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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 3: 126 - 135

DOI: https://doi.org/10.11978/2022149

Marine Geology

Effects of polar and lateral flagella on biofilm formation in marine Pseudoalteromonas

  • GUO Yunxue , 1, 2 ,
  • CAI Xingsheng 1 ,
  • GU Jiayu 1, 2 ,
  • WANG Xiaoxue 1, 2
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Guo yunxue. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2022-07-03

  Revised date: 2022-08-31

  Online published: 2022-09-14

Supported by

National Natural Science Foundation of China(31970037)

National Natural Science Foundation of China(91951203)

Guangdong Major Project of Basic and Applied Basic Research(2019B030302004)

Fold

Abstract

Pseudoalteromonas are widely distributed in diverse marine environments. They can produce an array of bioactive compounds and enzymes, and have strong ability to form biofilms in general. The biofilms formed by Pseudoalteromonas are able to induce biomineralization and inhibit the settlement of fouling organisms. Flagella are essential for bacterial motility, mediating nutrient acquisition, and the transformation from planktonic living style to biofilm state. Flagella is also considered as a critical component of biofilm matrix. However, the function of flagella during biofilm formation of marine Pseudoalteromonas remains unclear. In this study, we focused on Pseudoalteromonas sp. SCSIO 11900 and SM9913, which were isolated from the surface water and the sediment of deep oceans, respectively. The influence of flagella on biofilm formation and motility was explored by analyzing mutants lacking the genes encoding components of different flagellar portions in both strains. The results showed that the polar flagella are essential for swimming motility, and inhibit biofilm formation in SM9913 and SCSIO 11900. In addition, the lateral flagella in SM9913 also plays a role in swimming motility, but has no effects on biofilm formation. We further showed that these polar flagella systems are present in different Pseudoalteromonas strains, implying that they may be important for these bacteria for nutrient acquisition, for colonization and environmental adaptation in diverse marine habitats.

Key words： Pseudoalteromonas; flagella; swimming motility; biofilm formation

Cite this article

GUO Yunxue , CAI Xingsheng , GU Jiayu , WANG Xiaoxue . Effects of polar and lateral flagella on biofilm formation in marine Pseudoalteromonas[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(3) : 126 -135 . DOI: 10.11978/2022149

细菌在维持海洋生态系统能量和物质循环中发挥枢纽作用, 具有运动能力的海洋细菌会不断寻找高浓度营养物的海洋环境, 同时避开有害物质。而运动能力也可以帮助海洋致病菌发现宿主并在其中定殖。细菌运动的方式多种多样, 研究较多的是通过运动器官鞭毛的旋转来驱使的运动(Jarrell et al, 2008), 包括在液体中的泳动和旋转梭动以及在固体表面上滑行。从结构上看, 鞭毛是细长而弯曲的丝状物质, 长度是细菌的若干倍, 每根鞭毛由一条长长的纤维(作为驱动的“螺旋桨”)、一个钩子(作为连接结构)和一个嵌入在细胞膜的基础小体组成, 每一部分对鞭毛功能都必不可缺(Pallen et al, 2006)。
生物膜是地球上细菌最重要的存在形式之一。几乎所有细菌在一定条件下都可以附着于惰性或活性实体的表面, 繁殖、分化, 并分泌一些多糖基质, 将菌体群落包裹其中而形成生物膜(Flemming et al, 2010)。生物膜内细菌的游动性相关基因的表达被抑制, 包括鞭毛结构基因(Guttenplan et al, 2013)。以生物膜形式存在的细菌不同于浮游细菌, 它们对抗生素、环境胁迫及宿主免疫防御机制有极强的抗性, 并且生物膜内的细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用等方面都具有独特的性质(Flemming et al, 2016; Flemming et al, 2019)。在海洋环境中, 所有实体的表面, 如岩石、悬浮物、植物和动物都可能被生物膜侵占。近年, 随着国家海洋强国战略的提出, 多个领域持续向海洋进军, 海洋建筑也越来越多, 但这些建筑表面的生物膜会诱导海洋贝类等腐蚀生物幼体的附着(Antunes et al, 2019), 造成重大的经济损失, 因此海洋生物防腐成为领域内的难题之一。目前关于鞭毛在细菌游动性和生物膜形成方面的研究主要集中在大肠杆菌和铜绿假单胞菌等致病菌中, 关于海洋细菌的生物膜形成机制的研究报道较少。
假交替单胞菌最早分离于1995年, 为杆状的革兰氏阴性菌(Gauthier et al, 1995; 席宇 等, 2005)。它们具有强大的产胞外降解酶能力, 而且产生具有重要生态作用的生物活性物质 (Bowman, 2007)。假交替单胞菌常见于近岸海域和远海, 经常与真核生物共存, 包括海洋浮游动植物、海绵、贝类和珊瑚等(Holmström et al, 1999), 在海洋生态系统中发挥“双刃剑”作用。一方面, 部分假交替单胞菌是海洋动植物的致病菌, 如引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌(闫咏 等, 2002)和引起黑鲷尾鳍基部溃烂病的假交替单胞菌LSHD-1(乔毅 等, 2015) 。另一方面, 一些假交替单胞菌为益生菌, 如杀鱼假交替单胞菌(P. piscicida 2515)抑制凡纳滨对虾抗副溶血弧菌的能力(王枫林 等, 2021)。关于海洋假交替单胞菌鞭毛在细菌游动性和生物膜形成中的作用研究较为缺乏。有报道指出, 敲除海洋假交替单胞菌(P. marina)鞭毛基因pilZ促进生物膜形成, 降低胞外产物包括β-多糖和蛋白质的含量, 进而抑制厚壳贻贝附着变态(张驰 等, 2022)。本研究选择来自表层和深海的两株假交替单胞菌, 它们均完成全基因组测序分析, 相似度97.11%。对其编码鞭毛不同部位基因进行了系统的敲除, 比较了各突变菌株在细菌游动性和生物膜形成方面的能力, 为进一步了解海洋假交替单胞菌的环境适应性, 开发针对特定需求改造鞭毛系统的海洋细菌提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与培养基

实验所用的表层假交替单胞菌SCSIO 11900分离于南海珊瑚礁区4m深处(中科院南海所李洁研究员赠), 深海假交替单胞菌SM9913分离于冲绳海槽附近 1855m沉积物(山东大学张玉忠教授赠)(表1)。培养温度为25℃, 培养基为海水配置的培养基(Sea Water Luria-Bertani, SWLB, 1%蛋白胨, 0.5%酵母提取物, 溶于海水)。营养缺陷型大肠杆菌WM3064使用含0.3mmol·L-1二氨基丙烯酸的正常LB培养基, 培养温度为37℃。实验中用到的抗生素为红霉素和卡那霉素, 工作浓度分别为25和30μg·mL-1。
表1 实验中用到的菌株和质粒

Tab. 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

描述 来源
菌株 SCSIO 11900 野生型, 分离自中国南海4m水深的珊瑚黏液层 Zeng et al, 2014
11900ΔmotAB 敲除motAB的SCSIO 11900菌 本研究
11900 ΔfliF 敲除fliF的SCSIO 11900菌 本研究
11900 ΔflgK 敲除flgK的SCSIO 11900菌 本研究
11900 ΔflaA 敲除flaA的SCSIO 11900菌 本研究
SM9913 野生型, 分离自冲绳海槽附近1855m水深的沉积物 Qin et al, 2011
9913ΔmotAB 敲除motAB的SM9913菌 本研究
9913 ΔfliF 敲除fliF的SM9913菌 本研究
9913 ΔflgK 敲除flgK的SM9913菌 本研究
9913 ΔflaA 敲除flaA的SM9913菌 本研究
ΔLF 敲除侧生鞭毛基因簇的SM9913菌 本研究
ΔLFΔfliF 在ΔfliF中敲除侧生鞭毛基因簇基因的SM9913菌 本研究
ΔLFΔflgk 在ΔflgK中敲除侧生鞭毛基因簇基因的SM9913菌 本研究
ΔLFΔflaA 在ΔflaA中敲除侧生鞭毛基因簇基因的SM9913菌 本研究
WM3064 接合转移用的DAP营养缺陷型大肠杆菌, 37°C 实验室保存
基因敲除质粒 pK18mobsacB-Ery pK18mobsacB 质粒插入pHT304来源的红霉素抗性基因, Kanr, Eryr Wang et al, 2015
pK18Ery-11900 motAB pK18mobsacB-Ery 携带SCSIO 11900 motAB基因上下游片段 本研究
pK18Ery-11900 fliF pK18mobsacB-Ery 携带SCSIO 11900 fliF基因上下游片段 本研究
pK18Ery-11900 flgK pK18mobsacB-Ery 携带SCSIO 11900 flgK基因上下游片段 本研究
pK18Ery-11900 flaA pK18mobsacB-Ery 携带SCSIO 11900 flaA基因上下游片段 本研究
pK18Ery-9913 motAB pK18mobsacB-Ery 携带SM9913端生鞭毛 motAB基因上下游片段 本研究
pK18Ery-9913 fliF pK18mobsacB-Ery 携带SM9913端生鞭毛fliF基因上下游片段 本研究
pK18Ery-9913 flgK pK18mobsacB-Ery 携带SM9913端生鞭毛flgK基因上下游片段 本研究
pK18Ery-9913 flaA pK18mobsacB-Ery 携带SM9913端生鞭毛flaA基因上下游片段 本研究
pK18Ery-9913 LF pK18mobsacB-Ery 携带SM9913侧生鞭毛基因簇上下游片段 本研究

注: r指抗生素抗性; Kan指卡那霉素; Ery指红霉素

1.1.2 主要试剂

酶切载体所用的DNA限制性核酸内切酶购于NEB公司(New England Biolabs, 伊普斯威奇, 美国); 构建同源重组质粒使用的一步法非连接酶依赖型多片段快速克隆试剂盒(ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit)购于诺唯赞公司(南京, 中国); DNA片段回收和质粒提取试剂盒均购于Omega Bio-tek 公司(诺克罗斯, 美国); 基因组DNA提取试剂盒购于天根公司(北京, 中国), PCR (polymerase chain reaction)引物订购于天一辉远公司(武汉, 中国)合成, 抗生素购于生工(上海, 中国)。

1.2 敲除质粒的构建

基因敲除采用实验室前期建立的成熟方法(Wang et al, 2015)。每个基因的上游序列和下游序列分别用基因的up-F/R和down-F/R进行PCR扩增(表2), 模板为SCSIO 11900和SM9913的基因组。质粒pK18mobsacB -Ery用SphI和SalI进行双酶切, 然后用诺唯赞的一步法连接试剂盒进行连接, 采用化学转化法转化进WM3064感受态。用引物组合pK18mobsacB-F/R对得到的转化子进行PCR验证, 正确大小的PCR片段送天一辉远进行测序。
表2 实验中用到的引物

Tab. 2 Primers used in this study

名称 序列 用途
11900ΔmotAB-up-F ACATGCATGCGCTAATGCTGCGAT 用于敲除SCSIO 11900中的motAB
11900ΔmotAB-up-R CGGAATTCATTCCCTCCAAAGGTTTTAT
11900ΔmotAB-down-F CGGAATTCAATGACTTGGCTATGTACCT
11900ΔmotAB-down-R CTAG TCTAGATAAGTCACTGATCAATAAAC
11900ΔfliF-up-F ACATGCATGCGCTAATAAAGTTGCTCGATC 用于敲除SCSIO 11900中的fliF
11900ΔfliF-up-R CGGAATTCAATAATTCTCCACTACCTAGTT
11900ΔfliF-down-F CGGAATTCTCAAGAACAAAAACAACTACC
11900ΔfliF-down-R ACGCGTCGACGTACCAGCTGTCTTTCTGCT
11900ΔflgK-up-F ACATGCATGCTGGTGGTTTAACAGTCACGA 用于敲除SCSIO 11900中的flgK
11900ΔflgK-up-R CGGAATTCGTTACTCTACTCCTTGGCGG
11900ΔflgK-down-F CGGAATTCTTATGCGTTTATCAAATAACT
11900ΔflgK-down-R ACGCGTCGACCATTGAGGTTCAAACAATAA
11900ΔflaA-up-F GACTAACATTGCTTACCGCATGAA 用于敲除SCSIO 11900中的flaA
11900ΔflaA-up-R TTTACCATCTCCTAGATTTAAA
11900ΔflaA-down-F ACATAGATGTTAGATTTAAATGAT
11900ΔflaA-down-R TCCATTAGCAATACTAAATTCATT
9913ΔmotAB-up-F ACATGCATGC GCTAGTGCTGCGATCATTT 用于敲除SM9913中端生鞭毛的motAB
9913ΔmotAB-up-R CGGAATTCATTCCCTCCAAAGGTTTTA
9913ΔmotAB-down-F CGGAATTCAATGACTTGGCTATGTACCT
9913ΔmotAB-down-R CTAGTCTAGATTGCTCGATTACTTCATCA
9913ΔfliF-up-F AGAAACCTTGGCACGCTGCCA 用于敲除SM9913中端生鞭毛的fliF
9913ΔfliF-up-R AATAATTCTCCACTACCT
9913ΔfliF-down-F TCAAGAACAAAAACAACTACCTC
9913ΔfliF-down-R TCTTCTAAATTAGCAATACGC
9913ΔflgK-up-F ACATGCATGC GAATAGTCAATCTGAAGGG 用于敲除SM9913中端生鞭毛的flgK
9913ΔflgK-up-R CGGAATTC TTTACCATCTCCTAGTTTCA
9913ΔflgK-down-F CGGAATTC TTTAACAATAAGCTCTATACTTT
9913ΔflgK-down-R CTAG TCTAGA GATAATACTAACCGCTGCC
9913ΔflaA-up-F GTTAGGTGGTTAATAATAATTAAAA 用于敲除SM9913中端生鞭毛的flaA
9913ΔflaA-up-R ACGTTGTAGAATGTTTGATGACTATG
9913ΔflaA-down-F TTTAACAATAAGCTCTATACTTTA
9913ΔflaA-down-R TACCCTCTTAAATTACTGAAAAATT
9913LF-up-F ACATGCATGCGCAGTTCGTGCTCTAGGTAA 用于敲除SM9913中侧生鞭毛基因簇
9913LF-up-R CGGAATTC AAAATGTCGAAATAAAAGTT
9913LF-down-F CGGAATTC TAAATTTTTAGGATTACAACAA
9913LF-down-R ACGCGTCGACCAAGCATCAGTTGGCTAATA

注: F为正向引物, R为反向引物

1.3 接合转移

基因敲除采用实验室前期建立的成熟的方法(Wang et al, 2015)。将含有重组质粒的WM3064菌株(供体菌)和野生型的SCSIO 11900或SM9913(受体菌)培养至600nm的吸光度~1.0。将4mL的供体菌与1mL的受体菌进行混合, 用SWLB培养基洗涤3次, 每次 3000r·min-1离心5min。最后一次用100μL SWLB进行悬浮, 滴在含0.3mmol·L-1二氨基丙烯酸和1.5%琼脂的SWLB固体平板上, 将平板放在25℃静置培养8h。将细菌梯度稀释后涂布于含有红霉素和1.5%琼脂的SWLB固体平板上, 挑选成功结合转移的受体菌株。

1.4 基因敲除菌株的构建

将成功进行接合转移, 并含有自杀质粒的单交换菌株在25℃用SWLB培养基培养, 然后用引物对pK18-F/R进行PCR验证。接下来对验证正确的菌株, 进行双交换筛选, 采用含有15%蔗糖和1.5%琼脂的SWLB固体培养基进行筛选。将得到的菌株进行抗性的筛选和PCR验证, 并进行DNA测序。

1.5 细菌游动性检测

将野生型的假交替单胞菌和特定鞭毛基因敲除的突变菌株接种到SWLB培养基中, 25℃震荡培养过夜, 转速为200r·min-1。然后将1μL菌液垂直悬空点到游动性平板上(1%胰蛋白胨, 0.3%琼脂, 溶于海水), 在25℃培养箱中静置培养24h后取出平板进行拍照。

1.6 生物膜检测

细菌生物膜的检测采用96孔板法(Pratt et al, 1998)。将野生型的假交替单胞菌和特定鞭毛基因敲除的突变菌株接种到SWLB培养基中, 25℃震荡培养过夜, 转速为200r·min-1。然后接种到新鲜的SWLB培养基中, 600nm吸光度为0.1, 吸取稀释后的菌液至96孔板中, 每孔300μL, 放在25℃静置培养。培养特定时间后取出, 测定并记录600nm吸光度, 用清水冲洗未吸附到孔壁上细菌3次, 并将水分用吸水纸吸干。每孔分别加入300μL 0.1%的结晶紫进行染色20min, 然后用清水冲洗未吸附到生物膜上的多余的结晶紫3次, 并吸干水分。每孔分别加入300μL无水乙醇溶解吸附到生物膜中的结晶紫, 静置5min, 然后用酶标仪进行540nm的吸光度的测定, 在测定的时候设置酶标仪先震荡50s以确保结晶紫全部溶解, 此时测定的吸光度的高低可以代表对应菌株生物膜的绝对量。均一化的生物膜的计算公式为540nm吸光度/600nm吸光度。

1.7 透射电镜观察细菌鞭毛

将生长良好的野生型假交替单胞菌和特定鞭毛基因敲除的突变菌株用海水进行清洗3次, 每次清洗用3000r·min-1离心5min, 然后用海水将细菌浓度调整为108~109ind.·mL-1。将等量的细菌悬浊液与2%的磷钨酸钠水溶液混合, 制成混合菌悬液。用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。染色5min后, 用滤纸吸去余水, 待样品干燥后, 在光学显微镜下进行铜网的筛选, 挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。将铜网置于型号为H7650的日立透射电子显微镜(东京, 日本)下进行细菌和菌毛形态的观察并拍照。

1.8 不同海洋环境细菌中鞭毛系统的分析

不同海洋环境的假交替单胞菌属菌株的全基因组下载于NCBI, 用于鞭毛基因簇分析。分析中以SM9913的端生鞭毛和侧生鞭毛的蛋白序列进行BLASTP比对, 在基因组中比对到两个同源蛋白的菌株, 为潜在的含有两个鞭毛基因簇的菌株。对同源蛋白的上下游进行分析, 看其是否位于鞭毛基因簇内。

2 结果

2.1 表层SCSIO 11900为单端鞭毛菌而深海SM9913还具有侧生鞭毛

分离自南海珊瑚礁区的假交替单胞菌SCSIO 11900能形成大量的生物膜(Wang et al, 2017)。由于生物膜的形成与细菌鞭毛密切相关, 本研究首先通过透射电镜对该菌鞭毛进行了观察, 发现对数期(OD600为~1.0)的细菌的一端有一根直径为15~20nm, 长5~6μm的弯曲的鞭毛(图1a), 而细菌为典型的杆状菌, 长度为2~3μm, 宽度为~1μm。对SCSIO 11900的基因组进行分析, 发现它编码一套鞭毛合成基因簇, 包括基础小体、钩状体和丝状体的所有基因。而深海来源的假交替单胞菌SM9913除了编码端生鞭毛的基因簇, 还编码侧生鞭毛基因簇, 同时含有端生鞭毛和侧生鞭毛(Qin et al, 2011; Mi et al, 2015)。根据鞭毛的通用结构对SCSIO 11900和SM9913的端生鞭毛进行了模式图的绘制, 并标示出各部分代表性的蛋白(图1b)。
图1 假交替单胞菌SCSIO 11900鞭毛形态(a)与鞭毛模式图(b)

Fig. 1 Marine Pseudoalteromonas sp. SCSIO 11900 is cephalotricha. (a) Transmission Electron Microscope (TEM) images of SCSIO 11900 flagella; (b) structure model of SCSIO 11900 flagella.

2.2 端生鞭毛对表层SCSIO 11900和深海SM9913的游动性和生物膜至关重要

为了确定海洋假交替单胞菌鞭毛和细菌游动性的关系, 首先检测了SCSIO 11900的游动能力, 采用25‰ NaCl的高盐LB固体培养基和2.5‰ NaCl的低盐固体培养基, 结果发现SCSIO 11900在前者中游动能力非常强, 而在2.5‰ NaCl的LB中完全不能游动(图2a)。为了排除SCSIO 11900在低盐LB中的不游动是因为其不能在这种培养基中生长, 将细菌接种在这两种盐度的液体LB培养基中, 在25℃进行摇菌培养, 结果表明生长无差异, 低盐LB中SCSIO 11900细菌生长良好, 说明端生鞭毛介导的运动性也是Na+依赖的(González et al, 2010; Yang et al, 2018)。
图2 鞭毛基因敲除对细菌游动性的影响

a. SCSIO 11900在高盐LB培养基中游动, 在低盐LB培养基中不游动; b. 敲除鞭毛基因fliF和flgK后SCSIO 11900电镜图; c.野生型SCSIO 11900与端生鞭毛基因敲除的菌株在游动性平板上游动24h的情况

Fig. 2 Effects of flagella genes deletion on motility of SCSIO 11900. (a) SCSIO 11900 motile on high salt LB medium other than low salt LB medium; (b) Deletion flagella genes fliF and flgK resulted in the loss of motility of SCSIO 11900 cells; (c) Polar flagella mutant inhibits motility of SCSIO 11900. Wild type SCSIO 11900 and flagella destroyed mutant strains grew in LB medium containing 25‰ NaCl for 24h

接下来分别对SCSIO 11900鞭毛不同部位的基因进行敲除, 包括维持编码功能完整性的定子基因motAB和维持鞭毛结构完整的转子基因fliF、钩状体和丝状体间的连接基因flgK 和丝状体基因flaA。通过透射电子显微镜对敲除fliF和flgK的菌株进行观察, 发现∆filF和∆flgK菌株都无鞭毛, 表明敲除鞭毛基因导致SCSIO 11900鞭毛的缺失(图2b)。接下来, 对敲除这些基因的菌株在25‰的高盐LB固体平板上进行游动性检测, 发现无论是敲除鞭毛结构基因(flaK、flaA、fliF), 还是敲除功能基因(motAB), 都可以使SCSIO 11900完全丧失游动能力(图2c)。以上结果表明鞭毛结构和功能的完整性对SCSIO 11900的游动性至关重要。
为了研究鞭毛缺失对细菌生物膜形成的影响, 我们采用96孔板方法进行了生物膜测定。在细菌接种7h后对吸附在96孔板的生物膜进行了结晶紫染色, 然后用无水乙醇溶解结晶紫后测定其在540nm下的吸光度。与野生型SCSIO 11900(WT)相比, 只有敲除鞭毛定子基因motAB后生物膜的形成量显著降低(图3a)。接下来对同样条件下的细菌进行了生长的测定, 发现在620nm吸光度下敲除所有鞭毛基因的菌株的生长都显著低于野生型, 表明鞭毛缺失减弱细菌的生长能力(图3b)。同时, 将吸附在96孔内壁生物膜中的菌体和培养基中的菌体进行收集, 测定菌落形成单位(colony forming units, CFU), 发现分别敲除motAB, 转子基因filF, 钩状体和丝状体间的连接基因flgK 后细菌数量均显著降低(图3c), 但敲除丝状体基因flaA没有影响细菌数量, 可能是因为其位于鞭毛的末端, 对整个鞭毛结构的影响最小。最后, 用生长对生物膜进行了均一化, 结果显示分别敲除filF、flgK可显著促进生物膜的形成(图3d)。以上研究说明鞭毛的缺失会抑制SCSIO 11900菌株的生长, 但可促进生物膜的形成。
图3 鞭毛缺失对SCSIO 11900生长及生物膜形成的影响

野生型SCSIO 11900(wild type, WT)与鞭毛结构基因敲除后的细菌生长7h后, 对96孔板内壁上形成的生物膜进行结晶紫染色, 测定540nm(a)和620nm (b)的吸光度; 同时测定菌落形成单位数量(c), 并对a中的生物膜用b中的生长进行均一化(OD540/OD620) (d)。所有敲除菌株与野生型进行t-test分析, *表示P< 0.05, **表示P< 0.01

Fig. 3 Loss of flagella affects the growth and biofilm formation of SCSIO 11900. Wild type (WT) SCSIO 11900 and flagella destroyed mutant strains grew in LB medium containing 25‰ NaCl for 7h. (a) The biofilm attached on the inner surface of 96 well plate was stained with 0.1% crystal violet and absorbance was determined at 540 nm; (b) determined absorbance at 620 nm and (c) colony forming units (CFU); (d) The biofilm determined in a was normalized by growth in (b). Statistical analysis was performed using student t-test, and all mutant strains were compared to WT. P< 0.05 was shown with one asterisk and P< 0.01was shown with two asterisks

为了进一步研究端生鞭毛是否调控深海来源的假交替单胞菌的游动性和生物膜形成, 采用与SCSIO 11900相同操作, 对深海来源SM9913端生鞭毛的基因进行了敲除, 结果发现分别敲除motAB、fliF、flgK和flaA均能降低SM9913的游动性(图4a)。对野生型SM9913和端生鞭毛系统敲除菌株进行生长和生物膜形成能力的检测, 结果发现分别敲除端生鞭毛基因motAB和flgK降低细菌的生长, 而敲除fliF和flaA并不影响细菌绝对生物膜形成(图4b), 但分别敲除fliF, flgK和flaA显著降低细菌的生长(图4c), 将测得的绝对生物膜用生长进行均一化, 结果发现分别敲除fliF和flaA促进生物膜的形成, 而敲除motAB后抑制生物膜的形成, 敲除flgK后并不影响生物膜的形成(图4d)。这可能是因为侧生鞭毛弥补端生鞭毛敲除后的影响, 而motAB敲除对细菌的游动性和生长的影响均小于其他敲除菌株, 导致生物膜量降低。
图4 端生鞭毛缺失对SM9913游动性和生物膜形成的影响

a. 野生型SM9913与端生鞭毛基因敲除的菌株在游动性平板上游动24h的情况; b. 野生型SM9913与鞭毛结构基因敲除后的细菌生长24h后, 对96孔板内壁上形成的生物膜进行结晶紫染色, 测定540nm的吸光度; c. 测定620nm的吸光度; d. 对b中的生物膜用c中的生长进行了均一化(OD540/OD620)。所有敲除菌株与野生型进行t-test分析, *表示P< 0.05, **表示P< 0.01

Fig. 4 Polar flagella mutant affects motility and biofilm formation of SM9913. (a) Wild type SM9913 and flagella destroyed mutant strains grew in LB medium containing 3‰ agar and 25‰ NaCl for 24h; (b) Wild type SM9913 and flagella destroyed mutant strains grew in LB medium containing 25‰ NaCl in 96-well plate for 24h. The biofilm attached on the inner surface of each well was stained with 0.1% crystal violet and absorbance was determined at 540 nm; (c) Growth was determined as absorbance at 620 nm; (d) The biofilm determined in b was normalized by growth in c (OD540/OD620). Statistical analysis was performed using student t-test, and all mutant strains were compared to WT. P< 0.05 was shown with one asterisk and P< 0.01was shown with two asterisks

2.3 深海假交替单胞菌SM9913侧生鞭毛调控游动性而非生物膜形成

为了研究侧生鞭毛在细菌游动性和生物膜中的作用, 将野生型SM9913和端生鞭毛基因敲除菌株中的侧生鞭毛基因簇分别进行敲除, 结果发现单独敲除侧生鞭毛同样可以降低SM9913的游动性, 而且同时敲除端生鞭毛基因(motAB、flgK和flaA)和侧生鞭毛基因簇的菌株的游动性均低于单独敲除端生鞭毛基因和侧生鞭毛基因簇的菌株(图4a、图5a)。而在敲除fliF的基础上进一步敲除侧生鞭毛基因簇并没有进一步降低SM9913的游动性, 可能是因为单独敲除fliF时, 细菌的游动性已经降到很低。因此, SM9913的鞭毛系统包括端生鞭毛和侧生鞭毛, 对其游动性均有贡献。接下来, 生物膜形成能力检测发现无论敲除侧生鞭毛还是其编码的基因, 对SM9913的生长均无影响(图5b)。以上结果表明侧生鞭毛并不调控SM9913生物膜的形成。
图5 侧生鞭毛缺失对SM9913游动性和生物膜形成的影响

a. 野生型SM9913、破坏侧生鞭毛和同时破坏侧生和端生鞭毛的菌株在游动性平板上游动24h后的情况, LF代表具有侧生鞭毛; b. 野生型SM9913与鞭毛破坏的细菌生长24h后, 对生物膜进行了测定

Fig. 5 Loss of lateral flagella inhibits motility of SM9913, but has no effect on biofilm formation. (a)Wild type SM9913 and flagella destroyed mutant strains grew in LB medium containing 25‰ NaCl for 24h; (b) The biofilm attached on the inner surface of 96-well plate was stained with 0.1% crystal violet and normalized by growth

2.4 鞭毛系统广泛分布于海洋假交替单胞菌, 且部分菌株含两套鞭毛系统

为深入探讨这种鞭毛同时影响游动性和生物膜的现象在海洋假交替单胞菌中是否具有普遍性。对分离自不同海洋环境的菌株的基因组进行分析, 包括来自不同水深的海水、海洋沉积物、海洋动物(珊瑚、贻贝和海绵)和海草的假交替单胞菌(表3)。首先从NCBI下载相关细菌基因组, 然后对其鞭毛系统进行分析, 发现它们均编码一个鞭毛系统, 为端生鞭毛系统, 帮助细菌完成运动。然而, 分离自深海沉积物的SM9913和喀拉海低温海水的22718除了端生鞭毛系统外, 还含有一套侧生鞭毛系统, 很可能与这两株菌在各自生存环境中的群游运动有关。
表3 不同来源的海洋假交替单胞菌均含有端生鞭毛系统, 且部分含有侧生鞭毛系统

Tab. 3 Polar flagella exit in P. sp. isolated from different marine environments, and lateral flagella exit in partial strains

菌株 基因组NCBI序列号 端生鞭毛 侧生鞭毛 分离环境 参考文献
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P. rubra SCSIO 6842 CP013611/CP013612 + - 孟加拉湾150m深海水 Li et al, 2016
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P. tetraodonis UCD-SED8 LITK01000005 + - 海洋沉积物 Lee et al, 2015
P. haloplanktis TAC125 CR954246 + - 大西洋沿岸海水 Medigue et al, 2005
P. sp. PAMC 22718 AJTK00000000 + + 喀拉海低温海水 Park et al, 2012
P. sp. OCN003 CP011011 + - 夏威夷珊瑚礁区发病珊瑚 Beurmann et al, 2015
P. distincta ATCC 700518 NZ_JWIG01000001 + - 白令海的海绵 Givan et al, 2015
P. elyakovii ATCC 700519 JWIH00000000 + - 贻贝的体液 Givan et al, 2015
P. lipolytica UCD-48B LJTC01000005 + - 海草的叶子 Alexiev et al, 2016

3 讨论

本文分别以表层和深海假交替单胞菌为研究对象, 通过敲除鞭毛各组分的基因, 研究了它们对海洋细菌游动性和生物膜形成能力的影响。表层和深海假交替单胞菌都具有端生鞭毛, 而端生鞭毛能帮助细菌在液体环境中的游动寻找营养物质。我们的研究结果发现, 有两株细菌中的端生鞭毛功能缺失会降低细菌游动性并促进生物膜形成。这与之前报道中SM9913端生鞭毛调控细菌游动性的结果一致 (Mi et al, 2015)。我们对深海假交替单胞菌的研究发现, 生物膜形成过程不受侧生鞭毛影响, 而侧生鞭毛可帮助深海沉积物的细菌在沉积物表面蠕动 (Mi et al, 2015)。我们对其他9株假交替单胞菌的分析发现, 其中8株仅携带端生鞭毛, 而分离于喀拉海低温海水的P. sp. PAMC 22718还携带侧生鞭毛。侧生鞭毛是否与低温环境适应还需要系统的研究。
细菌通过鞭毛的旋转在液体内部或固体表面运动, 这种运动强弱变化通常由调控基因实现。细菌鞭毛蛋白可以分为三个部分, 第一部分为激活第二部分基因的转录调控因子, 第二部分为组成基础小体, 分泌机器和钩状体的蛋白, 第三部分为编码丝状体和马达的蛋白。控制第一部分的调控因子的表达可以决定第二部分基因是否表达和第三部分基因的表达与鞭毛的组装。本研究发现, 只要敲除基础小体、钩状体、丝状体和辅助旋转的定子基因中任何一部分, 都能显著降低表层和深海假交替单胞菌的游动性, 表明鞭毛各个组分的基因相互合作, 共同发挥作用。此外, 在寡营养的海洋环境中, 鞭毛对于假交替单胞菌寻找营养物质, 向高营养因子浓度环境运动发挥关键作用, 这可能与第三部分蛋白是细菌趋化性相关的受体和信号转导因子有关。
本研究发现敲除鞭毛基因后深海和表层假交替单胞菌的生长能力减弱, 表明其代谢活性降低, 而且游动性明显被抑制, 更易被胞外多糖等生物膜的胞外基质包围, 形成生物膜。而生物膜内细菌通常处于半休眠状态, 代谢缓慢, 处于低代谢活性状态, 同时游动能力极弱(D’Acunto et al, 2019)。因此, 通过靶向鞭毛基因提高海洋假交替单胞菌的生物膜形成能力, 实现生物膜的综合利用, 具有一定的应用前景。我们前期研究发现, 海洋假交替单胞菌的生物膜能够诱导生物矿化过程, 为金属表面提供长效保护, 并且富产胞外多糖的假交替单胞菌抗金属保护能力更强(Liu et al, 2018)。本研究中的鞭毛突变株能否促进生物矿化过程, 并应用于海洋工程防护, 还需要进一步探究。

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