期内部脊减少, 开始呈现空泡化, 随着高电子密度的卵黄物质沉淀在线粒体内部, 逐渐充满整个线粒体, 最终形成卵黄颗粒。线粒体初期未完全转化为卵黄之前依旧保持着双层膜的结构特征, 后期才逐渐消失, 如图3o所示。
图3 卵母细胞发育的超微结构观察

a. 卵黄合成前期卵母细胞, 示细胞核(N)、染色质(CH)、核膜(NM), ×300; b. 卵黄合成前期, 示线粒体(M)、卵黄(Y), ×8000; c. 卵黄合成前期, 示粗面内质网(RER)、线粒体(M)、卵黄(Y), ×8000; d. 卵黄合成前期, 示卵黄(Y)、线粒体(M), ×8000; e. 卵黄合成期卵母细胞, 示细胞膜(EM), ×300; f. 卵黄合成期, 示粗面内质网包绕脂滴形成卵黄粒, 脂滴(L)、卵黄(Y)、粗面内质网(RER), ×2500; g. 卵黄合成期, 示线粒体形成的卵黄粒(MY), 粗面内质网(RER)、脂滴(L)、卵黄(Y)、线粒体(M), ×5000; h. 卵黄合成期, 示片层状粗面内质网两端膨化, 卵黄(Y)、粗面内质网(RER)、粗面内质网囊泡(RV), ×2000; i. 卵黄合成期, 示高尔基复合体液泡形成卵黄粒, 高尔基复合体(GO)、线粒体(M)、脂滴(L)、卵黄(Y), ×2000; j. 卵黄合成期, 示溶酶体(LY)、卵黄(Y)、线粒体(M), ×5000; k. 卵黄合成期, 示核糖体(R)、卵黄(Y), ×5000; l. 卵黄合成期, 示吞饮泡(PV)、微绒毛(MV)、溶酶体(LY)、脂滴(L)、卵黄(Y), ×2000; m. 卵黄合成后期卵母细胞, 示细胞核(N)、核膜(NM)、核仁(NU), ×500; n. 卵黄合成后期, 示线粒体(M)、卵黄(Y), ×2000; o. 卵黄合成后期, 示粗面内质网空泡化, 粗面内质网(RER)、线粒体(M)、脂滴(L), ×5000; p. 卵黄合成后期, 示多泡小体(MVB)、卵黄(Y), ×5000

Fig. 3 Ultrastructure observation of oocyte development. (a) The early period of vitellogenesis oocyte, showing nucleus (N), chromatin (CH), nuclear membrane (NM), ×300; (b) At previtollogenic stage, showing mitochondria (M) and yolk granules (Y), ×8000; (c) At previtollogenic stage, showing rough endoplasmic reticulum (RER), mitochondria (M) and yolk granules (Y), ×8000; (d) At previtollogenic stage, shows yolk granules (Y) and mitochondria (M), ×8000; (e) The period of vitellogenesis oocyte showing cell membrane (EM), ×300; (f) At vitellogenic stage, showing Rough endoplasmic reticulum surrounds lipid droplets to form yolk granules, lipid droplet (L), yolk granules (Y) and rough endoplasmic reticulum (RER), ×2500; (g) At vitellogenic stage, yolk granule formed by mitochondria (MY), rough endoplasmic reticulum (RER), lipid droplet (L), yolk granules (Y) and mitochondria (M), ×5000; (h) At vitellogenic stage, showing that the two ends of the lamellar rough endoplasmic reticulum are expanded, yolk granules (Y), rough endoplasmic reticulum (RER) and rough endoplasmic reticulum vesicles (RV), ×2000; (i) At vitellogenic stage showing golgi complex vacuoles form yolk granules, golgi complex (GO), mitochondria (M), lipid droplet (L) and yolk granules (Y), ×2000; (j) At vitellogenic stage showing lysosome (LY), yolk granules (Y) and mitochondria (M), ×5000; (k) At vitellogenic stage, showing ribosome (R) and yolk granules (Y), ×5000; (l) At vitellogenic stage, showing pinocytosis vesicles (PV), microvilli (MV), lysosome (LY), lipid droplet (L), and yolk granules (Y), ×2000; (m) The late period of vitellogenesis oocyte, shows nucleus (N), nuclear membrane (NM) and nucleolus (NU), ×500; (n) At postvitellogenic stage, shows mitochondria (M) and yolk granules (Y), ×2000; (o) At postvitellogenic stage, showing cavitation of rough endoplasmic reticulum, rough endoplasmic reticulum (RER), mitochondria (M) and lipid droplet (L), ×5000; (p) At postvitellogenic stage, showing multivesicular bodies (MVB), yolk granules (Y), ×5000

2.4.2 高尔基体复合体

扁平囊位于高尔基体末端, 在卵母细胞发育后期是合成卵黄颗粒的重要场所。扁平囊通过不断发育, 形成小囊泡, 小囊泡内部逐渐沉淀, 逐渐演化为卵黄颗粒, 卵黄颗粒会进行一些融合作用形成更大的囊泡。囊泡会直接或间接通过内质网、溶酶体等胞器活动形成卵黄颗粒, 高尔基体后期会逐渐退化消失, 如图3i所示。

2.4.3 粗面内质网

钝缀锦蛤在卵黄合成盛期, 粗面内质网数量众多, 可分为片层状和环状两种结构, 均布满丰富的核糖体。片层状内质网是合成脂滴和卵黄颗粒的重要场所, 片层状内质网中央会逐渐被分解, 并沉淀形成卵黄颗粒, 小囊泡会逐渐相互融合, 并脱离原来的内质网, 分布于细胞质中。环状内质网则会形成一个环形, 包裹着线粒体、脂滴等物质, 后期逐渐沉淀形成卵黄, 如图3f、3g、3h所示。

2.4.4 溶酶体

溶酶体在卵黄形成时大量存在细胞质中, 通过吞噬作用, 将细胞质中的核糖体、小线粒体等物质吞噬, 通过自身的分解和转化作用, 将其转化为低电或高电物质, 后期逐渐退化形成卵黄颗粒。部分细胞器被溶酶体通过分解作用分解, 后期逐渐沉淀转化为卵黄颗粒, 如图3j所示。
根据卵黄发生时细胞器的数量及卵黄粒的多少, 可将卵母细胞分为3个主要时期: 第一时期为卵黄合成前期卵母细胞, 第二时期为卵黄合成期卵母细胞, 第三时期为卵黄合成后期卵母细胞。钝缀锦蛤卵母细胞不同发育阶段的超微结构特征见图3和表3。
表3 钝缀锦蛤各期卵母细胞特征

Tab. 3 The characteristics of oocytes at different stages of Tapes conspersus

分期 细胞特点 细胞器特点 卵黄特点
卵黄合成前期
卵母细胞		 用卵柄附着在滤泡壁的基膜上, 形态不规则, 细胞体积小, 有较多的数量。核位于中央。染色质呈颗粒状分布在细胞质中 细胞质中可以观察到少量线粒体、粗面内质网等细胞器, 线粒体多呈球形或者椭圆形, 部分线粒体内的管状脊少, 有不发达的基质。粗面内质网并不发达, 周围有少量囊泡 可观察到少量且体积较小的卵黄颗粒, 此时的卵黄颗粒无膜结构, 内部有一定数量的电子。周围的细胞质中有数量众多的糖原颗粒分布
卵黄合成期
卵母细胞		 此期细胞形状不规则, 细胞质内部有大量的细胞器、脂滴等物质, 细胞膜附近积累部分卵黄 此期细胞器发达且数量众多。线粒体脊明显, 少量已经转化为卵黄粒。内质网有环状和多层片状两种形式。部分高尔基体在内部会包裹其他物质形成囊泡 卵黄颗粒在这一时期大量开始生成, 大多数呈圆球形, 部分形态不规则, 卵黄颗粒有电子密度高的, 也有电子密度低的
卵黄合成后期
卵母细胞		 细胞体积达到最大, 细胞核和核仁清晰可见。此期的卵母细胞基本处于成熟阶段, 因相互挤压, 形状不规则, 部分卵母细胞可以观察到2个核仁, 但大多是1个核仁 线粒体数量显著增加, 大量分布在细胞质中, 可见部分线粒体内部脊开始消失, 呈现空泡化, 并逐渐演化为卵黄颗粒。内质网、高尔基体等细胞器特征已经不明显, 有部分囊泡存在于细胞质中 卵母细胞内可以观察到大量形态各异的卵黄颗粒, 大多数呈球形, 此期的卵黄颗粒数量最多, 体积最大, 密集分布于细胞质中

3 讨论

3.1 广西北海营盘海域钝缀锦蛤的卵巢发育及影响因素

正确划分贝类性腺发育的分期对于掌握生殖规律及人工育苗和选育十分重要, 目前关于双壳类贝类性腺发育的分期标准常以生殖细胞的发生、发育大小及在滤泡中所占的比例、结缔组织出现的时间等为划分依据(Dridi et al, 2007; Qin et al, 2021), 常用的方法为观察光学显微镜下拍摄的性腺组织切片结果而进行分期(朱星海 等, 2019)。贝类的卵巢发育通常可以根据卵子的大小、滤泡的体积和数量、生殖细胞的发育、结缔组织等将卵巢划分为4~6个时期。刘相全等(2007)通过肉眼观察中国蛤蜊(Mactra chinensis)活体性腺, 将卵巢发育大致可分为4个时期: 增殖期、成熟期、排放期和休止期。曹伏君等(2012)根据施氏獭蛤(Lutraria sieboldii)生殖细胞本身的发育规律及不同发育阶段生殖细胞在滤泡中所占的比例, 将其卵巢发育划分增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期共5个时期。闻海波等(2020)根据性腺发育特征将淮河橄榄蛏蚌(Solenaia oleivora)卵巢分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期。鹿瑶等(2015)将薄片镜蛤(Dosinia corrugata) 卵巢发育过程分为休止期、形成期、增殖期、成熟期、排放期、耗尽期6个阶段。吕敏等(2022)将山东田横岛海域长牡蛎(Crassostrea gigas)性腺发育周期共分为6个阶段: 形成期、增殖期、成熟期、排放期、耗尽期和休止期。
钝缀锦蛤个体和群体的性腺发育时间并不完全一致, 部分个体性腺发育会比群体提前或者滞后, 与偏顶蛤(Modiolus modiolus)性腺发育相似(宁军号 等, 2015)。因此, 本文以钝缀锦蛤群体的性腺发育作为分期的主要依据。性腺分为精巢和卵巢, 本研究以卵巢为主要研究对象, 依据钝缀锦蛤滤泡中不同发育时期的卵细胞占比及滤泡、结缔组织等相关特点, 将卵巢发育划分为5个主要时期: 增殖期(Ⅰ期)、生长期(Ⅱ期)、成熟期(Ⅲ期)、排放期(Ⅳ期)、休止期(Ⅴ期), 这与巫旗生等(2017)对钝缀锦蛤性腺发育研究一致, 不同的是本研究并未观察到10—11月有雌性个体性腺处于排放期, 而是大部分处于成熟期。两者的取样方式和组织学观察方法没有差别, 因此可以排除因为取样而造成的误差, 推测未观察到排放期的原因可能与当年取样的地点、时间、环境变化、盐度、饵料丰度等有关。 另外, 海水浊度、海洋酸化也有可能对贝类繁殖有影响(Sussarellu et al, 2016; Boulais et al, 2017)。钝缀锦蛤性腺发育至成熟期并不直接排放卵子, 可能还需要水温、盐度等因素的刺激才能达到繁殖期, 与偏顶蛤繁殖期生殖细胞的排放相似(宁军号 等, 2015)。
环境因素对贝类繁殖产卵有着极其重要的影响, 比如水温、饵料等, 当水温和饵料适宜时, 对于贝类的生殖发育影响是显著的(Suja et al, 2007; Liu et al, 2010)。本研究发现, 钝缀锦蛤卵巢发育开始时间在水温较高的6月和7月, 与淮河橄榄蛏蚌(闻海波 等, 2020)相似, 这与大部分在高温季节性腺成熟的贝类不一致(邓传敏 等, 2017; 朱星海 等, 2019)。钝缀锦蛤在3月份水温上升至21.0℃时, 卵子大量排放, 推测原因可能是海水温度由低到高导致。钝缀锦蛤成熟期为11月至翌年2月底, 8月份开始有部分个体性腺出现成熟期, 可能与环境的变化有关。Drummond 等(2006)研究表明, 对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)进行短暂的升温有可能促进卵子的发生。

3.2 钝缀锦蛤卵子发生的特点

贝类卵子发育时期的划分常根据组织切片观察及电镜观察的结果划分, 大多数研究者关注的是卵子发育的大小和卵黄粒的形成与否等一些比较容易观察到的特征。顾海龙等(2013)根据透射电镜观察到的各时期卵巢样品中卵母细胞内各细胞器的变化和卵黄粒的形成与否, 将泥蚶(Tegillarca granosa)卵母细胞的发育过程分成3个时期, 分别为卵黄合成前期、卵黄合成期、卵黄合成后期。宁军号等(2015)根据偏顶蛤卵细胞的发生将其发育时期分为卵原细胞期、生长初期、生长中期、生长后期和成熟期。应雪萍(2002)根据文蛤(Meretrix meretrix)卵母细胞的体积大小、营养物质(卵黄)积累的多少及细胞器的特点, 将卵母细胞划分为卵黄合成早期、卵黄合成中期和卵黄合成后期。
本试验根据钝缀锦蛤生殖细胞的特点、发生时期及位置、细胞核特点等将雌性生殖细胞划分为卵原细胞期、初级卵母细胞期、次级卵母细胞期、成熟卵母细胞期4个时期, 与区小玲等(2015)对管角螺(Hemifusus tuba)卵细胞分期一致。本研究根据透射电镜观察钝缀锦蛤卵黄发生时细胞器的数量及卵黄粒的多少, 可将其分为3个主要时期: 第一时期为卵黄合成前期卵母细胞、第二时期为卵黄合成期卵母细胞、第三时期为卵黄合成后期卵母细胞。

3.3 卵黄的发生

贝类卵黄发生过程中, 其来源主要有两个方面, 一方面是细胞内相关细胞器等物质合成, 另一方面则是通过外源物质转化而来。饶小珍等(2001)在研究中国淡水蛏(Novaculina chinensis)卵黄粒的来源时也发现, 卵黄合成第一是可以从卵母细胞本身中合成, 第二是自卵母细胞以外的地方合成然后进入卵母细胞。相似的研究结果在其他水产经济物种中也有报道。王庆恒等(2017)在研究光裸星虫((Sipunculus nudus)卵黄的来源时表明I型卵黄粒由溶酶体演变形成, 是内源性卵黄, Ⅱ型卵黄主要属于外源性卵黄。姜永华等(2009)认为中国龙虾(Panulirus stimpsoni)卵黄的发生过程中, 囊泡状粗面内质网和线粒体是形成卵黄的主要细胞器, 丰富的游离核糖体以直接和间接方式参与形成卵黄粒, 溶酶体通过泡状和髓状2种方式形成卵黄粒, 高尔基体通过芽生形成小囊泡的方式参与卵黄粒的形成。卵质膜通过胞饮作用参与外源性卵黄的形成。卵黄的内源性和外源性的区分目前尚未有统一的判断标准, 细胞器合成卵黄的过程中必须得获取外部的物质及能量, 细胞器的合成也同样如此。
本研究表明, 钝缀锦蛤卵细胞卵黄合成过程中, 细胞器的数量、大小、结构明显有着较大的变化, 有可能直接或间接影响了卵黄粒的发生与卵子的发育。在卵黄合成的初始阶段, 细胞质内的细胞器数量由少到多, 结构和功能由简单到复杂。线粒体在卵黄合成前期、中期的内部结构典型, 部分线粒体中期嵴开始消失, 后期线粒体内部形成空泡化, 沉积物逐渐沉淀充满整个线粒体, 逐渐演变为卵黄粒。泥螺(Bullacta exarata)(应雪萍 等, 2001)、糙海参(Holothuria scabra)(吴明灿 等, 2015)卵黄的合成过程中都观察到了此类现象。
本研究结果表明, 粗面内质网有两种形成卵黄颗粒的形式, 一种通过包裹小线粒体、脂滴等物质, 后期逐渐沉淀形成卵黄; 另一种是层状内质网末端同样形成扁平膜囊, 后期逐渐脱离内质网形成小囊泡, 小囊泡相互融合形成大囊泡, 经过卵黄物质沉淀, 形成卵黄, 这与文蛤相似(应雪萍 等, 2001)。高尔基体内部包裹囊泡, 随着时间的推移逐渐演化为卵黄粒; 溶酶体通过自身的吞噬作用, 吞噬周围物质形成卵黄粒; 这些都是卵黄粒的众多来源, 满足后期卵母细胞的营养需要。值得一提的是, 线粒体与粗面内质网在钝缀锦蛤卵黄合成期间数量多, 在后期还可以观察到数量较多的囊泡和空泡化的线粒体。

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