Research on the steroids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3

SITU Meixia; LEI Zufa; YANG Qianru; DENG Shengyi; WU Kejian; CHEN Honghao; WEI Xia; FAN Hao; ZHANG Wei; ZHANG Cuixian

doi:10.11978/2022240

Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 161 - 170

DOI: https://doi.org/10.11978/2022240

Exploitation of Marine Resources

Research on the steroids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3

SITU Meixia ^,¹ ,
LEI Zufa ¹ ,
YANG Qianru ² ,
DENG Shengyi ¹ ,
WU Kejian ² ,
CHEN Honghao ² ,
WEI Xia ¹^,³ ,
FAN Hao ¹ ,
ZHANG Wei ^,² ,
ZHANG Cuixian ^,¹

Expand

1. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
2. The Middle School Attached to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
3. Pharmaceutical college, Guangxi Medicinal University, Nanning 530021, China

ZHANG Wei. email: 18011863076@163.com;

ZHANG Cuixian. email: zhangcuixian@gzucm.edu.cn

Received date: 2022-11-08

Revised date: 2022-12-06

Online published: 2022-12-08

Supported by

Special fund of Guangdong Provincial Department of Natural Resources for Promoting High-quality Economic Development (Marine Economic Development)(GDNRC[2021]48)

Special fund of Guangdong Provincial Department of Natural Resources for Promoting High-quality Economic Development (Marine Economic Development)(GDNRC[2020]039)

National Natural Science Foundation of China(82273845)

National Natural Science Foundation of China(81741160)

Guangzhou Youth Science and Technology Education Project(KP市2022027)

Fold

Abstract

In order to simulate the growth environment of microorganisms to change or increase the production of secondary metabolites in the presence of other microorganisms and protect the ecological environment of marine herbs, soft coral-associated two fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3 were cocultured on rice medium. Firstly, GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) method was used to analyze secondary metabolites. Then, the secondary metabolites were separated and purified by silica gel, ODS (Octadecylsilyl), Sephadex LH-20 and HPLC (Preparative High Performance Liquid Chromatography). Their structures were identified by HR-ESI-MS (High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectroscopy), NMR (Nuclear Magnetic Resonance), ORD (Optical Rotatory Dispersion) and the relative physical constants were compared with the literature. Ten steroids were obtained and identified as Chaxine C (1), Herbarulide (2), dankasterones A (3), 25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one (4), Ganodermasides D (5), Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (6), Ergosta-4,7,22-trien-3-one (7), Isocyathisterol (8), Stigmasta-4,22-dien-3-one (9) and β-sitostenone (10). Compounds 1~3 were steroids with oxidative rearrangement and 4, 5, 7 and 9 were firstly acquired from Aspergillus sp. compared with the single culture of EGF7-0-1 and EGF15-0-3. Based on the coculture strategy, the content types of steroids were more abundant.

Key words： soft coral; Aspergillus sp.; coculture; steroid

Cite this article

SITU Meixia , LEI Zufa , YANG Qianru , DENG Shengyi , WU Kejian , CHEN Honghao , WEI Xia , FAN Hao , ZHANG Wei , ZHANG Cuixian . Research on the steroids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(5) : 161 -170 . DOI: 10.11978/2022240

海洋是新颖甾体的重要来源, 这些甾体类化合物往往具有非常规的母核和侧链结构(Darmas et al, 2000), 表现出强抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗衰老和免疫抑制等多种生物活性(Chang et al, 2007; Ding et al, 2019; 肖细姬等, 2019; Liu et al, 2021)。文献调研表明甾体骨架上官能团变化可能使其生物活性发生显著变化, 高度氧化的甾体多具有抗氧化和抗肿瘤等活性(Sultana, 2018)。到目前为止, 已有100多个甾体类化合物被FDA批准应用于临床(Ren et al, 2019), 同时它们又被发现新的适应症, 如最初用于治疗超难治性癫痫状态的allopregnanolone (Vaitkevicius et al, 2017), 最近又通过了治疗产后抑郁症的Ⅲ期临床试验(Meltzer et al, 2018)。因此, 进一步发现骨架新颖、生物活性强的天然甾体化合物具有重要的化学、医药价值。

通过模拟目标菌株的自然生长环境进行微生物共培养, 既可以通过刺激目标菌株沉默基因的表达影响其次级代谢产物的生成(Okada et al, 2017), 又因为空间资源有限, 通过共培养菌株往往会形成竞争和拮抗关系, 而产生单培养中所没有的次生代谢产物, 且具良好活性(Oh et al, 2005)。课题组前期分别对两株海洋本草软珊瑚共附生真菌Aspergillus sp. EGF15-0-3和Aspergillus sp. EGF7-0-1进行单培养研究(刘炳新等, 2021; 黎咏怡等, 2022; Wei et al, 2022), 研究发现菌株EGF15-0-3主要产生二酮哌嗪类生物碱、二氢异香豆素、蒽醌、色酮及其杂合二聚体类化合物, 菌株EGF7-0-1主要产生γ-芳环丁烯内酯类、杂萜类、甾体类、聚酮类(他汀类)化合物; 而将两株真菌共培养后发现, 不仅代谢出丰富的杂萜类成分(蔡金旋等, 2022), 其甾体类成分也比EGF7-0-1单培养时丰富。对产生的甾体类成分进行研究, 目前共分离鉴定10个甾体类化合物(图1)。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图1 来源于两株曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养的甾体化合物1~10

Fig. 1 Steroids 1~10

1 试验部分

1.1 材料与试剂

试验过程中所涉及的仪器与试剂材料见表1, 真菌规模培养所用的大米培养基和PDB培养基的配制方法与蔡金旋等(2022)相同。

表1 试验所用仪器与试剂信息表

Tab. 1 Instruments and reagents used in the experiment

仪器/试剂	型号/规格	品牌
高分辨液质联用仪	Triple TOFTM 5600⁺	美国 AB SCIEX公司
核磁共振波谱仪	400 MHz AVANCE Ⅲ型	德国Bruker公司
高效液相色谱	QuikSep半制备型	北京慧德易科技有限公司
自动旋光仪	MCP 500	安东帕公司
紫外透射反射仪	WFH-201B	上海精科实业有限公司
超净工作台	SW-CJ-1FD	苏州净化设备厂
立式压力蒸汽灭菌器	LS-100H	江阴滨江医疗设备有限公司
电子天平	PWN224ZH	奥豪斯仪器(常州)有限制造公司
旋转蒸发器	XHRE-2000A	上海宵汉实业发展有限公司
低温冷却液循环泵	XHDLSB-5/25	上海宵汉实业发展有限公司
色谱柱a: Luna 分析柱	4.6mm×100mm, 5μm	美国Phenomenex公司
色谱柱b: YMC-Pack ODS-A半制备柱	10mm×250mm, 5μm	日本YMC Co.,Ltd.公司
色谱柱c: H& EC18半制备柱	10mm×250mm, 5μm	北京慧德易科技有限公司
常规柱层析硅胶	200~300目、300~400目	青岛海洋化工厂
Sephadex LH-20	YILIMART 500G	瑞典 cytiva公司
C-18反相色谱填料	YMC*GEL ODS-A-HG	日本 YMC公司
乙酸乙酯、石油醚、甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷和正丁醇	分析纯	广东光华科技股份有限公司
氘代氯仿	25G	美国剑桥CIT公司
葡萄糖	分析纯	天津致远化学试剂有限公司
技术琼脂粉	分析纯	广东环凯微生物科技有限公司
土豆、大米、海盐		购于市场

1.2 菌种的活化与规模培养

菌种活化: 用无菌接种环分别从EGF7-0-1和EGF15-0-3菌种液体石蜡斜面保存管中蘸取适量菌种, 在无菌PDB固体培养基中进行活化, 待培养基中长出单菌落后, 用接种环挑取单菌落于提前准备好的无菌PDB液体培养基中, 28℃下于恒温摇床(165r·min^-1)中培养2~3d, 分别获得两株真菌的种子液。

规模发酵: 用移液器分别吸取两株真菌的种子液(各5mL)于无菌大米培养基中对两种真菌进行混合培养, 28℃下静置培养35d, 共培养400瓶。

1.3 次生代谢产物的提取、分离与纯化

提取: 发酵完成后, 依次采用乙酸乙酯(EtOAc)和甲醇(MeOH)浸提, EtOAc提取液减压浓缩得EtOAc-1浸膏(1250g), MeOH提取液减压浓缩, 用水分散溶解后依次使用乙酸乙酯和正丁醇(n-BuOH)萃取, 分别减压浓缩后得EtOAc-2浸膏(50g)和n-BuOH浸膏(235g), EtOAc-1和EtOAc-2浸膏经薄层色谱(thin-layer chromatograph, TLC)和液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析后合并得EtOAc浸膏(1300g)。

分离与纯化: EtOAc浸膏(1300g)经硅胶柱层析, 以石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱、纯甲醇冲柱, TLC薄层跟踪合并后得11个流分: Fr.1 ~ Fr.11, 经核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和LC-MS共同分析后, 确定甾体目标流分为Fr.5和Fr.6。Fr.5 (72g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE, 体积比10:90→70:30)得到11个流份Fr.5-1 ~ Fr.5-11。Fr.5-8 (8.5g)经反相色谱(octadecylsilyl, ODS)柱层析(H₂O-MeOH, 体积比60:40→0:100)得到6个流份Fr.5-8-1 ~ Fr.5-8-6。Fr.5-8-3 (1.7g)经半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)(H₂O-MeOH, 体积比5:95, 流速2mL·min^-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱b)共得到15个流份Fr5-8-3-1 ~ Fr5-8-3-15, 其中得到化合物6 (τ_R=47min, 10mg)、7 (τ_R=48min, 19mg)、8 (τ_R=33min, 9.1mg)、9 (τ_R=60min, 9.2mg)和10 (τ_R=65min, 18mg)。Fr.6 (34.1g)经硅胶柱层析(EtOAc-PE, 体积比10:90→70:30)得到13个流份Fr.6-1 ~ Fr.6-13。Fr.6-7 (2g)经Sephadex LH-20 (150g)柱层析(CH₂Cl₂-MeOH, 体积比30:70)得到12个流份Fr.6-7-1 ~ Fr.6-7-12, 随后Fr.6-7-3 (189mg)经半制备HPLC (H₂O-MeOH, 体积比10:90, 流速2mL·min^-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱b)得到8个流份, 其中得到化合物1 (τ_R=22min, 5.5mg)、2 (τ_R=28min, 5mg)和3 (τ_R=40min, 3.3mg)。Fr.6-9 (2.5g)经Sephadex LH-20 (150g)柱层析(CH₂Cl₂-MeOH, 体积比30:70)得到12个流份Fr.6-9-1 ~ Fr.6-9-12, Fr.6-9-3 (300mg)经半制备HPLC (H₂O-MeOH, 体积比15:85, 流速2mL·min^-1, λ为210nm和250nm, 色谱柱c)得到10个流份Fr.6-9-3-1 ~ Fr.6-9-3-10, 其中得到化合物4 (τ_R=23min, 24mg)和5 (τ_R=58min, 14mg)。

1.4 物理常数与波谱数据

化合物1: 白色无定型粉末(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+50.1° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 441.2980 [M+H]⁺ (计算值: C₂₈H₄₁O₄⁺ 441.2960), 分子式C₂₈H₄₀O₄。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

表2 化合物 1~10的 ¹H NMR数据(400MHz, CDCl₃, δ_H, 多重峰mult, 偶合常数J in Hz)

Tab. 2 ¹H NMR Data of 1~10 in CDCl₃

No.	1	2	3	4	5
4	6.03, d, 10.1	5.74, s	6.36, s	5.74, s	5.88, s
6				6.04, d, 9.5	6.12, d, 9.6
7	5.64, d, 2.4	5.72, s	2.65, dd, 16.9, 1.5	6.60, d, 9.5	6.49, d, 9.6
9			2.81, t, 9.1
18	0.87, s	0.63, s	0.98, s	0.96, s	0.96, s
19	1.47, s	1.23, s	1.26, s	0.99, s	1.11, s
21	1.02, d, 6.6	1.02, d, 6.6	1.09, d, 7.1	1.08, d, 6.7	1.08, d, 6.7
22	5.14, dd, 15.3, 8.4	5.14, dd, 15.3, 8.4	5.24, dd, 15.2, 6.0	5.34, dd, 15.2, 7.6	5.20, dd, 15.3, 7.9
23	5.26, dd, 15.3, 7.7	5.25, dd, 15.2, 7.6	5.28, d, 15.2, 6.1	5.39, dd, 15.2, 7.8	5.27, dd, 15.3, 7.2
26	0.84, d, 6.8	0.82, d, 6.8	0.81, d, 6.8	1.14, s	0.83, d, 6.8
27	0.82, d, 6.8	0.82, d, 6.8	0.83, d, 6.8	1.17, s	0.85, d, 6.8
28	0.91, d, 6.8	0.91, d, 6.8	0.91, d, 6.8	1.01, d, 6.7	0.93, d, 6.9
No.	6	7	8	9	10
4	5.73, s	5.79, d, 2.0	5.72, s	5.72, s	5.71, s
6	6.03, d, 9.5		6.09, d, 9.6
7	6.61, d, 9.5		6.16, d, 9.6
18	0.96, s	0.60, s	1.02, s	0.73, s	0.70, s
19	0.99, s	1.17, s	1.32, s	1.18, s	1.17, s
21	1.06, d, 6.7	1.03, d, 6.6	0.99, d, 6.6	1.02, d, 6.6	.91, d, 6.5
22	5.26, dd, 15.2,7.1	5.16, dd, 15.2, 7.7	5.12, dd, 15.3, 8.2	5.15, dd, 15.2, 8.5
23	5.20, dd, 15.2,7.8	5.23, dd, 15.2, 6.9	5.22, dd, 15.3, 7.6	5.02, dd, 15.2, 8.5
26	0.83, d, 6.8	0.82, d, 6.5	0.82, d, 6.8	0.84, d, 6.3	0.83, d, 6.8
27	0.85, d, 6.8	0.84, d, 6.5	0.83, d, 6.8	0.79, d, 6.3	0.82, d, 6.8
28	0.93, d, 6.9	0.91, d, 6.5	0.91, d, 6.8
29				0.80, t, 7.3	0.84, t, 7.3

表3 化合物 1~10的 ¹³C NMR数据(100MHz, CDCl₃, δ_C, type)

Tab. 3 ¹³C NMR Data of 1~10 in CDCl₃

No.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	32.1, t	33.9, t	39.0, t	34.1, t	27.6, t	34.3, t	33.2, t	35.2, t	35.7, t	35.7, t
2	24.8, t	33.2, t	34.5, t	34.1, t	34.0, t	34.3, t	34.3, t	33.8, t	34.0, t	32.1, t
3	148.8, d	198.4, s	199.3, s	199.7, s	199.5, s	199.7, t	199.6, s	199.9, s	199.7, s	199.8, s
4	128.1, d	114.7, d	126.7, d	123.2, d	126.4, d	123.1, d	122.8, d	125.3, d	123.8, d	123.7, d
5	195.8, s	173.9, s	156.2, s	124.7, s	161.4, s	124.6, s	169.2, s	163.5, s	171.7, s	171.9, s
6	164.3, d	162.4, s	200.2, s	124.7, d	124.8, d	124.6, d	33.2, t	128.2, d	33.0, t	33.0, t
7	117.5, d	113.3, d	41.0, t	134.1, d	130.9, d	134.2, d	115.7, d	139.4, d	32.0, t	33.9, t
8	156.2, s	159.5, s	62.3, s	164.5, s	126.7, s	164.5, s	139.7, s	71.9, s	35.6, d	35.6, d
9	204.6, s	47.2, d	49.5, d	44.5, d	72.6, s	44.5, d	45.9, d	53.3, d	53.8, d	53.8, d
10	81.2, s	40.4, s	36.1, s	36.9, s	42.4, s	36.9, s	38.2, s	36.3, s	38.6, s	38.7, s
11	39.0, t	25.4, t	25.3, t	19.0, t	25.5, t	19.1, t	22.1, t	18.0, t	21.0, t	21.0, t
12	38.0, t	39.1, t	38.5, t	35.6, t	32.1, t	35.7, t	39.1, t	40.9, t	39.5, t	39.4, t
13	46.5, s	47.0, s	54.1, s	44.2, s	44.6, s	44.1, s	43.5, s	44.2, s	42.3, s	42.5, s
14	57.9, d	58.1, d	215.0, s	155.7, s	158.3, s	156.3, s	55.1, d	57.2, d	56.0, d	56.0, d
15	21.9, t	22.6, t	38.1, t	25.3, t	25.7, t	25.5, t	23.0, t	19.1, t	24.3, t	24.2, t
16	29.1, t	27.7, t	23.3, t	27.7, t	27.8, t	27.9, t	28.2, t	28.2, t	28.9, t	28.2, t
17	55.3, d	56.3, d	49.5, d	55.6, d	55.7, d	55.8, d	55.9, d	56.6, d	55.9, d	55.9, d
18	12.1, q	12.5, q	17.2, q	19.1, q	17.9, q	19.1, q	12.3, s	14.6, q	12.2, q	12.0, s
19	21.9, q	20.0, q	24.2, q	16.8, q	20.9, q	16.8, q	21.4, q	19.0, q	17.4, q	19.0, s
20	40.1, d	40.2, d	37.4, d	39.5, d	39.3, d	39.4, d	40.6, d	39.9, d	40.5, d	36.1, d
21	21.0, q	21.0, q	23.8, q	21.2, q	21.3, q	21.4, q	21.2, q	20.7, q	19.0, q	18.7, q
22	134.6, d	134.7, d	132.5, d	138.4, d	134.9, d	135.2, d	135.6, d	135.4, d	138.1, d	34.0, t
23	132.9, d	132.8, d	135.3, d	129.9, d	132.9, d	132.7, d	132.4, d	132.3, d	129.5, d	29.1, t
24	42.8, d	42.8, d	43.4, d	48.3, d	43.0, d	43.0, d	42.9, d	43.0, d	51.2, d	45.8, d
25	33.0, d	33.1, d	33.2, d	72.5, s	33.2, d	33.2, d	33.0, d	33.2, d	31.9, d	26.1, d
26	19.7, q	20.0, q	19.8, q	27.1, q	19.8, q	20.1, q	20.1, q	19.8, q	21.2, q	17.4, q
27	20.0, q	19.6, q	20.2, q	26.6, q	20.1, q	19.8, q	19.8, q	20.1, q	21.1, q	19.8, q
28	17.6, q	17.6, q	17.1, q	15.8, q	17.8, q	17.8, q	17.7, q	17.8, q	25.4, t	23.1, t
29									12.3, q	12.0, q

化合物2: 无色片状结晶(MeOH), 熔点: 139~141℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+169.2° (c 0.1, CH₂Cl₂), HR-ESI-MS: m/z 425.3039 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₃⁺ 425.3011), 分子式C₂₈H₄₀O₃。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物3: 黄色油状物, $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+60.2° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 425.3030 [M+H] ⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₃⁺ 425.3011), 分子式C₂₈H₄₀O₃。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物4: 黄色无定型粉末(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+560.1° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 409.3076 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₂⁺ 409.3062), 分子式C₂₈H₄₀O₂。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物5: 黄色油状物, $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+287.3° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 409.3089 [M+H] ⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₂⁺ 409.3062), 分子式C₂₈H₄₀O₂。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物6: 黄色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+582.6° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 393.3127 [M+H]⁺ (计算值: C₂₈H₄₁O⁺ 393.3113), 分子式C₂₈H₄₀O。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物7: 无色针状结晶(MeOH), 熔点: 112~114℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+9.1° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 395.3295 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₃O⁺ 395.3269), 分子式C₂₈H₄₂O。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物8: 白色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+64.2° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 411.3237 [M+H]⁺ (计算值: C₂₈H₄₃O₂⁺ 411.3218), 分子式C₂₈H₄₂O₂。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物9: 白色固体(MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+39.6° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 411.3606 [M+H]⁺ (计算值: C₂₉H₄₇O⁺ 411.3582), 分子式C₂₉H₄₆O。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

化合物10: 无色针状结晶(MeOH), 熔点: 67~69℃ (MeOH), $\left[ \alpha \right]_{D}^{25}~$+62.2° (c 0.1, CHCl₃), HR-ESI-MS: m/z 413.3747 [M+H]⁺(计算值: C₂₉H₄₉O⁺ 413.3739), 分子式C₂₉H₄₈O。¹H和¹³C NMR数据见表2和表3。

1.5 LC-MS分析及GNPS建立

样品配制: 取两株真菌共培养、EGF7-0-1单培养、EGF15-0-3单培养浸膏配制成1.0mg·mL^-1甲醇溶液, 备用。

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)条件: 流动相、流速和柱温等与文献(蔡金旋等, 2022)相同, 进样量为5μL, 色谱柱a, 将样品于Triple TOFTM5600⁺质谱中测试。

质谱(mass spectrometry, MS)条件: 离子喷雾电压、雾化器压力、辅助气压力、气帘气压力、离子源温度、碰撞能量、扩散碰撞能量、去簇电压、飞行时间质谱(TOF-MS)分子量扫描范围等条件与文献(蔡金旋等, 2022)相同。

全球天然产物分子网络(global natural products social molecular networking, GNPS)构建方法: 二级质谱原始数据文件(.wiff格式)通过MSConver软件转换成网络可识别的格式(.mzXML格式), 将转换后的数据通过FileZilla软件提交至GNPS数据中转站, 登录GNPS网站服务器(https://gnps.ucsd.edu), 按要求设置参数(cosine值为0.8, 最低匹配峰值为6, 母体离子质量差为±0.02Da, 碎片离子质量差为±0.02Da)建立GNPS分子网络图, 生成数据后导出采用Cytoscape软件进行分析。

LC-MS分析方法: 使用peakview软件进行目标性筛查, 通过peakview软件打开质谱原始数据文件, 显示总离子流图(total ion chromatography, TIC)图, 根据目标化合物的分子式和离子化形式提取粗流份中的目标峰(显示相应的RT值、Error Da和Formula等信息)。以此方法确定甾体化合物在3种培养基中的存在情况。

数据分析处理软件: GNPS分析采用ProteoWizard (MS Conver)、FileZilla和Cytoscape。LC-MS分析采用Triple TOFTM5600⁺质谱系统自配的peakview和analysis数据处理软件。

2 结果及分析

2.1 结构解析

化合物1: HR-ESI-MS m/z 441.2980 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₄⁺ 441.2960), ¹³C NMR和无畸变极化转移增强谱图(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, DEPT)信息显示28个碳(7个 C、9个 CH、6个 CH₂和 6个 CH₃), 确定1的分子式为 C₂₈H₄₀O₂, 不饱和度为9。NMR信息提示1含有1个长程共轭酮酯羰基(δ_C 164.3, s, C-6、117.5, d, C-7、156.2, s, C-8、204.6, s, C-9; δ_H 5.64, d, 2.4, 1H, H-7)、1个α,β-共轭酮羰基(δ_C148.8, d, C-3、128.1, d, C-4、195.8, s, C-5; δ_H 6.86~6.91, m, 1H, H-3、6.03, d, 10.1Hz, 1H, H-4)、1个三取代双键(δ_C 134.6, d, C-22、132.9, d, C-23; δ_H 5.14, dd, 15.3, 8.4Hz, 1H, H-22、5.26, dd, 15.3, 7.7Hz, 1H, H-23)、1个连氧且不含氢原子的碳(δ_C 81.2, s, C-10)、6个麦角甾体特征甲基(δ_C12.1, q, C-18、21.9, q, C-19、21.0, q, C-21、19.7, q, C-26、20.0, q, C-27、17.6, q, C-28; δ_H 0.87, s, 3H, H₃-18、1.47, s, 3H, H₃-19、1.02, d, 6.6Hz, 3H, H₃-21、0.84, d, 6.8Hz, 3H, H₃-26、0.82, d, 6.8Hz, 3H, H₃-27、0.91, d, 6.8Hz, 3H, H₃-28), 除此外无任何不饱和度信息, 说明该化合物含有3个环, 推测其为发生了氧化重排的麦角甾类化合物(Mccloskey et al, 2017)。将1的NMR信息与Chaxine C对照(Choi et al, 2009; Hirata et al, 2017), 二者基本一致, 确定1为Chaxine C。

化合物2: HR-ESI-MS m/z 425.3039 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₃⁺ 425.3011), ¹³C NMR和DEPT信息显示28个碳(6个C、10个CH、6个CH₂和6个CH₃), 确定其分子式为C₂₈H₄₀O₃, 不饱和度为9。根据NMR信息提示结构中含有1个氧取代α,β-共轭酮羰基(δ_C 198.4, s, C-3、114.7, d, C-4和δ_C 173.9, s, C-5; δ_H 5.74, s, 1H, H-4)和1个α,β-共轭内酯基(δ_C 162.4, s, C-6、113.3, d, C-7和δ_C 159.5, s, C-8; δ_H 5.72, s, H-7), 推测其亦为高度氧化重排的麦角甾类化合物(Krohn et al, 1999)。将2的NMR信息与herbarulide对照(Duecker et al, 2020), 二者基本一致, 确定2为herbarulide。

化合物3: HR-ESI-MS m/z 425.3030 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₃⁺ 425.3011), ¹³C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个 C、8个 CH、7个 CH₂和 6个 CH₃), 确定其分子式为C₂₈H₄₀O₃, 不饱和度为9。NMR信息提示结构中有1个长程α,β-共轭双酮羰基(δ_C199.3, s, C-3、26.7, d, C-4、156.2, s, C-5、200.2, s, C-6; δ_H 6.36, s, 1H, H-4)、1个孤立酮羰基(δ_C 215.0, s, C-14)、1个三取代双键(δ_C 1132.5, d, C-22、135.3, d, C-23; δ_H5.24, dd 15.2, 6.1Hz, 1H, H-22、5.28, d, 15.2, 6.0Hz, 1H, H-23), 提示该化合物含有4个环。严格分析3的NMR数据发现增加了1个明显向低场移动的饱和季碳信息(δ_C 62.3, s, C-8), 提示其可能环结构发生改变且高度氧化重排的麦角甾类化合物(Hu et al, 2017)。将3的NMR信息与Dankasterone A对照(Amagata et al, 2007), 二者基本一致。故确定3为Dankasterone A。

化合物4: HR-ESI-MS: m/z 409.3076 [M+H]⁺ (计算值: C₂₈H₄₁O₂⁺ 409.3062), ¹³C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个C、9个CH、6个CH₂和 6个CH₃), 确定其分子式为C₂₈H₄₀O₃, 不饱和度为9。NMR信息提示4含有1个长程共轭酮羰基(δ_C199.7, s, C-3、123.2, d, C-4、124.7, s, C-5、124.7, d, C-6、134.1, d, C-7、164.5, s, C-8、155.7, s, C-14; δ_H5.74, s, 1H, H-4、6.04, d, 9.5Hz, 1H, H-6、6.60, d, 9.5Hz, 1H, H-7)、1个三取代双键(δ_C 138.4, d, C-22、129.9, d, C-23; δ_H 5.34, dd, 15.2, 7.6Hz, 1H, H-22、5.39, dd, 15.2, 7.8Hz, 1H, H-23)、1个连氧且不含氢原子的碳(δ_C 72.5, s, C-25)以及6个麦角甾体特征甲基。说明其为麦角甾类化合物(Duecker et al, 2019)。将4的NMR数据与25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one对照(Fujimoto et al, 2004), 二者基本一致, 确定4为25-hydroxyergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。

化合物5: HR-ESI-MS: m/z 409.3089 [M+H]⁺(计算值: C₂₈H₄₁O₂⁺ 409.3062), ¹³C NMR和DEPT信息提示28个碳(7个C、9个CH、6个CH₂和6个CH₃), 确定其分子式为C₂₈H₄₀O₂, 不饱和度为9。将5的NMR数据与4对比, 二者结构中碳的类型均相同, 但¹H NMR中2个甲基由单峰(4: δ_H1.14, H₃-26和δ_H 1.17, H₃-27)变成了双峰(5: δ_H 0.83, d, 6.8Hz, 3H, H₃-26和δ_H 0.85, d, 6.8Hz, 3H, H₃-27), 且其化学位移向高场移动, 推测其可能是结构中羟基位置发生了改变(Fujmoto et al, 2004)。将5的NMR数据与Ganodermasides D对照(Weng et al, 2011), 二者基本一致, 确定5为Ganodermasides D。

化合物6、7和8的HR-ESI-MS、¹³C NMR及DEPT谱信息确定其分子式依次为C₂₈H₄₀O、C₂₈H₄₂O和C₂₈H₄₂O₂, 不饱和度依次为9、8和8。将6 ~ 8的NMR数据与5对比, 它们十分相似。6比5少了1个连氧且不含氢原子的碳(5: δ_C72.9, s, C-9)而多了1个次甲基信息(6: δ_C 44.5, d, C-9; δ_H2.14, m, H-9)。将6的NMR数据与Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (Quang et al, 2008)对照, 二者基本一致, 确定6为Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one。7比5缺少1个连氧且不含氢原子的碳(5: δ_C72.6, s, C-9)信息。将7的数据与Ergosta-4,7,22-trien-3-one进行对比(Zhang et al, 2009), 二者基本一致, 确定7为Ergosta-4,7,22-trien-3-one。而8比5少了1个四取代双键(5: δ_C 126.7, s, C-8、158.3, s, C-14), 将8的NMR数据与Isocyathisterol对照(Chan et al, 2014), 二者基本一致, 确定8为Isocyathisterol。

化合物9: HR-ESI-MS: m/z 411.3606 [M+H]⁺(计算值: C₂₉H₄₇O⁺ 411.3582), ¹³C NMR和DEPT信息提示29个碳(4个C、10个CH、9个CH₂和6个CH₃), 确定其分子式为C₂₉H₄₆O, 不饱和度为7。NMR信息提示9同样具有甾体类化合物典型的角甲基信息(δ_C12.2, q, C-18、17.4, q, C-19; δ_H0.73, s, 3H, H₃-18、1.18, s, 3H, H₃-19)。将9的NMR数据与7相比, 发现9消失了1个双键信号, 同时1个甲基也从双峰(7: δ_H 0.91, d, 6.5Hz, 3H, H₃-28)裂分成三重峰(9: δ_H0.80, t, 7.3Hz, 3H, H₃-29), 暗示9为豆甾类化合物(Migliuol et al, 1990)。将9的NMR数据与Stigmasta-4,22-dien-3-one (Wang et al, 2015)对照, 二者基本一致, 确定9为Stigmasta-4,22-dien-3-one。

化合物10: HR-ESI-MS: m/z 413.3747 [M+H]⁺ (计算值: C₂₉H₄₇O⁺ 413.3739)、¹³C NMR和DEPT信息提示29个碳(4个C、8个CH、11个CH₂、6个CH₃), 确定其分子式为C₂₉H₄₈O, 不饱和度为6。与9的NMR对比, 二者十分相似, 仅比9少了1个双键信息(9: δ_C138.1, d, C-22、129.5, d, C-23; δ_H5.15, dd, 15.2, 8.5Hz, H-22、5.02, dd, 15.2, 8.5Hz, H-23), 多了2个亚甲基(10: δ_C34.0, t, C-22、29.1, t, C-23)信息。将10的数据与β-sitostenone对比(Lee et al, 2008), 二者基本一致, 确定10为β-sitostenone。

2.2 菌株共培养和单培养中甾体类化合物的分析

观察共培养菌株生长状态(图2), 发现在第1周内两株真菌生长速度相当, 第1周后EGF7-0-1逐渐占据空间中的有限资源, 成为优势菌株, 而生长后期肉眼基本观察不到EGF15-0-3。将两株真菌共培养及其单培养所得粗流份进行LC-MS分析(图3), 化合物7和10在EGF7-0-1的TIC图中不存在, 化合物1、3、4和5在EGF15-0-3单培养的TIC图中均不存在, 因此两株真菌共培养能诱导出更丰富的甾体类化合物。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图2 共培养曲霉属真菌不同时间生长图片(土黄色菌落为EGF7-0-1, 灰绿色菌落为EGF15-0-3)

Fig. 2 Growth pictures of co-cultured Aspergillus sp. at different times (earthy yellow is EGF7-0-1, grayish green is EGF15-0-3)

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图3 两株真菌共培养(蓝色曲线)、EGF7-0-1单培养(粉色曲线)、EGF15-0-3单培养(红色曲线)的TIC对比图

Fig. 3 TIC comparison of the cocultivation, the single culture of EGF7-0-1or EGF15-0-3 (The blue curve is the cocultivation, the pink curve is the single culture of EGF7-0-1, and the red curve is the single culture of EGF15-0-3)

将菌株单培养、共培养的MS数据建立GNPS, 分子笼(cluster)中每个节点(node)的不同颜色代表化合物的不同来源。对分离得到的甾体化合物进行分子笼分析(图4b), 可直观看出共培养可产生较为丰富甾体类, 且多在菌株共培养和EGF7-0-1单培养中出现, 而在菌株EGF15-0-3中很少出现。同时分析GNPS的成笼特点发现两株真菌的共培养与EGF7-0-1单培养能形成的分子笼较多, 而菌株EGF15-0-3单培养多单独成笼, 说明菌株共培养与菌株EGF7-0-1单培养两者次生代谢产物类型的相似度较大; 而菌株EGF15-0-3单培养时次生代谢产物类型与前2种培养情况差别较大, 图3中也观察到此特点, 其原因可能为共培养时生长后期, 菌株EGF7-0-1为优势生长, 几乎占据所有培养空间, 而菌株EGF15-0-3基本消失。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图4 两株真菌共培养、EGF15-0-3单培养、EGF7-0-1单培养的GNPS分析

a. 总图; b. 甾体类成分分子笼放大图, 节点里的数字表示母离子质量

Fig. 4 GNPS analysis of the cocultivation, the single culture of EGF7-0-1 and the single culture of EGF15-0-3. (a) general view; (b) enlarged view of molecular cage of isolated components, the number in the node represents parent mass

3 结论

本文从两株海洋本草软珊瑚共附生曲霉属真菌Aspergillus sp. EGF7-0-1和Aspergillus sp. EGF15-0-3的大米共培养中分离得到10个甾体类化合物。化合物1~3均为高度氧化重排的甾体类化合物, 此类化合物最早主要来源于大型真菌: 如茶树菇(Agrocybe chaxingu)(Choi et al, 2009)、樟芝(Antrodia camphorate)(Lee et al, 2014)、炭棒菌(Xylaria allantoidea)(Mccloskey et al, 2017)等; 此后陆续从海洋和陆生不同种属的共附生及内生微生物中报道, 如Phyllosticta capitalensis (Zhu et al, 2021)、Aspergillus terreus (Li et al, 2020)和Diaporthe sp. (Li et al, 2015), 说明其来源广泛。该类甾体化合物具有较好抗肿瘤与抗氧化活性(Choi et al, 2009; Sultana, 2018)。化合物1对海拉细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HT29)、人结肠癌细胞(HCT116)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和非洲绿猴肾细胞(Vero)肿瘤细胞株的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)值依次为5.09、5.70、7.95、8.57、8.30μmol·L^-1 (Chan et al, 2014); 化合物3对直肠癌细胞株(CT-26)的IC₅₀值为6.7μmol·L^-1 (Lee et al, 2014)。化合物4、5、7和9首次从曲霉属真菌中分离得到。对两株曲霉属真菌单培养及共培养成分进行分析发现: 二者共培养较单培养时产生更丰富的甾体类化合物, 且共培养与菌株EGF7-0-1单培养的化合物类型相似度较高, 与菌株EGF15-0-3单培养时次生代谢产物类型差别较大(EGF15-0-3在大米培养基上单培养时主要产生吲哚二酮哌嗪类生物碱、吲哚二酮哌嗪-苯甲醛杂合二聚体及苯骈色满类化合物)(Wei et al, 2022), 是否与共培养后期EGF7-0-1占据优势生长相关有待进一步研究。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within

[1]

蔡金旋, 冯冉奇, 韦霞, 等, 2022. 两株软珊瑚共附生曲霉属真菌 EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养中杂萜类成分研究[J]. 中国海洋药物, 41(4): 1-8.

CAI

JINXUAN

, FENG

RANQI

, WEI

XIA

, et al, 2022. Research on the meroterpenoids from the coculture of soft coral-associated fungi Aspergillus sp. EGF7-0-1 and EGF15-0-3[J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 41(4): 1-8 (in Chinese with English abstract).

[2]

黎咏怡, 蔡金旋, 方越, 等, 2022. 南海软珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp. EGF15-0-3中色酮、蒽醌及其二聚体类化合物[J]. 中山大学学报, (4): 70-78.

YONGYI

, CAI

JINXUAN

, FANG

YUE

, et al, 2022. Xanthones, anthraquinone and their dimers from soft coral-associated symbiotic and epiphytic fungi Aspergillus sp. EGF15-0-3[J]. Journal of Sun Yat-sen University, (4): 70-78 (in Chinese with English abstract).

[3]

刘炳新, 韦霞, 肖细姬, 等, 2021. 南海软珊瑚共附生真菌 Aspergillus sp. EGF15-0-3苯甲醛类化合物研究[J]. 热带海洋学报, 40(4): 63-69.

DOI

LIU

BINGXIN

, WEI

XIA

, XIAO

XIJI

, et al, 2021. Research on benzaldehydes from the soft coral-associated symbiotic fungus Aspergillus sp. EGF15-0-3[J]. Journal of Tropical Oceanography, 40(4): 63-69 (in Chinese with English abstract).

[4]	肖细姬, 邓芸, 谢路凤, 等, 2019. 柳珊瑚 Leptogorgia rigida中甾体类成分研究[J]. 热带海洋学报, 39(4): 64-69. XIAO XIJI, DENG YUN, XIE LUFENG, et al, 2019. Research on Sterols from Leptogorgia rigida[J]. Journal of Tropical Oceanography, 39(4): 64-69 (in Chinese with English abstract).

[5]	AMAGATA T, TANAK M, YAMADA T, et al, 2007. Variation in cytostatic constituents of a sponge-derived Gymnascella dankaliensis by manipulating the carbon source[J]. Journal of Natural Products, 70(11): 1731-1740. DOI

[6]	CHAN YUYI, JUANG SHINHUN, HUANG GUANJHONG, et al, 2014. The constituents of michelia compressa var. formosana and their bioactivities[J]. International Journal of Molecular Sciences, 15(6): 10926-10935. DOI

[7]	CHANG HUICHIU, CHANG FANGRONG, WANG YUCHU, et al, 2007. A bioactive withanolide Tubocapsanolide A inhibits proliferation of human lung cancer cells via repressing Skp2 expression[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 6(5): 1572-1578. DOI

[8]	CHOI J H, AKIHIRO O, NOBUO A, et al, 2009. Chaxines B, C, D, and E from the edible mushroom Agrocybe chaxingu[J]. Tetrahedron, 65(47): 9850-9853. DOI

[9]	DARMAS H T, MOOTOO B S, REYNOLDS W F, et al, 2000. Steroidal compounds from the Caribbean Octocoral Eunicea laciniata[J]. Journal of Natural Products, 63(12): 1669-1671. DOI

[10]	DING KANG, TAN YANYAN, DING YANG, et al, 2019. β-Sitosterol improves experimental colitis in mice with a target against pathogenic bacteria[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 120(4): 5687-5694. DOI PMID

[11]	DUECKER F L, HEINZE R C, MUELLER M, et al, 2020. Synthesis of the alleged structures of fortisterol and herbarulide and structural revision of herbarulide[J]. Organic Letters, 22(4): 1585-1588. DOI PMID

[12]	DUECKER F L, REU F, HERETSCH P, 2019. Rearranged ergostane-type natural products: chemistry, biology, and medicinal aspects[J]. Organic & Biomolecular Chemistry. 17(7): 1624-1633.

[13]	FUJIMOTO H, NAKAMURA E, OKUYAMA E, et al, 2004. Six immunosuppressive features from an ascomycete, Zopfiella longicaudata, found in a screening study monitored by immunomodulatory activity[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 52(8): 1005-1008. DOI

[14]	HIRATA Y, NAKAZAKI A, KAWAGISHI H, et al, 2017. Biomimetic synthesis and structural revision of chaxine B and its analogues[J]. Organic Letters, 19(3): 560-563. DOI PMID

[15]	HU ZHENGXI, WU YE, XIE SHUANGSHUANG, et al, 2017. Phomopsterones A and B, Two functionalized ergostane-type steroids from the endophytic fungus Phomopsis sp. TJ507A[J]. Organic Letters, 19(1): 258-261. DOI

[16]	KROHN K, BIELE C, AUST H J, et al, 1999. Herbarulide, a ketodivinyllactone steroid with an unprecedented homo-6-oxaergostane skeleton from the endophytic fungus Pleospora herbarum[J]. Journal of Natural Products, 62(4): 629-630. DOI

[17]	LEE K, KIM M A, LEE S Y, et al, 2008. Phytochemical constituents of Schizonepeta tenuifolia Briquet[J]. Natural Product Sciences, 14(2): 100-106.

[18]	LEE T H, CHEN C C, CHEN J J, et al, 2014. New and cytotoxic components from Antrodia camphorate[J]. Molecules, 19(12): 21378-21385. DOI

[19]	LI GANG, KUSARI S, KUSARI P, et al, 2015. Endophytic Diaporthe sp. LG23 produces a potent antibacterial tetracyclic titerpenoid[J]. Journal of Natural Products, 78(8): 2128-2132. DOI

[20]	LI HONGLEI, LI XIAOMING, YANG SUIQUN, et al, 2020. Induced terreins production from marine red algal-derived endophytic fungus Aspergillus terreus EN-539 co-cultured with symbiotic fungus Paecilomyces lilacinus EN-531[J]. Journal of Antibiotics, 73(2): 108-111. DOI

[21]	LIU LIN, DUAN FANGFANG, GAO YING, et al, 2021. Aspersteroids A-C, three rearranged ergostane-type steroids from Aspergillus ustus NRRL 275[J]. Organic Letters, 23(24): 9620-9624. DOI

[22]	MCCLOSKEY S, NOPPAWAN S, MONGKOLTHANARUK W, et al, 2017. A new cerebroside and the cytotoxic constituents isolated from Xylaria allantoidea SWUF76[J]. Natural Product Research, 31(12): 1422-1430. DOI

[23]	MELTZER B S, COLQUHOUN H, RIESENBERG R, et al, 2018. Brexanolone injection in post-partum depression: two multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled, phase 3 trials[J]. The Lancet, 392(10152): 1058-1070. DOI

[24]	MIGLIUOL A, PICCIAUI V, SICA D, 1990. Steroidal ketones from the sponge Geodza Cydonzum[J]. Journal of Natural Products, 53(5): 1262-1266. DOI

[25]	OH D C, JENSEN P R, KAUFFMAN C A, et al, 2005. Libertellenones A-D: Induction of cytotoxic diterpenoid biosynthesis by marine microbial competition[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 13(17): 5267-5273. DOI

[26]	OKADA B K, SEYEDSAYAMDOST M R, 2017. Antibiotic dialogues: induction of silent biosynthetic gene clusters by exogenous small molecules[J]. FEMS Microbiology Reviews, 41(1): 19-33. DOI PMID

[27]	QUANG D N, BACH D D, 2008. Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one from Vietnamese Xylaria sp. Possessing inhibitory activity of nitric oxide production[J]. Natural Product Research, 22(10): 901-906. DOI

[28]	REN YUHAO, LIU QUANFANG, CHEN LI, et al, 2019. Urceoloids A and B, two C19 steroids with a rearranged spirocyclic carbon skeleton from Urceola quintaretii[J]. Organic Letters, 21(6): 1904-1907. DOI

[29]	SULTANA N, 2018. Microbial biotransformation of bioactive and clinically useful steroids and some salient features of steroids and biotransformation[J]. Steroids, 136: 76-92. DOI PMID

[30]	VAITKEVICIUS H, HUSAIN A M, ROSENTHAL E S, et al, 2017. First-in-man allopregnanolone use in super-refractory status epilepticus[J]. Annals of Clinical and Translational Neurology, 4(6): 411-414. DOI PMID

[31]	WANG QIUYUE, CUI GUANGXIN, WU JICHUN, et al, 2015. Steroids from Trigonostemon heterophyllus[J]. Chemistry of Natural Compounds, 51(6): 1196-1198. DOI

[32]	WEI XIA, SU JUNCHENG, HU JINSHAN, et al, 2022. Probing indole diketopiperazine-based hybrids as environmental-induced products from Aspergillus sp. EGF 15-0-3[J]. Organic Letters, 24(1): 158-163. DOI

[33]	WENG YUFANG, LIU JUN, XIANG LAN, et al, 2011. Ganodermasides C and D, two new anti-aging ergosterols from spores of the medicinal mushroom Ganoderma lucidum[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 75(4): 800-803. DOI

[34]	ZHANG WEN, DRAEGER S, SCHULZ B, et al, 2009. Ring B aromatic steroids from an endophytic fungus, Colletotrichum sp.[J]. Natural Product Communications, 4(11): 1449-1454.

[35]	ZHU XIOAXIA, LIU YING, HU YUNWEN, et al, 2021. Neuroprotective activities of constituents from Phyllosticta capitalensis, an endophyte fungus of Loropetalum chinense var. rubrum[J]. Chemistry & Biodiversity, 18(8): e2100314.

Options

Outlines

模态框（Modal）标题

Abstract

Cite this article

图1 来源于两株曲霉属真菌EGF7-0-1和EGF15-0-3共培养的甾体化合物1~10

1 试验部分

1.1 材料与试剂

表1 试验所用仪器与试剂信息表

1.2 菌种的活化与规模培养

1.3 次生代谢产物的提取、分离与纯化

1.4 物理常数与波谱数据

表2 化合物 1~10的 1H NMR数据(400MHz, CDCl3, δH, 多重峰mult, 偶合常数J in Hz)

表3 化合物 1~10的 13C NMR数据(100MHz, CDCl3, δC, type)

1.5 LC-MS分析及GNPS建立

2 结果及分析

2.1 结构解析

2.2 菌株共培养和单培养中甾体类化合物的分析

图2 共培养曲霉属真菌不同时间生长图片(土黄色菌落为EGF7-0-1, 灰绿色菌落为EGF15-0-3)

图3 两株真菌共培养(蓝色曲线)、EGF7-0-1单培养(粉色曲线)、EGF15-0-3单培养(红色曲线)的TIC对比图

图4 两株真菌共培养、EGF15-0-3单培养、EGF7-0-1单培养的GNPS分析

3 结论

References

表2 化合物 1~10的 ¹H NMR数据(400MHz, CDCl₃, δ_H, 多重峰mult, 偶合常数J in Hz)

表3 化合物 1~10的 ¹³C NMR数据(100MHz, CDCl₃, δ_C, type)