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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 3: 116 - 125

DOI: https://doi.org/10.11978/2022121

Effects of ammonium enrichment on the photosynthesis, glutamine synthetase and amino acid composition of seagrass Halophila beccarii Asch

  • JIANG Zhijian , 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,
  • Chanaka Isuranga PREMARATHNE 1, 3 ,
  • FANG Yang 1, 3 ,
  • LIN Jizhen 1, 3 ,
  • WU Yunchao 1, 2, 4, 5, 6 ,
  • LIU Songlin 1, 2, 4, 5, 6 ,
  • HUANG Xiaoping , 1, 2, 3, 4, 5, 6
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
  • 4. Innovation Academy of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 5. Key Laboratory of Tropical Marine Biotechnology of Hainan Province, Sanya Institute of Ocean Eco-Environmental Engineering, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Sanya 572100, China
  • 6. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, Guangzhou 510301, China
HUANG Xiaoping. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2022-05-26

  Revised date: 2022-07-16

  Online published: 2022-07-21

Supported by

Hainan Province Science and Technology Special Fund(ZDYF2021SHFZ254)

National Natural Science Foundation of China(41735029)

National Natural Science Foundation of China(41976144)

National Natural Science Foundation of China(U1901221)

National Natural Science Foundation of China(42176158)

Youth Innovation Promotion Association CAS(2023359)

Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China(2020B1212060058)

Fold

Abstract

Seagrass Halophila beccarii Asch has long been neglected due to its small size, and the coastal nitrogen loading accelerates its degradation. The physiological response of H. beccarii to ammonium toxicity is not clear. Based on the lab cultivation experiment, the effects of ammonium enrichment in four gradients (Control, 25 μmol·L-1, 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1) on the photosynthesis, chlorophyll, ammonium ion flux in mesophyll cell, glutamine synthetase activity and nutrients of H. beccarii are studied using chlorophyll fluorescence, non-invasive micro measurement technology and targeted metabolomics. The results showed that the maximum relative electron transport rate exhibits a trend of low ammonium enrichment>moderate ammonium enrichment>control>high ammonium enrichment. High ammonium enrichment significantly reduces the maximum relative electron transport rate and light utilization efficiency, while decreasing the carbon pool for ammonium assimilation. Meanwhile, ammonium enrichment significantly enhances the ammonium ion flux and glutamine synthetase activity, assimilating excess ammonium into amino acids. However, ammonium enrichment reduces the amino acid contents, which might be caused by that the amino acids are used to synthesize organic substances such as key secondary metabolites to further regulate and adapt to ammonium toxicity. Therefore, moderate ammonium enrichment is beneficial for the photosynthesis and growth of H. beccarii, while high ammonium enrichment has toxic effect on H. beccarii.

Key words： ammonium; Halophila beccarii Asch; photosynthesis; glutamine synthetase; amino acid

Cite this article

JIANG Zhijian , Chanaka Isuranga PREMARATHNE , FANG Yang , LIN Jizhen , WU Yunchao , LIU Songlin , HUANG Xiaoping . Effects of ammonium enrichment on the photosynthesis, glutamine synthetase and amino acid composition of seagrass Halophila beccarii Asch[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(3) : 116 -125 . DOI: 10.11978/2022121

海草(seagrass)是地球上唯一可完全生活在海水中的高等被子植物 (Larkum et al, 2006; Short et al, 2007; 黄小平 等, 2018)。海草床是地球上生产力和生物多样性最高、分布最广的沿海生态系统之一 (Olsen et al, 2016)。它具有净化水质、固定底质和保护海岸、储碳、为海洋鱼类等生物提供产卵场和食源等重要的生态系统服务功能 (Fourqurean et al, 2012; Lamb et al, 2017; Jiang et al, 2020b; 陈启明 等, 2020)。然而, 在全球变化和人类活动的双重影响下, 海草床正急剧衰退 (Waycott et al, 2009; Unsworth et al, 2019)。其中, 人类活动导致的近岸海域富营养化是主要影响因素之一 (Burkholder et al, 2007; Waycott et al, 2009; Li et al, 2019; Thomsen et al, 2020; Pazzaglia et al, 2022)。近年来, 富营养化对海草生理生态的影响逐渐成为研究的热点。然而, 目前为止, 大多数研究都是聚焦于泰来草(Thalassia hemprichii)、鳗草(Zostera marina)和大洋波喜荡草(Posidonia oceanica)等中大型海草对富营养化的生理生态响应方面(Artika et al, 2020; Pazzaglia et al, 2020; Viana et al, 2020; Qin et al, 2021; Pazzaglia et al, 2022; Thomsen et al, 2022), 较少关注贝克喜盐草(Halophila beccarii Asch)等小型海草的生理生态响应。海草床生态系统中, 不论是在海水还是沉积物间隙水中, 铵态氮是氮元素的主要存在形态, 其次是硝酸态氮(Hemminga et al, 2000)。而且, 大多数研究聚焦于铵胁迫下海草组织碳氮含量的分配响应, 缺乏海草对铵离子吸收与转化的系统研究, 亟需深入探讨海草的铵离子吸收和关键酶的转化过程, 以及氨基酸成分的变化, 以深入认知海草的抗逆和解毒机制。
海草贝克喜盐草是分布在热带印度洋—太平洋地区潮间带的最古老海草谱系中的两个物种之一 (Short et al, 2010)。由于形态小且易被沉积物覆盖, 贝克喜盐草的重要性并不受人们的关注和重视。在我国, 贝克喜盐草是热带—亚热带海域的海草优势种, 且经常生长在具有大量营养盐输入, 水体浑浊的近岸海域(王道儒 等, 2012; 邱广龙 等, 2016; Jiang et al, 2017; Jiang et al, 2020a; 邱广龙 等, 2020)。因此, 贝克喜盐草海草床一直处于加速衰退状态, 目前已被世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature, IUCN)列为受威胁物种红色名录中的脆弱物种 (Short et al, 2010)。鉴于贝克喜盐草受威胁的程度, 以及其作为海草床开拓种和先锋种 (邱广龙 等, 2020; Mishra et al, 2021), 贝克喜盐草对富营养化等环境胁迫的生理生态响应亟待进行深入研究。
因此, 本研究通过室内模拟实验, 设置不同的铵态氮浓度, 结合叶绿素荧光技术、靶向代谢组学和非损伤微测技术, 研究了铵态氮加富对贝克喜盐草光合作用、铵离子吸收速率、谷氨酰胺合成酶活性以及氨基酸成分等的影响。研究结果有助于认知富营养化环境下贝克喜盐草海草床退化的生理机制, 为海草床生态系统的保护与管控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与实验设计

贝克喜盐草采集于广东省阳江海域。该海草床是混合海草床, 其中优势种为贝克喜盐草。近岸的虾塘养殖、农业面源和居民生活废水等输入营养盐, 使贝克喜盐草等海草受到一定营养负荷的胁迫 (Jiang et al, 2020a)。该海草床的海水氮营养盐主要以铵态氮为主。因此, 本研究主要探讨铵态氮营养负荷的影响。在该海草床随机采集完整的、生长状况良好的贝克喜盐草斑块(茎枝密度为5238±1361shoots·m-2), 沉积物厚度大约是6cm, 同时采集原位海水, 迅速带回实验室。
将采集的贝克喜盐草斑块置于16个培养缸中(15cm×17cm×20cm)。在饱和光照(约200μmol·m-2·s-1, 昼夜比12h:12h)和最适温度(25℃)下驯养1周。根据前期野外调查研究发现, 华南沿海贝克喜盐草的最适无机氮浓度约为40μmol·L-1 (Jiang et al, 2020a), 且贝克喜盐草海草床分布区海水无机氮浓度最高可达80.2μmol·L-1 (Jiang et al, 2020a)。因此, 本实验共设置4个不同的铵态氮浓度梯度(对照组、25、50和100μmol·L-1), 每个梯度4个重复。原位海水的铵态氮浓度为3.2~10.4μmol·L-1, 平均值为7.3±1.7μmol·L-1, 盐度为15.3‰。贝克喜盐草在不同的铵态氮加富条件下培养4周, 每周更换一次原位海水, 并重新添加氯化铵以维持铵态氮浓度。铵态氮浓度用次溴酸钠氧化法测定。

1.2 样品分析与处理

室内实验结束后, 采集完整的海草植株, 叶片洗干净后, 利用Mini-PAM测定快速光曲线, 利用非损伤微测技术测定叶片的NH+ 4流速; 同时洗干净的叶片用于测定叶绿素含量、氨基酸含量、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)活性; 剩余的洗干净的海草叶片60°C持续烘72h后用研钵和研杵磨碎测定稳定碳氮同位素含量。
其中, 利用调制叶绿素荧光仪Mini-PAM(Walz, 德国)测量贝克喜盐草的叶绿素荧光。快速光曲线的测量步骤按Ralph 等(2005)的方法进行。设置8个光合有效辐射(photosynthetic active radiation, PAR)梯度(24、88、179、328、512、729、1121、1563μmol photons·m-2·s-1)并分别测定量子产量。根据ΦPSII和PAR可以计算出相对电子传递速率RETR =ΦPSII × PAR × 0.5× AF (Schwarz et al, 2000; Beer et al, 2001)。曲线拟合用Platt 等的(1980)公式 RETR = P s ( 1 − e − ( α PAR / P s ) ) e − ( β PAR / P s )拟合曲线。其中Ps代表最大光合速率, 也就是最大相对电子传递速率RETRmax, α是快速光曲线的初始斜率, 反映了光能利用的效率, β是光抑制参数。曲线拟合采用最小二乘法, 用Statistica 6.0软件进行。
利用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technology, NMT, YoungerUSA LLC, Amherst, MA01002, USA; Xuyue [Beijing] Sci. and Tech. Co., Ltd., Beijing, China)对活体叶片进行了叶片NH+ 4离子流的流速测定。确定活体叶片中的一小块待测区域, 用刀片从中切出3mm3mm大小的叶片组织。将叶片组织固定在培养皿中, 加入10mL测试液后上样检测。在显微镜下找到目标检测区域, 将NH+ 4流速传感器置于距离叶肉组织表面约30μm处, 开始检测。每个样品检测10min, 每组检测4个重复。通过imFluxes V2.0软件(YoungerUSA LLC, Amherst, MA01002, USA)直接读取NH+ 4流速数据, 流速单位为mol·cm-2·s-1, 正值代表外排, 负值代表吸收。
用简化的分光光度法测定了叶片叶绿素和类胡萝卜素含量, 即将已知重量的海草叶片细丝置于5mL 80%丙酮溶液中提取过夜, 将提取液重新定容为5mL, 用分光光度计分别在663、645和470nm处读取光密度, 并使用以下公式计算光合色素含量(舒展 等, 2010):

Chl a (μg·mL-1) = 12.7OD663 - 2.69OD645

Chl b (μg·mL-1) = 22.9OD645 - 4.86OD663

氨基酸成分测定, 称取样品, 加入5mL甲醇超声3min, 静置5min, 离心取上清液100μL, 加100μL内标溶液, 涡旋, 吸取上清液, 过滤进LC-MS分析(苏州帕诺米克生物医药科技有限公司)。谷氨酰胺合成酶利用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)进行测定。为反映贝克喜盐草的光合碳利用和铵胁迫的程度, 上述样品使用MAT 253同位素比率质谱仪(Thermo Fisher Scientific, Inc., 美国)分析测定δ13C和δ15N值, 每个样品设置两个平行, 每11个样品添加1个标准样, 测定精密度δ13C<0.1‰和δ15N<0.2‰。碳氮稳定同位素以国际通用的δ值(‰)表示:
$\delta^{13} \mathrm{C}(\% 0)=\left[\frac{\left({ }^{13} \mathrm{C} /{ }^{12} \mathrm{C}\right)_{\text {样品 }}}{\left({ }^{13} \mathrm{C} /{ }^{12} \mathrm{C}\right)_{\text {标准 }}}-1\right] \times 1000$
式中, (13C/12C)标准和(15N/14N)标准为国际标准物PDB(Peedee Belemnite)的碳氮同位素比值, δ13C和δ15N的值越小代表样品中重同位素(13C和15N)含量越低。

1.3 数据处理与分析

利用Excel 2010软件对数据进行预处理, 而后进行方差分析, 方差分析之前, 均进行同质性检验, 若不满足方差同质性, 对数据进行对数转换以使其满足方差同质性。上述方差分析利用Minitab 17.0 Statistical软件进行处理。

2 结果

2.1 光合作用与叶绿素含量的响应

贝克喜盐草光合作用对铵态氮加富的响应如图1所示。贝克喜盐草的最大相对电子传递速率随铵态氮浓度升高呈现先升高后下降的趋势, 在25μmol·L-1处理组达到最大值, 显著高于100μmol·L-1处理组, 是其1.4倍。同样, 高铵态氮加富也显著降低了贝克喜盐的α(光能利用效率)(图1)。贝克喜盐草叶绿素含量的变化见图2。单因素方差分析表明, 虽然处理间叶绿素没有显著差异, 但随着铵态氮浓度的增加, 贝克喜盐草的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈现逐渐增加的变化趋势(图2)。
图1 铵态氮加富对贝克喜盐草最大相对电子传递速率和α(光能利用效率)的影响

CK代表对照, LE代表低铵态氮加富, ME代表中铵态氮加富, HE代表高铵态氮加富。图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

Fig. 1 The effect of ammonium enrichment on the relative maximum electron transport rates of Halophila beccarii. CK represents the control, LE represents low ammonium enrichment (25 μmol·L-1 NH+ 4), ME represents medium ammonium enrichment (50 μmol·L-1 NH+ 4), HE represents high ammonium enrichment (100 μmol·L-1 NH+ 4). Different small letters in the columns indicate significant differences (P<0.05)

图2 铵态氮加富对贝克喜盐草叶绿素含量的影响

CK代表对照, LE代表低铵态氮加富, ME代表中铵态氮加富, HE代表高铵态氮加富

Fig. 2 The effect of ammonium enrichment on the chlorophyll contents of Halophila beccarii. CK represents the control, LE represents low ammonium enrichment (25 μmol·L-1 NH+ 4), ME represents medium ammonium enrichment (50 μmol·L-1 NH+ 4), HE represents high ammonium enrichment (100 μmol·L-1 NH+ 4)

2.2 氨基酸成分、谷氨酰胺合成酶及稳定碳氮同位素的响应

氨基酸成分的变化见表1。贝克喜盐草的氨基酸成分经鉴定, 共有18种成分, 主要成分包括天冬酰胺、谷氨酰胺和丙氨酸。单因素方差分析表明, 鸟氨酸(F=6.44, P<0.05)、谷氨酰胺(F=5.79, P<0.05)、组氨酸(F=5.45, P<0.05)和精氨酸(F=6.46, P<0.05)组间具有显著性差异。除了鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸外, 其他氨基酸成分以及总氨基酸含量在铵态氮加富条件下均比对照的低(表1)。
表1 铵态氮加富对贝克喜盐草叶片氨基酸成分的影响

Tab. 1 Effect of ammonium enrichment on the amino acid compositions in the leaf of Halophila beccarii

氨基酸 对照 25μmol·L-1 NH+ 4 50μmol·L-1 NH+ 4 100μmol·L-1 NH+ 4
含量/(μg·g-1) 占比/% 含量/(μg·g-1) 占比/% 含量/(μg·g-1) 占比/% 含量/(μg·g-1) 占比/%
甘氨酸 ND ND ND ND ND ND ND ND
丙氨酸 2101.7±710.2A 10.35 1538.0±524.9AB 9.88 1537.1±412.8AB 9.54 1062.9±272.8B 9.48
γ－氨基丁酸 148.5±85.5A 0.73 92.8±34.9AB 0.60 100.2±53.1AB 0.62 61.1±42.2B 0.54
丝氨酸 254.7±70.4 1.25 218.1±62.1 1.40 218.9±55.3 1.36 154.8±46.2 1.38
脯氨酸 44.4±12.4 0.22 37.5±20.4 0.24 36.0±7.5 0.22 25.9±13.7 0.23
缬氨酸 299.0±93.9 1.47 203.2±49.6 1.31 224.7±107.4 1.39 154.8±72.7 1.38
苏氨酸 ND ND ND ND ND ND ND ND
异亮氨酸 347.7±112.2 1.71 271.5±93.0 1.74 293.7±134.6 1.82 204.6±85.0 1.82
亮氨酸 75.1±20.8 0.37 49.2±9.5 0.32 61.4±40.3 0.38 36.3±19.7 0.32
天冬酰胺 14022.5±3810.7 69.04 11103.8±2500.6 71.34 11339.8±5312.9 70.38 7923.3±4034.9 70.64
鸟氨酸 2.3±1.0 0.01 3.3±1.7 0.02 2.8±1.5 0.02 1.8±0.9 0.02
天冬氨酸 506.9±114.1A 2.50 392.8±65.9AB 2.52 370.1±147.3AB 2.30 285.4±124.3B 2.54
高半胱氨酸 ND ND ND ND ND ND ND ND
谷氨酰胺 2233.8±787.1A 11.00 1429.1±570.5A 9.18 1685.2±970.4AB 10.46 1114.8±671.0B 9.94
赖氨酸 11.1±2.4 0.05 14.6±8.9 0.09 10.2±6.3 0.06 6.4±4.5 0.06
谷氨酸 156.4±12.5 0.77 133.9±18.2 0.86 154.2±44.0 0.96 124.1±44.6 1.11
甲硫氨酸 ND ND ND ND ND ND ND ND
组氨酸 16.9±3.0 0.08 13.3±2.8 0.09 12.4±9.8 0.08 11.0±6.7 0.10
苯丙氨酸 46.5±11.9A 0.23 38.6±4.8AB 0.25 39.1±19.3AB 0.24 28.7±11.0B 0.26
精氨酸 1.9±0.4 0.01 2.4±0.9 0.02 2.0±0.8 0.01 2.0±1.1 0.02
酪氨酸 ND ND ND ND ND ND ND ND
色氨酸 41.6±14.9A 0.20 23.1±7.7AB 0.15 24.5±19.1B 0.15 18.1±12.9B 0.16
总氨基酸 20311.0±5768.9 100.00 15565.3±3627.4 100.00 16112.4±7267.6 100.00 11216.1±5384.5 100.00

注: 上标不同的大写字母表示差异显著(P<0.05)

单因素方差分析表明, 25μmol·L-1 NH+ 4处理下贝克喜盐草叶片的谷氨酰胺合成酶活性与对照的没有显著差异, 但是50和100μmol·L-1 NH+ 4处理下, 贝克喜盐草叶片的谷氨酰胺合成酶活性显著比对照的高。谷氨酰胺合成酶活性在铵态氮浓度为50μmol·L-1时达到最大值, 是对照组的1.4倍(图3)。
图3 铵态氮加富对贝克喜盐草叶片谷氨酰胺合成酶活性的影响

CK代表对照, LE代表低铵态氮加富, ME代表中铵态氮加富, HE代表高铵态氮加富。图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

Fig. 3 The effect of ammonium enrichment on the glutamine synthetase activity of the leaf of Halophila beccarii. CK represents the control, LE represents low ammonium enrichment (25 μmol·L-1 NH+ 4), ME represents medium ammonium enrichment (50 μmol·L-1 NH+ 4), HE represents high ammonium enrichment (100 μmol·L-1 NH+ 4). Different small letters in the columns indicate significant differences (P<0.05)

虽然不同处理组间贝克喜盐草的叶片δ13C没有显著差异(F=1.4, P<0.29), 但铵态氮加富条件下, 贝克喜盐草的叶片δ13C比对照的低。铵态氮加富显著降低贝克喜盐草叶片的δ15N(F=4.14, P<0.05, 图4)。
图4 铵态氮加富对贝克喜盐草叶片稳定碳、氮同位素的影响

CK代表对照, LE代表低铵态氮加富, ME代表中铵态氮加富, HE代表高铵态氮加富。图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

Fig. 4 The effect of ammonium enrichment on the stable isotope carbon and nitrogen of the leaf of Halophila beccarii. CK represents the control, LE represents low ammonium enrichment (25 μmol·L-1 NH+ 4), ME represents medium ammonium enrichment (50 μmol·L-1 NH+ 4), HE represents high ammonium enrichment (100 μmol·L-1 NH+ 4). Different small letters in the columns indicate significant differences (P<0.05)

2.3 铵离子流速的响应

NMT测量结果正值代表外排, 负值代表吸收。单因素方差分析表明, 不同铵态氮加富条件下, NH+ 4流速均显著高于对照组(F=1218.8, P<0.01)。NH+ 4流速随铵态氮浓度升高呈现先升高后下降的趋势, 在50μmol·L-1处理组达到最大值, 显著高于100μmol·L-1处理组, 是其1.3倍(图5)。
图5 铵态氮加富对贝克喜盐草叶片铵根离子流速的影响

CK代表对照, LE代表低铵态氮加富, ME代表中铵态氮加富, HE代表高铵态氮加富。图中不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

Fig. 5 The effect of ammonium enrichment on the ammonium ion flux of the leaf of Halophila beccarii. CK represents the control, LE represents low ammonium enrichment (25 μmol·L-1 NH+ 4), ME represents medium ammonium enrichment (50 μmol·L-1 NH+ 4), HE represents high ammonium enrichment (100 μmol·L-1 NH+ 4). Different small letters in the columns indicate significant differences (P<0.05)

3 讨论

3.1 铵态氮加富对贝克喜盐草光合作用的影响

海草能把环境中的氮和磷作为营养盐吸收以满足自身生长的需要 (Leoni et al, 2008)。铵态氮是海草床中氮元素的主要存在形态 (Hemminga et al, 2000)。海草对NH+ 4的吸收速率比对NO- 3的高 (Lee et al, 1999; Alexandre et al, 2015)。叶绿素是光合作用的重要色素, 而光合作用为海草的生长和发育提供碳源和能量 (Buapet, 2017)。本研究发现, 铵态氮加富提高了叶绿素a和叶绿素b含量。同样, 营养盐加富也是提高了大洋波喜荡草等海草的叶绿素含量 (Leoni et al, 2008; Ravaglioli et al, 2018)。叶绿素分子由一个卟啉头(由4个含氮吡咯环组成, 在镁离子周围形成一个环)和一个长长的碳氢化合物尾组成 (Clark, 2011)。由于氮是叶绿素的主要元素, 铵态氮加富提高了NH+ 4的吸收, 使海草的氮元素含量增加, 进而促进叶绿素的合成 (Leoni et al, 2007; Ravaglioli et al, 2018)。海草叶绿素含量的增加, 可能会提高海草的光合作用效率 (Leoni et al, 2008)。低、中铵态氮加富提高了贝克喜盐草的最大相对电子传递速率, 但高铵态氮加富却降低了其最大相对电子传递速率和α(光能利用效率)。这表明低中等程度的铵态氮加富会提高贝克喜盐草的光合效率。Lee等(2007)也发现适合的营养盐浓度也会促进海草的光合效率。另外, 营养盐添加促进了贫营养盐环境中泰来草和圆叶丝粉草(Cymodocea rotundata)的生长 (Thomsen et al, 2022)。高铵态氮加富显著降低贝克喜盐草的光合速率和光能利用效率, 这会减少非结构性碳水化合物的合成, 进而抑制海草的生长和难以提供足够的碳库来同化过多的铵态氮 (van Katwijk et al, 1997)。这会导致高铵态氮处理下, 海草体内积累过多的铵态氮, 对海草产生毒害作用。因此, 适当的铵态氮加富可以促进贝克喜盐草的光合作用和生长, 而超过适合的铵态氮浓度, 可能会对贝克喜盐草叶片的光合作用和生长产生不利影响。

3.2 铵态氮加富对贝克喜盐草营养成分的影响

为了避免产生铵毒害作用, 随着铵态氮浓度的增加和积累, 进入植物细胞的NH+ 4需要尽快被吸收同化 (van Katwijk et al, 1997; Alexandre et al, 2010)。这就需要增加氮同化相关酶如谷氨酰胺合成酶的含量和活性 (Nayar et al, 2018)。正如陆地植物, 谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶被认为也是海草氮代谢过程的关键酶 (Pernice et al, 2016)。本研究发现, 铵态氮加富条件下, 贝克喜盐草叶片的NH+ 4内流速率增强, 表明其对铵态氮的吸收量增加。同时, 铵态氮加富也提高了贝克喜盐草叶片的谷氨酰胺合成酶活性, 以增加氮的同化。在50μmol·L-1的铵态氮浓度下, 贝克喜盐草的谷氨酰胺合成酶活性和NH+ 4流速均是最高的。同样, 铵态氮也提高了鳗草叶片和根的谷氨酰胺合成酶的活性 (Wang et al, 2021)。牟氏鳗草(Zostera muelleri)的叶片和根的谷氨酰胺合成酶基因表达在铵态氮加富条件下也提高了 (Pernice et al, 2016)。因此, 谷氨酰胺合成酶在贝克喜盐草氮同化过程中可能起着重要作用。
氨基酸在蛋白质生产、其他代谢途径以及信号传导中发挥重要作用 (D'Mello, 2015)。本研究发现, 贝克喜盐草叶片的氨基酸成分中, 主要有三种: 天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺。其中天冬酰胺含量最高, 范围为7200~14100μg·g-1。正常情况下, 氨基酸作为氮同化产物, 在高营养盐条件下其含量会提高 (Touchette et al, 2000a, 2000b; Invers et al, 2004)。然而, 本研究发现, 在铵态氮加富条件下, 贝克喜盐草叶片的氨基酸含量却降低了, 特别是谷氨酰胺和色氨酸显著降低。同样, 铵态氮加富也降低了鳗草叶片的氮含量 (Wang et al, 2021)。贝克喜盐草可能存在一种独特的铵解毒机制。随着环境中铵态氮浓度的增加, 贝克喜盐草吸收NH+ 4的流速增加, 激发了谷氨酰胺合成酶活性, 把过多的NH+ 4同化成氨基酸成分。同时, 合成的氨基酸可能被用来合成有机物如关键次生代谢物(包括总酚、类黄酮等), 以进一步调节和适应铵毒害作用及其伴随的应激胁迫如病原体入侵等(Bittsánszky et al, 2015; Hasler-Sheetal et al, 2016; Kumar et al, 2017)。这种铵解毒机制亟待利用代谢组学等技术进一步深入研究(李玲兰 等, 2020)。
稳定同位素组成是研究海草生理过程及其响应环境变化的较好指示指标 (Hemminga et al, 1996)。本研究表明, 贝克喜盐草的叶片δ13C值范围为-19.5‰~ -18.35‰, 这与McMillan等(1980)对贝克喜盐草叶片δ13C(-23.8‰ ~ -17.0‰)的研究结果相一致。同时, 贝克喜盐草的叶片δ13C随着铵态氮浓度的增加而增加。海草可以吸收利用海水中无机碳的最主要成分HCO- 3 (Beer et al, 2002; Gavin et al, 2019)。在较高浓度的铵态氮条件下, 贝克喜盐草可能对HCO-3的利用程度更高, 以提供更多的碳骨架用于氮的同化 (Leoni et al, 2008), 或者存在另外的碳分馏过程。高铵态氮条件下, 贝克喜盐草的δ15N反而较低。其他相关研究也表明海水和沉积物的营养盐含量与海草叶片的δ15N不相关 (Walton et al, 2016)。这表明铵态氮加富条件下, 海草的碳氮同位素分馏机制不是特别清楚, 亟待深入研究。

3.3 生态学意义

营养盐对于海草的光合作用和生长发育至关重要。但是, 营养盐超过一定浓度后, 会对海草产生毒害和不利影响(Connell et al, 2017)。全世界的无机肥料使用量、生活与工业排污活动等一直在稳步增加, 富营养化引起海草的退化也在加剧 (Ngatia et al, 2019; Lapointe et al, 2020)。本研究表明, 铵态氮加富会影响海草的光合电子传递速率、叶绿素、NH+ 4流速、谷氨酰胺合成酶活性以及氨基酸成分。显然, 低浓度和中等浓度的铵态氮加富, 提高了贝克喜盐草的光合作用和谷氨酰胺合成酶活性, 而高浓度的铵态氮则降低了其光合作用。这表明贝克喜盐草存在一个最适生长的铵态氮浓度。大范围的贝克喜盐草根叶形态参数与营养盐的相关性分析表明, 华南沿海贝克喜盐草的最适无机氮浓度约为40μmol·L-1 (Jiang et al, 2020a)。本室内模拟实验的研究结果与大范围的相关性分析结果基本一致。因此, 该贝克喜盐草的最适营养盐浓度, 有助于制定营养盐输入控制策略, 通过陆海统筹管理以更好地保护海草床。另外, 富营养化也会引起浮游植物和附生藻类的增殖, 进而减少海草的可利用光强度 (Lapointe et al, 2020), 这可能会降低模拟实验获取的最适营养盐浓度, 值得注意并加强研究。考虑到贝克喜盐草的生长速度较快, 且对营养盐有较高的耐受性, 可尝试加大贝克喜盐草的移植恢复规模, 通过协同添加营养盐, 以提高贝克喜盐草的移植恢复成功率。

4 结论

本研究发现低、中铵态氮加富有利于贝克喜盐草的光合速率, 而高铵态氮加富则会抑制贝克喜盐草的光合速率和光能利用效率。铵态氮加富提高了贝克喜盐草的叶绿素含量、铵离子内流速率和谷氨酰胺合成酶活性, 但却降低了其叶片氨基酸含量。因此适度的铵营养盐增加会促进贝克喜盐草的光合作用和生长, 而高浓度的铵营养盐对贝克喜盐草产生毒害作用。未来应该进一步系统研究, 阐明营养负荷下海草碳氮关键代谢过程与通路, 为加深对海草床退化机制的认知, 更好地保护和管理海草床, 以及提高海草移植修复效果提供参考。

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