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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 2: 45 - 53

DOI: https://doi.org/10.11978/2022101

Identification and functional study of the genomic island GIPspSM9913 in Pseudoalteromonas sp. SM9913

  • WANG Pengxia , 1, 2, 3, 4 ,
  • ZHAO Yi 5 ,
  • DU Xiaofei 1, 3 ,
  • WANG Weiquan 1, 3 ,
  • WANG Xiaoxue 1, 2, 3
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 4. Sanya Institute of Ocean Eco-Environmental Engineering, Sanya 572000, China
  • 5. College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
WANG Pengxia. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2022-05-06

  Revised date: 2022-06-29

  Online published: 2022-07-01

Supported by

Hainan Provincial Joint Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City(320LH047)

Natural Science Foundation of Guangdong Province(2019A1515011912)

Science and Technology Planning Project of Guangzhou(202002030493)

Fold

Abstract

Due to the complexity and variability of marine environments, marine bacteria may have evolved unique environmental adaptation mechanisms. Genomic islands usually carry genes related to the environmental adaptation of host bacteria and play an important role in driving bacterial adaptation and genome diversification. Pseudoalteromonas is an important genus that is widely distributed in various marine habitats, and has attracted attention due to the important industrial application and ecological restoration potential. In this study, we focused on Pseudoalteromonas sp. SM9913 isolated from marine sediments. By comparative genomics analysis of SM9913 with the closely related strain Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 isolated from surface seawater, an 18-kb genomic island GIPspSM9913 integrated in the yicC gene was identified. This genomic island encodes an integrase and an excisionase, as well as multiple restriction modification systems. Sequence analysis showed that GIPspSM9913 homologs are widely distributed in marine bacteria such as Pseudoalteromonas, Shewanella, Vibrio and Aeromonas. Quantitative PCR assays showed that GIPspSM9913 can excise when the excisionase is produced, resulting in the removal of GIPspSM9913. Sequencing analysis indicated that excision of GIPspSM9913 did not affect the expression of flanking genes. We also compared the swimming motility, electroporation efficiency and conjugation efficiency of the GIPspSM9913 deleted strain and the wild-type strain SM9913, and found that the presence of GIPspSM9913 can increase the swimming motility of the host bacteria and offer the host defense against the invasion of foreign DNA.

Key words： marine bacteria; Pseudoalteromonas; genomic island; motility; environmental adaptation

Cite this article

WANG Pengxia , ZHAO Yi , DU Xiaofei , WANG Weiquan , WANG Xiaoxue . Identification and functional study of the genomic island GIPspSM9913 in Pseudoalteromonas sp. SM9913[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(2) : 45 -53 . DOI: 10.11978/2022101

基因岛是细菌通过水平基因转移获取的一段整合在基因组上的外源DNA片段, 在细菌多样性和适应性进化中起着重要作用(Schmidt et al, 2004)。基因岛通常携带在特定环境条件下为宿主细菌提供优势选择的基因(Vos et al, 2015; Hemme et al, 2016)。例如, 由基因岛携带的多种抗生素耐药性基因的传播可以帮助病原菌逃避临床感染的抗生素治疗(Ray et al, 2016); 致病岛(pathogenicity island, PAI)编码的毒力和黏附因子可以帮助病原菌侵入人体细胞或逃离宿主免疫系统(Schmidt et al, 2004)。目前公布的所有已测序的细菌基因组中都检测到基因岛的存在, 有的甚至可以达到细菌基因组大小的10% ~ 20% (Casjens, 2003)。典型的基因岛具有相对保守的结构特征, 包括两侧的附着位点(attachment sites, att), 一般为短的正向重复序列; 编码一个整合酶(integrase, Int), 负责基因岛的整合和切离; 有时还编码一个切离酶(excisionase, Xis), 介导基因岛的切离(Juhas et al, 2009)。
目前为止, 基因岛的研究主要针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(Fischer et al, 2010)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Gaillard et al, 2008), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Noto et al, 2008)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(Li et al, 2003)等人类病原菌和大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等模式菌开展, 探讨其生理功能及致病机制等。而对环境细菌, 尤其是绝大部分海洋细菌基因组上基因岛的功能研究报道较少。
海洋环境具有高盐、低温、高压、寡营养的特点, 通过长时间的自然选择作用, 海洋微生物形成了独特的环境适应机制。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)是一种专属于海洋环境的革兰氏阴性细菌属, 包括极地、深海和热液等极端海洋环境(Bian et al, 2012), 由于其能产生许多具有应用价值的工业酶、色素、胞外多糖等活性物质, 以及具有丰富的生物膜形成能力, 参与海洋生态循环, 影响原生动物、珊瑚幼虫、贝类等的附着和变态发育等(Rao et al, 2010; Zeng et al, 2017; Peng et al, 2020), 在近年来备受关注。本文以分离于1855m深海沉积物的假交替单胞菌SM9913为研究对象, 利用比较基因组学分析发现鉴定了一个新的基因岛, 分析发现该基因岛在海洋假交替单胞菌、希瓦氏菌、交替单胞菌、弧菌等细菌基因组上分布广泛。检测发现该基因岛能提高宿主菌的泳动能力及对外源DNA的抵御能力。

1 材料和方法

1.1 菌株与培养条件

本试验所用假交替单胞菌SM9913 (Pseudoalteromonas sp. SM9913)菌株由山东大学张玉忠教授馈赠(Qin et al, 2007)。通过在SM9913中表达切离酶, 构建基因岛缺失突变株ΔGIPspSM9913。假交替单胞菌用2216E培养基在25℃条件下培养。假交替单胞菌中使用的抗生素为氯霉素和红霉素, 工作浓度分别为15μg·mL-1和10μg·mL-1。大肠杆菌WM3064菌株用LB培养基添加0.3mmol·L-1二氨基庚二酸(diaminopimelic acid, DAP)培养, 使用的抗生素为氯霉素和卡那霉素, 工作浓度分别为30μg·mL-1和50μg·mL-1。MLB培养基为含2.2%海盐的LB培养基, 用于接合转移试验。

1.2 主要试剂与仪器

DNA限制性内切酶购买自NEB公司(伊普斯威奇, 美国); PCR扩增引物由天一辉远公司(广州, 中国)合成; DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购买自OMEGA公司(诺克罗斯, 美国); DNA提取试剂盒购于天根公司(北京, 中国); StepOne定量PCR仪型购买自ABI公司(加利福尼亚, 美国)。

1.3 生物信息学分析

从NCBI数据库中下载GenBank格式的SM9913 (CP001796.1)和TAC125 (CR954246)的基因组序列, 利用Mauve软件进行比较基因组学分析, 预测了SM9913中的基因岛GIPspSM9913并对端点进行初步定位。用GIPspSM9913编码的整合酶的氨基酸序列在NCBI中进行BlastP检索获得97个同源蛋白(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp), 用MEGA软件(https://www.megasoftware.net/)构建GIPspSM9913整合酶的系统发育树。

1.4 质粒构建

为了大量表达GIPspSM9913的切离酶, 我们利用表1中的引物xis-F/xis-R从SM9913总DNA中扩增切离酶的编码区, 对扩增产物进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切, 连接至经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的pHGECm (Ni et al, 2021)载体。将连接产物经过氯化钙转化转入大肠杆菌WM3064感受态, 并使用含氯霉素的LB平板筛选克隆子, 获得重组质粒pXis。最后, 对pXis进行PCR扩增测序确认。
表1 本研究所用的引物

Tab. 1 The primers used in this study

引物 序列 (5′—3′) 用途
xis-F CGGAATTCATGAACAAACTAATTAAACCAAC pXis的构建和ΔGIPspSM9913的验证
xis-R CCCAAGCTTTCATAAAGTGGAGCTCATG
GI-wF GCCTGGTGTTATGGAAGCAC ΔGIPspSM9913的验证
GI-wR GATATTGATTGGCAAGGCGC
GI-qF GCTGTAGAGCTAAAAGTCCTGATTGA 定量(附着位点B, attachment site B) attB,
计算GIPspSM9913的切离率
GI-qR CCAGAAGGCGCAGATAAAATAAATA
gyrB-qF AGTGGCAACGCTAATTACTGCAT 定量SM9913基因组上内参基因gyrB, 计算
GIPspSM9913的切离率
gyrB-qR CGGTAGAAGAACGTTAGTAGCAAGGT

1.5 接合转移

质粒pXis转入SM9913是利用接合转移试验完成的(Wang et al, 2015)。首先, 过夜培养供体菌WM3064/pXis和受体菌SM9913后, 1/100转接培养至对数期。其次, 各取1mL供体菌和受体菌用MLB培养基重悬洗涤2次, 混合后在含二氨基二丙酸的MLB平皿上进行双亲本杂交, 25℃培养过夜至形成菌苔。最后, 取菌苔在含氯霉素的2216E平板上划线, 筛选SM9913/pXis接合子并进行PCR验证。比较pBBR1Ery (Ni et al, 2021)进入菌株SM9913和ΔGIPspSM9913的效率也是通过接合转移试验进行的, 以WM3064/pBBR1Ery为供体菌, SM9913和ΔGIPspSM9913为受体菌, 按上述操作进行双亲本杂交后, 利用含红霉素的2216E平板筛选接合子, 同时分别计算菌苔中的受体菌和接合子数, 接合转移效率=接合子数/受体菌数。

1.6 基因岛缺失突变株的构建

过夜培养重组菌SM9913/pXis, 1/100转接至OD 约为0.8, 加入1mmol·L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导6h后, 划线2216E平皿获得单菌落。筛选获得无氯霉素抗性的单克隆, 利用表1中的GI-wF/GI-wR和Xis-F/Xis-R两对引物对单菌落进行PCR验证, 选择GI-wF/GI-wR能扩增出目标条带, 但Xis-F/Xis-R不能扩增出目标条带的克隆抽提总DNA并再次PCR确定, 最终获得ΔGIPspSM9913突变株。

1.7 切离率计算

过夜培养重组菌SM9913/pXis和对照菌SM9913/pHGECm, 1/100转接至OD约为0.8, 加入1mmol·L-1 IPTG诱导6h后, 取600μL菌液离心收集菌体, 抽提总DNA。用表1中的qPCR引物GI-qF/GI-qR和gyrB-qF/gyrB-qR进行荧光定量PCR, 分别定量检测样品SM9913/pXis和SM9913/pHGECm中的attB和gryB的量。切离率=attB/gyrB。

1.8 电转化效率检测

参照Zhao等(2011)建立的假交替单胞菌的电转化方法, 我们制备了SM9913的电转化感受态。离心收集培养至对数期的SM9913菌体, 用预冷的去离子水洗涤、重悬两次, 然后用100μL含20mmol·L-1葡萄糖的去离子水重悬, 制备出SM9913的电转化感受态。取2μL pWD2质粒加入SM9913感受态细胞, 冰浴10min后, 用1.8kV电击。再加入500μL 2216E培养基, 25℃恢复培养4h后, 涂布含氯霉素的2216E平板筛选转化子。电转化效率=转化子总数/质粒DNA总量。

1.9 泳动能力检测

利用半固体培养基(含0.25%琼脂糖的2216E)检测假交替单胞菌的泳动能力。取1μL过夜培养的菌液点至半固体培养基表面, 缓慢盖上平皿盖, 于25℃培养16h, 拍照并测量泳动圈直径。

2 结果

2.1 基因岛GIPspSM9913的鉴定

利用Mauve软件对假交替单胞菌SM9913和近缘种TAC125的基因组进行比较发现, SM9913上压力诱导蛋白YicC和鸟苷酸激酶Gmk之间, 含有一个18kb左右的外来基因片段, TAC125上该位点无插入外来片段(图1)。注释结果表明, 该基因片段编码一个整合酶Int, 一个切离酶Xis, 一些与限制修饰系统相关的蛋白HsdR、HsdS、HsdM和Mrr等, 以及一些假定功能蛋白(表2), 该基因片段符合基因岛的结构特征。根据Burrus教授等对这类基因岛的命名规则 (Daccord et al, 2013; Poulin-Laprade et al, 2015), 该基因岛被命名为GIPspSM9913 (genomic island in Pseudoalteromonas sp. SM9913)。为了探究GIPspSM9913在细菌中的分布情况, 我们利用保守的整合酶在NCBI blastP数据库中进行检索, 获得了97个整合酶的同源蛋白序列, 系统发育分析发现这些整合酶在假交替单胞菌属、希瓦氏属、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、海单胞菌属(Marinomonas)和海洋杆菌属(Marinobacter)等属细菌中广泛分布(图2)。选取部分已报道的基因岛进行序列比对发现, GIPspSM9913与假交替单胞菌A 37-1-2, 希瓦氏菌CN32、W3-18-1和ANA-3中基因岛GIParA3712、GI21、GISpuPO1和GISspANA3的全序列同源性很低, 只在整合酶和切离酶具有相似性。其中, GIPspSM9913的整合酶和切离酶与GIParA3712的整合酶和切离酶一致性分别为50%和84% (图3)。以上结果表明GIPspSM9913同源的基因岛广泛存在于假交替单胞菌属、希瓦氏属、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)等革兰氏阴性菌中。
图1 SM9913中基因岛GIPspSM9913的鉴定

利用Mauve软件对SM9913和TAC125进行比较基因组学分析, 定位基因岛GIPspSM9913 (Darling et al, 2004)

Fig. 1 Identification of genomic island GIPspSM9913 in SM9913. GIPspSM9913 was identified by comparing the genome sequence of SM9913 with TAC125 using Mauve

表2 基因岛GIPspSM9913上所含基因的信息

Tab. 2 The genes in genomic island GIPspSM9913

基因名称 基因编号 产物长度/氨基酸数 最相似蛋白[菌株](蛋白编号) 一致性/% 功能/结构域
int PSM_A2839 409 整合酶[Pseudoalteromonas atlantica] (WP_024601833.1) 99 P4家族整合酶
cds1 PSM_A2840 264 假定蛋白[Pseudoalteromonas spiralis] (KYL33016.1) 99 假定蛋白
Xis PSM_A2841 77 转录调控因子[Pseudoalteromonas spiralis] (KYL33017.1) 99 切离酶, 原噬菌体CP4-57的调控蛋白(AlpA)
cds2 PSM_A2842 38 - - 假定蛋白
cds3 PSM_A2843 293 假定蛋白[Pseudoalteromonas spiralis] (KYL33019.1) 88 未知功能结构域(DUF3296)
cds4 PSM_A2844 188 假定蛋白[Pseudoalteromonas spiralis] (KYL33020.1) 98 假定蛋白
cds5 PSM_A2845 276 假定蛋白[Pseudoalteromonas] (WP_024601828.1) 99 LabA_like蛋白
cds6 PSM_A2846 56 假定蛋白[Paraglaciecola chathamensis S18K6] (GAC12573.1) 55 双功能抗毒素、转录抑制因子RelB
cds7 PSM_A2847 126 假定蛋白[Pseudoalteromonas] (WP_024601827.1) 100 假定蛋白
cds8 PSM_A2848 44 HsdR家族Ⅰ型限制修饰系统中的脱氧核糖核酸酶, 部分序列[Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2] (ERG10608.1) 95 HsdR家族Ⅰ型限制修饰系统中的脱氧核糖核酸酶
hsdR PSM_A2849 1057 DEAD/DEAH家族解旋酶[Marinospirillum minutulum] (WP_027849446.1) 78 HsdR家族Ⅰ型限制修饰系统中的脱氧核糖核酸酶
cds9 PSM_A2850 412 SIR2家族蛋白[Pseudogulbenkiania sp. MAI-1] (WP_024304176.1) 43 SIR2-like结构域蛋白
hsdS PSM_A2851 437 限制性内切酶S亚基[Shewanella sp. Sh95] (WP_055647049.1) 59 Ⅰ型限制修饰系统中HsdS蛋白，EcoKI限制性修饰系统蛋白
cds10 PSM_A2852 355 50S核糖体蛋白L31 [Pseudoalteromonas haloplanktis] (WP_050582305.1) 95 限制性内切酶类(RecB)超家族的核酸酶
hsdM PSM_A2853 559 DNA甲基化酶[Thalassolituus oleivorans R6-15] (AHK15533.1) 77 Ⅰ型限制性修饰系统中N-6 DNA甲基化酶
Mrr PSM_A2854 92 限制性内切酶[Pseudoalteromonas sp. S2292] (KJZ24913.1) 96 含有(D/E)-(D/E)XK 活性位点的Ⅱ型限制酶，限制性内切酶 Mrr
cds11 PSM_A2855 195 假定蛋白[Pseudoalteromonas] (WP_052201246.1) 95 假定蛋白
cds12 PSM_A2856 234 大蛋白[Pseudoalteromonas spiralis] (KYL33168.1) 97 具有保守 AHH的HNH/ENDO Ⅶ位点的核酸酶
cds13 PSM_A2857 38 - - 假定蛋白

注: -表示 在NCBI中进行BlastP检索未找到相似性蛋白, 无一致性

图2 利用MEGA4x1软件采用邻接法对GIPspSM9913编码的整合酶和97个同源蛋白构建系统发育树

图中蓝色字体标出的是图3中基因岛

Fig. 2 Phylogenetic analysis using the neighbor-joining method to compare the amino acid sequences of the integrase of GIPspSM9913 with 97 homologs. The tree was generated by MEGA4x1. The genomic island analyzed in Fig. 3 is shown in blue font

图3 GIPspSM9913 (CP001796.1)与来自假交替单胞菌A 37-1-2 (AHBY00000000.2)、希瓦氏菌CN32 (CP000681.1)、W3-18-1 (CP000503.1)和ANA3 (CP000469.1)的近缘基因岛的多序列比对

图中的数字表示同源蛋白之间的序列一致性

Fig. 3 Comparisons of GIPspSM9913 and its related genomic islands. GIPspSM9913 (CP001796.1) was compared with the related genomic islands in Pseudoalteromonas arctica 37-1-2 (AHBY00000000.2), Shewanella putrefaciens CN32 (CP000681), Shewanella putrefaciens W3-18-1 (CP000503) and Shewanella sp. ANA3 (CP000469.1). The percentage of identification between orthologous proteins were shown in the middle. Predicted open reading frames with putative functions are shown in different colors: red, GI recombination; blue, GI excision; green, restriction-modification system; orange, putative toxin-antitoxin system; brown, chemotaxis-related proteins; grey, hypothetical protein

2.2 基因岛GIPspSM9913可从基因组上切离

有报道表明, 基因岛编码的切离酶能介导基因岛两侧附着位点发生重组, 介导基因岛的切离环出(Lee et al, 2007)。如图4a所示, GIPspSM9913的attL和attR位点之间重组可生成attB和attP位点, 切离后, GIPspSM9913会从基因组上环出, 产生含attB位点的基因岛缺失株ΔGIPspSM9913和含attP位点的GIPspSM9913的环状形式。为了检测GIPspSM9913的切离, 我们利用Ptac启动子表达载体pHGECm对GIPspSM9913的切离酶进行超表达, 然后利用荧光定量PCR定量attB位点的量, 以染色体上单拷贝基因gyrB为内参, 计算基因岛的切离率(attB/gyrB)。试验结果表明, 在野生型SM9913中, 不能检测到GIPspSM9913的切离, 而在SM9913中加入1mmol·L-1 IPTG诱导切离酶表达时, GIPspSM9913的切离率达到23.6% (图4b)。随后, 我们利用attB位点两侧的特异性引物和基因岛内部的引物, 筛选获得了基因岛切离突变株ΔGIPspSM9913 (图4c)。对切离突变株的切离位点进行测序分析, 发现GIPspSM9913的切离发生在yicC基因的3′端包含终止密码子的位置。其附着位点是21bp的正向重复序列, 在3′端有两个不配对碱基, 但是由于attL和attB上的不配对碱基均位于密码子第三位碱基上, 切离前后YicC的编码序列没有任何改变(图4d)。综上所述, GIPspSM9913可以从SM9913基因组上切离, 并且其切离不影响侧翼基因的功能。
图4 基因岛GIPspSM9913可从SM9913基因组发生切离

a. GIPspSM9913从细菌基因组上切离的示意图; b. 切离酶表达时GIPspSM9913的切离率; c. GIPspSM9913切离突变株的PCR验证, DNA模板: 1为突变株ΔGIPspSM9913, 2为野生型SM9913; d. 切离前后GIPspSM9913附着位点的序列比较, 其中红色部分表示序列不一致的碱基

Fig. 4 GIPspSM9913 can excise from the SM9913 genome. (a) schematic of the excision of GIPspSM9913; (b) the excision rate of GIPspSM9913 when the excisionase was overexpressed; (c) PCR confirmation of GIPspSM9913 deletion mutant; the DNA template is: 1, ΔGIPspSM9913, 2, wild-type SM9913; (d) sequence comparison of the attachment sites of GIPspSM9913 before and after its excision

2.3 基因岛GIPspSM9913影响宿主菌的生理功能

利用ΔGIPspSM9913和野生型菌株SM9913进行比较研究, 确定GIPspSM9913对宿主菌的生理功能。如图5a所示, 将两个菌株接种至2216E半固体培养基中培养14h后, 野生型菌株形成的泳动圈直径约为菌株ΔGIPspSM9913形成的泳动圈直径的1.8倍, 这一结果明GIPspSM9913的存在能增强宿主菌的运动性, 利于宿主菌在环境中摄取营养物质。
图5 GIPspSM9913切离对宿主菌生理功能的影响

比较野生型菌株(SM9913)和基因岛切离突变株ΔGIPspSM9913的泳动能力(a)、接合转移效率(b)和电转化效率(c)

Fig. 5 Effects of GIPspSM9913 excision on the physiological function of host bacteria. (a) the swimming mobility; (b) conjugation efficiency; (c) electroporation efficiency of ΔGIPspSM9913 compared its wild-type strain SM9913

由于GIPspSM9913上含有多个与限制修饰有关的基因, 可能参与宿主菌对外源DNA的抵御过程, 因此, 我们检测了ΔGIPspSM9913的接合转移效率和电转化频率。首先, 为了检测GIPspSM9913对宿主菌接合转移效率的影响, 我们利用可在大肠杆菌、假交替单胞菌、弧菌、希瓦氏菌等多种革兰氏阴性菌(Ni et al, 2021)中高频转移的广宿主质粒pBBR1Ery进行试验。以含有pBBR1Ery的大肠杆菌WM3064为供体菌, 分别以ΔGIPspSM9913和SM9913为受体菌, 在含有滤膜的MLB固体培养基上接合转移8h。结果表明, 以野生型SM9913为受体菌时, pBBR1Ery的接合转移效率为5.0×10-6, 而以ΔGIPspSM9913为受体菌时, pBBR1Ery的接合转移效率提高了13.8倍, 为6.9×10-5 (图5b)。其次, 为了检测GIPspSM9913对宿主菌转化吸收外源DNA能力的影响, 我们利用大肠杆菌-假交替单胞菌穿梭质粒pWD2 (Zhao et al, 2011)进行试验。从大肠杆菌JM109中抽提出质粒pWD2, 分别电转化ΔGIPspSM9913和野生型菌株SM9913。结果发现, pWD2在野生菌中的电转化效率为5.2×102个·μg-1, 而在ΔGIPspSM9913菌中的电转化效率为6.7×104个·μg-1, ΔGIPspSM9913的电转化效率与野生型比提高了129倍(图5c)。以上结果表明, GIPspSM9913基因岛的存在能增强宿主菌对外源DNA的降解能力, 从而降低了其在海洋环境中被外源DNA侵入的风险。

3 讨论

本研究利用比较基因组学分析方法预测和定位了海洋假交替单胞菌SM9913的基因岛GIPspSM9913。数据库检索证实, GIPspSM9913同源基因岛还存在于其他不同生境的同属或不同属细菌基因组中, 包括分离自北极海域的Pseudoalteromonas arctica A37-1-2, 新墨西哥西北部莫里逊组250m地下砂岩的Shewanella putrefaciens CN-32, 太平洋630m海洋沉积物中的Shewanella sp. W3-18-1, 咸水河口用砷处理的木材中的Shewanella sp. ANA-3等细菌的基因组中, 暗示这类基因岛可能参与了不同生境细菌的环境适应性。序列分析发现这些基因岛都编码P4原噬菌体家族的整合酶, 可能起源于P4家族噬菌体。其中基因岛GI21最近被鉴定整合在CN32上复合型基因岛CGI48内Cro/CI家族的转录因子编码基因下游(Zhao et al, 2022), 其他基因岛整合在yicC基因内, 说明yicC是这类基因岛的整合热点。
整合位点的分析表明GIPspSM9913的切离不影响侧翼基因的功能, 说明GIPspSM9913对宿主菌生理功能影响都是其所携带的基因带来的。对大多数细菌来说, 运动性是其在环境中生存、生长、生物膜形成及与其他微生物互作必须的(Wadhwa et al, 2022)。GIPspSM9913可以提高宿主菌的泳动能力, 在海洋环境中, 营养条件普遍比较匮乏, 推测GIPspSM9913可以通过增强运动性促进宿主菌向周围环境摄取营养, 从而提高宿主菌在寡营养条件下的生存力。GIPspSM9913的注释信息中, 未发现与细菌运动性相关的基因, 但其编码多个假定蛋白和调控因子, 接下来需要对这些基因进行功能验证, 确定其与宿主菌运动性的关系。
细菌编码的限制修饰系统是一种可以降解外源DNA的防御系统 (Zheng et al, 2010)。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制修饰系统通常由DNA甲基转移酶和限制性核酸酶构成, 可识别和降解未经修饰的DNA, 同时对自身DNA进行甲基化修饰来保护自身免受降解。而Ⅳ型限制修饰系统, 仅由限制性核酸酶组成, 可识别和降解外源经甲基化修饰的DNA (Zheng et al, 2010)。本研究发现GIPspSM9913的存在能显著抑制外源质粒DNA的入侵。经分析, GIPspSM9913上编码两套限制修饰系统, Ⅰ型限制修饰系统HsdRMS和Ⅳ型限制性核酸酶Mrr。但是目前对于二者在外源质粒进入时是独立发挥DNA切割功能, 还是协同作用还需要进一步试验证实。由于海洋环境中富含噬菌体, GIPspSM9913可能也具有保护宿主菌免受病原噬菌体侵染的能力。遗憾的是, 我们利用实验室现存的噬菌体进行双层平板试验, 未筛选到SM9913野生菌或GIPspSM9913缺失株敏感的噬菌体。未来还需要从海洋样品中鉴定更多的噬菌体, 以检测GIPspSM9913对宿主菌抵御噬菌体入侵的功能。一些假交替单胞菌会参与海洋生态循环, 影响原生动物、珊瑚幼虫、贝类等的附着和变态发育(Rao et al, 2010; Zeng et al, 2017; Peng et al, 2020)。本研究解析了基因岛在假交替单胞菌环境适应性中的作用, 为利用基因岛的整合和表达提高假交替单胞菌在环境变化中的存活力, 提高假交替单胞菌的生态应用价值提供理论依据。

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