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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 92 - 103

DOI: https://doi.org/10.11978/2022250

Marine Biology

Transcriptomic analysis of fatty acid metabolism in the Thalassiosira pseudonana under low salinity stress

  • SUN Wenjie , 1, 2 ,
  • LI Jiamin 1, 2 ,
  • WANG Hualong 3 ,
  • MI Tiezhu , 1, 2, 4 ,
  • ZHEN Yu 1, 2, 4
Expand
  • 1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China
  • 2. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China
  • 3. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
  • 4. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China
MI Tiezhu. email:

Received date: 2022-12-01

  Revised date: 2023-01-12

  Online published: 2023-02-22

Supported by

Qingdao National Laboratory of Marine Science and Technology(2021QNLM040001)

National Natural Science Foundation of China(41976133)

Fold

Abstract

The expression of fatty acid metabolism-related genes of Thalassiosira pseudonana under different salinities and different growth stages was analyzed by transcriptomic sequencing in this study. A total of 40 coding genes that are related to the fatty acid metabolisms were retrieved from this study with distinct expression levels at different salinity concentrations. The results showed that the expression levels of genes related to fatty acid biosynthesis and elongation (such as ACC1, armB) in T. pseudonana cells were significantly higher at the second and fourth days compared to those at the first day across the salinity gradients, while the expression levels of genes related to fatty acid degradation (such as ACADM, ECI1) did not change significantly. The expression of genes related to fatty acid biosynthesis and elongation in the experimental group were differentially expressed compared to the control group (for example, the expression levels of KASⅠ, ACAA2 and other genes, which play an important role, increased significantly, but a few of them decreased or changed slightly), although the fatty acid degradation related genes were significantly increased in the experimental group. This study improves our understanding of the survival and adaptation strategies of diatoms in the offshore euryhaline environments, and supports the exploration of outbreak and vanishment of harmful algal blooms.

Key words： Thalassiosira pseudonana; fatty acid metabolism; RNA-seq; salinity stress

Cite this article

SUN Wenjie , LI Jiamin , WANG Hualong , MI Tiezhu , ZHEN Yu . Transcriptomic analysis of fatty acid metabolism in the Thalassiosira pseudonana under low salinity stress[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(5) : 92 -103 . DOI: 10.11978/2022250

浮游植物是海洋微食物环的重要组成部分(Bidle, 2016), 对于海洋食物网、生物地球化学循环和全球气候变化等均具有非常重要的调控作用(Field et al, 1998; Ray et al, 2014; Lovio-Fragoso et al, 2021)。海洋浮游植物以不足生物圈1%的生物量, 贡献了全球近50%的初级生产力。硅藻是浮游植物中数量最多的门类之一, 遍布世界各大海域, 并且是海洋初级生产力的主要贡献者(刘淑雅 等, 2021)。
海洋中某些浮游植物在一定环境条件下, 短时间内暴发性增殖或聚集会形成危害生态系统和人类健康
的有害藻华, 其中硅藻是重要的藻华原因种(于仁成 等, 2020)。赤潮藻对近海广盐环境的适应是影响其地理分布格局和细胞命运的重要机制之一。近海的盐度波动能够显著影响河口与近海环境中浮游植物的代谢反应(脂肪酸代谢、能量代谢等)、细胞形态与理化特征、生态功能等(Gong et al, 2020)。浮游植物可以通过脂肪酸代谢以产生次级代谢物来应对周围环境盐度变化的压力, 使其具有优于其他物种的优势(曹月蕾, 2021)。因此, 研究近海河口淡水输入造成的盐度变化对赤潮广布种的脂肪酸代谢通路等重要生命活动过程的影响, 对探究赤潮藻应对近海广盐环境的生存与适应策略具有重要意义。
脂肪酸代谢反应贯穿微藻的全部生命过程, 对微藻的生存与增殖具有重要意义。同时, 海洋环境保护与全球能源缺乏等问题日益突出, 绿色可再生的生物燃料是解决能源与环境可持续问题的重要研究方向之一(Abomohra et al, 2019)。光合藻类的生物量周转率和脂质含量均较高, 可为解决能源问题提供一定帮助(Ray et al, 2014)。对微藻细胞施加不同的非生物胁迫, 能够刺激脂类的合成与积累。其中, 盐度的增加能够改变海洋微藻的生长和生化组成、增加脂质的积累量(Khatoon et al, 2014)。因而, 研究藻类的脂肪酸代谢途径对于微藻生物学与生物能源发展都具有重要意义。
现阶段对浮游植物脂肪酸通路的研究大多集中在部分基因功能研究等方面, 而对假微型海链藻脂肪酸代谢通路系统相关基因的研究仍不完善。假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)是一种在世界各海域广泛分布的藻华原因种。本研究以其为研究对象, 探讨该藻的脂肪酸代谢途径以及河口淡水输入造成的低盐影响下功能基因的差异表达情况。

1 材料与方法

1.1 藻种的培养

假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)购于上海光语生物科技有限公司, 分离纯化后保存于中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室藻种室。本试验使用f/2培养基, 培养温度为(20±1)℃、光暗周期比为12h:12h、光照强度为80~100μmol·m-2·s-1。培养藻种的海水取自青岛近海, 盐度约为34‰, pH为7.8~8.0。

1.2 试验设置与测序样品准备

本研究采用人工海水(Nakanishi et al, 1996)配置培养液进行试验, 共设置低盐组(L)、中盐组(M)和对照组(C) 3个组别, 盐度梯度分别为3‰、9‰、30‰。收集指数生长期的藻细胞接种于培养液中, 使得每个样品的初始藻细胞密度均为3×105个·L-1, 每个组别设置3个生物学重复。分别于试验第1天、第2天、第4天离心收集各组藻细胞, 在其中加入1mL Trizol裂解液, 液氮速冻15min后-80℃储存备用。之后, 按照Trizol说明书中的步骤提取总RNA。用脱氧核糖核酸酶(DNase)去除残留的DNA后对提取的总RNA样品通过Denovix核酸蛋白检测仪(DS-11超微量紫外可见分光光度计)测量RNA的浓度, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量。每组的样品均选取两个平行样(共计18个样品)进行后续文库构建和Illumina Novaseq 6000双端测序(上海欧易生物医学科技有限公司)。

1.3 数据预处理及从头拼接

高通量测序中产生的原始数据经碱基识别分析转化为原始测序序列(raw reads)以FASTQ格式储存, 并对其进行测序错误率分布检查和A/T/G/C含量分布检查的质量评估。对原始数据(raw reads)进行质控, 以获得用于后续分析的较高质量数据(clean reads)。首先使用Trimmomatic (Bolger et al, 2014)软件进行质控并去除接头, 在此基础上过滤掉低质量碱基以及N碱基, 得到的转录本序列信息的储存方式为FASTA格式, 作为分析比对的参考序列。

1.4 功能注释及差异基因富集分析

结合已知的Thalassiosira pseudonana CCMP1335株系的参考基因组信息(PRJNA34119), 基于hisat 2参考基因组对比结果, 通过cuffcompare软件与参考序列的基因注释信息进行比对。将新得到的注释信息与已知注释信息进行比较, 得到比对结果。在计算基因的表达量差异时, 通过htseqcount软件获取落到各个样本中基因的序列(reads)数目, 然后计算得到counts (比对到某个基因上的总数目)和FPKM (Fragments Per Kilobase Million, 为每百万reads中来自某一基因每千碱基长度的reads数目, 是一种普遍采用的基因表达量标准化方法)。随后使用DESeq对数据进行标准化处理, 并计算表达量差异的p值和fold-change值。根据p-adjust < 0.05, |log2foldchange| ≥ 2条件, 挑选出组间表达差异的基因, 并进行差异基因的GO富集分析和KEGG富集分析, 以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。
通过与GO数据库进行搜索对比进行功能注释, 将注释成功的转录本按照生物学过程、细胞成分、分子功能3个部分的差异表达基因进行注释, 并且对其下一层级进行分类, 划分了包括细胞过程、代谢过程等在内的64个条目。统计每个GO条目中所包括的差异基因个数, 并用超几何分布算法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的p值, 根据GO分析的结果结合生物学意义以分析脂肪酸代谢途径功能基因。

2 结果与讨论

2.1 转录组测序与注释

本分析完成18个样本的有参转录组测序, 共获得120.12G的Clean Data, 各样本的有效数据量分布在6.15~6.96G, Q30碱基分布在91.1%~94.85 %, 平均GC含量为49.36%。转录组测序样本间平行性分析结果表明本试验各处理组均具有较好的样本平行性。样本分析通过将reads比对到参考基因组上, 得到各个样本的基因组比对情况, 比对率为73.93%~96.11%。基于比对结果, 进行蛋白编码基因表达量分析。根据蛋白编码基因在不同样本中的表达量, 进行差异筛选检测, 不同比较组之间的共有差异表达的基因数目统计情况如图1所示。中盐度组第1天和第2天2个试验组(M1 vs M2)具有最多的共有差异表达基因321个, 而最少的是对照组第2天和第4天2个试验组(C2 vs C4), 只有1个共有差异表达基因。
图1 不同比较组间的共有差异表达基因

C1、C2和C4分别为对照组第1天、第2天和第4天3个试验组; M1、M2和M4分别为中盐组第1天、第2天和第4天3个试验组; L1、L2和L4分别为高盐组第1天、第2天和第4天3个试验组。每一个椭圆形中的数字表示两组间共有的差异表达基因的数目, 中间红色的“0”代表18个比较组没有相同的差异表达基因

Fig. 1 Shared expressed genes between two groups. C1/C2/C4: the control group on day one, day two and day four; M1/M2/M4: the middle salinity group on day one, day two and day four; L1/L2/L4: the low salinity group on day one, day two and day four. Number in each oval represents the count of shared expressed genes between two groups

2.2 脂肪酸代谢途径分析

通过GO功能注释以及KEGG代谢途径分析, 构建了假微型海链藻的脂肪酸代谢通路, 并且发现该通路在KEGG富集分析结果中显著, 18个比较组中有14个比较组的脂肪酸代谢通路的富集得分排名位于所有显著富集通路的前20 (列举了其中3个), 由图2a~2c可以看出, 3个对比组的脂肪酸代谢通路p值均低于0.01, 具有极显著差异, 差异基因数目也均在20左右。
图2 Top20显著富集通路KEGG气泡图

a. M1 vs M2气泡图; b. L1 vs L4气泡图; c. L4 vs C4气泡图

Fig. 2 KEGG enrichment bubble graph of the top20 significantly enriched pathways. (a) M1 vs M2 bubble graph; (b) L1 vs L4 bubble graph; (c) L4 vs C4 bubble graph

基于转录组的功能注释及代谢途径分析, 构建了关于脂肪酸代谢途径中26个相关酶以及40个编码基因的转录本, 每个酶有1~7个转录本。本文构建了与脂肪酸代谢相关且存在差异基因表达的3个重要通路, 分别是脂肪酸生物的合成途径、长链脂肪酸的延伸途径和脂肪酸的降解途径。

2.2.1 脂肪酸的生物合成

在假微型海链藻中注释到了22个与脂肪酸生物合成有关的基因, 注释到藻类脂肪酸质体中发生的生物合成与延伸过程如图3所示, 乙酰-CoA羧化酶(ACC1)催化起始物质乙酰-CoA (Acetyl-CoA)生成丙二酸单酰-CoA (Malonyl-CoA)。然后丙二酸单酰CoA:ACP转酰酶(armB)将丙二酸单酰-CoA (Malonyl-CoA)转化为丙二酸单酰-ACP (Malonyl-[acp])。
图3 脂肪酸的生物合成及延伸途径

Citrate cycle: 柠檬酸循环; Acetyl-CoA: 乙酰辅酶A; Malonyl-CoA: 丙二酰-CoA; Malonyl-[acp]: 丙二酸单酰-ACP; Acetoacetyl-[acp]: 乙酰乙酰-ACP; (R)-3-Hydroxy-butanoyl-[acp]: 3-羟基丁酰基-ACP; But-2-enoyl-[acp]: 丁-2-烯酰基-ACP; Butyryl-[acp]: 丁酰-ACP; Hexa-decanoyl-[acp]: 十六酰-ACP; Hexa-decenoyl-[acp]: 十六烯酰基-ACP; Hexadecenoic acid: 十六烯酸; Hexadecanoyl-CoA: 十六酰-CoA; Octa-decanoyl-[acp]: 十八酰-ACP; Octa-decanoyl-[acp]: 十八烷酰基-ACP; Octadecenoic acid: 十八烯酸; Fatty acid biosynthesis: 脂肪酸生物合成; ACC1: 乙酰-CoA羧化酶基因; armB: 丙二酸单酰CoA:ACP转酰酶基因; fabH: β-酮酰-ACP合酶Ⅲ基因; fabG: β-酮酰基-ACP还原酶基因; KCR1: β-酮脂酰-辅酶A还原酶基因; fabZ: β-羟酰-ACP脱水酶基因; fabI: 烯酰-ACP还原酶基因; KASⅠ: β-酮酰基-ACP合酶Ⅰ基因; KASII: β-酮酰基-ACP合酶Ⅱ基因; LACS: 长链酰基辅酶A合成酶基因; SSI2: 酰基-ACP去饱和酶基因

Fig. 3 Biosynthesis and elongation of fatty acids

脂肪酸的生物合成过程中伴随缩合、还原、脱水、还原的循环反应, 每个循环过程使起始脂肪酸增加两个碳原子。如图3所示, β-酮酰基-ACP合酶Ⅱ (KASⅡ)催化丙二酸单酰-ACP (Malonyl-[acp])和乙酰-CoA (Acetyl-CoA)反应生成乙酰乙酰-ACP (Acetoacetyl-[acp])。生成的乙酰乙酰-ACP (Acetoacetyl-[acp])经过β-酮酰基-ACP还原酶(fabG)、β-羟酰-ACP脱水酶(fabZ)、烯酰-ACP还原酶(fabI)催化反应后生成丁酰-ACP (Butyryl-[acp])。多次循环会生成十六烯酸(C16:0, Hexadecenoic acid)或者十八烯酸(C18:0, Octadecenoic acid)。β-酮酰基-ACP合酶Ⅰ (KASⅠ)催化六碳到十六碳产物的生成, β-酮酰基-ACP合酶Ⅱ (KASⅡ)催化十八碳产物的生成。

2.2.2 长链脂肪酸延伸途径

在假微型海链藻中注释到了8个与长链脂肪酸延伸有关的基因, 当脂肪酸链长度大于等于16时, 丙二酸单酰-CoA (Malonyl-CoA)和长链脂酰基-CoA (Long-chain acyl-CoA)在β-酮酰-CoA合酶(KCS)、长链脂肪酸延伸酶(ELOVL)、脂肪酸延长酶2 (ELO2)、脂肪酸延长酶3 (ELO3)的催化缩合作用下生成长链β-氧代酰基-CoA, 接着在β-酮酰-CoA还原酶(KCR)、β-酮酰-CoA脱水酶(HCD)、烯酰-CoA还原酶(ECR)的作用下生成长链脂酰基-CoA, 可以通过重复循环延长碳链。最终, 在酰基-CoA硫酯酶(ACOT)的作用下生成长链脂肪酸(图4)。
图4 长链脂肪酸的延伸途径

Malonyl-CoA: 丙二酸单酰-CoA; Long-chain acyl-CoA: 长链脂酰基-CoA; Long-chain 3-oxoaacyl-CoA: 长链3-乙二酰-CoA; Long-chain 3-hydroxyacyl-CoA: 长链3-脱氢酰基-CoA; Long-chain trans-2,3-dehydroacyl-CoA: 长链2,3-反式脱氢酰基-CoA; Long-chain fatty acid: 长链脂肪酸; ELO3: 脂肪酸延长酶3基因; SPAC1639.01c: 超长链脂肪酸延伸蛋白基因; KCR1: β-酮酰-CoA还原酶1基因; PAS2A: 超长链羟酰-CoA脱水酶基因; ECR: 烯酰-CoA还原酶基因; ACOT: 酰基-CoA硫酯酶基因

Fig. 4 Long chain fatty acids elongation pathway

2.2.3 脂肪酸的降解

在假微型海链藻中注释到了23个与脂肪酸降解有关的基因。
由分析结果可知, 在脂肪酸降解过程中, 长链脂肪酸通过进行氧化、水合、再氧化、硫解4个反应的降解循环反应, 每次循环移除2个碳原子, 最终全部变成乙酰-CoA (Acetyl-CoA)而进入柠檬酸循环(图5)。长链酰基辅酶A合成酶(LACS)用于合成脂肪酸酰基-CoA, 酰基-CoA氧化酶(ACX1)、特异性酰基-CoA脱氢酶(ACADM)、3-羟酰-CoA脱氢酶(MFP2)催化脂肪酸β-氧化, 烯酰-CoA水合酶(ECHS1)催化水合反应, 乙酰-CoA酰基转移酶2 (ACAA2)、乙酰-CoA酰基转移酶1 (ACAA1)催化硫解反应。
图5 脂肪酸的降解途径

Fatty acid biosynthesis: 脂肪酸生物合成; Hexadecanoate: 十六烯酸; Hexadecanoyl-CoA: 十六酰-CoA; L-Palmitoyl-carntine: L-棕榈酰肉碱; Trans-Hexadec-2-enoyl-CoA: 反式-十六烷基-2-烯酰-CoA; (S)-3-Hydroxy-hexa-decanoyl-CoA: (S)-3-羟基十六烷酰-CoA; 3-Oxo-hexa-decanoyl-CoA: 3-氧代十六烷酰-CoA; Acetoacetyl-CoA: 乙酰乙酰-CoA; Acetyl-CoA: 乙酰辅酶A; LACS: 长链酰基辅酶A合成酶基因; CPT: 肉碱棕榈酰转移酶基因; ACX1: 酰基-CoA氧化酶基因; ACADM: 特异性酰基-CoA脱氢酶基因; MFP2: 3-羟酰-CoA脱氢酶基因; ACAA2: 乙酰-CoA酰基转移酶2基因

Fig. 5 Fatty acids degradation pathway

2.3 脂肪酸代谢途径基因差异表达分析

在不同盐度处理组的假微型海链藻脂肪酸代谢途径中发现40个差异表达的功能基因(表1)。这些差异基因的表达量(FPKM值)由于时间和组别不同而存在显著差异(p<0.05)(图6)。
表1 假微型海链藻转录组中与脂肪酸代谢相关的酶以及对应的转录本

Tab. 1 Enzymes and transporters which is associated with fatty acid metabolism in the T. pseudonana transcriptome

信号通路 酶(蛋白)名称 EC编号 基因ID 基因名称
脂肪酸的
生物合成		 乙酰-CoA羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase) [EC:6.4.1.2] THAPS_6770 ACC1
THAPSDRAFT_12234 ACC1
丙二酸单酰CoA转移酶([acyl-carrier-protein] S-malonyltransferase) [EC:2.3.1.39] THAPSDRAFT_5219 armB
β-酮酰-ACP合酶Ⅱ (3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅱ) [EC:2.3.1.179] THAPSDRAFT_961 KASⅡ
THAPSDRAFT_12152 KAS
THAPSDRAFT_5021 KASⅠ
THAPSDRAFT_262879 KAS
β-酮酰-ACP合酶Ⅲ (3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅲ) [EC:1.1.1.180] THAPSDRAFT_270141 fabH
长链酰基-CoA合成酶(Long chain acyl-CoA synthetase) [EC:6.2.1.3] THAPS_263105 AAE16
THAPSDRAFT_11953 LACS7
THAPSDRAFT_270334 AAE15
THAPSDRAFT_29867 LACS7
THAPSDRAFT_13156 LACS8
THAPSDRAFT_25042 LACS7
THAPSDRAFT_262242 LACS6
β-羟酰-ACP脱水酶(3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase) [EC:4.2.1.59] THAPSDRAFT_34681 fabZ
烯酰-ACP还原酶(Enoyl-[acyl-carrier protein] reductase I) [EC:1.3.1.9] THAPSDRAFT_32860 fabI
β-酮酰-ACP还原酶(3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase) [EC:1.1.1.100] THAPSDRAFT_270321 fabG
酰基-ACP去饱和酶(Stearoyl-[acyl-carrier-protein]9-desaturase 2) [EC:1.14.19.2] THAPSDRAFT_bd1192 SSI2
脂肪酸的
延伸		 超长链脂肪酸延伸蛋白(Elongation of fatty acids protein) [EC:2.3.1.199] THAPSDRAFT_3741 ELO3
THAPSDRAFT_728 SPAC1639.01c
THAPSDRAFT_22362 KCS9
乙酰-CoA转移酶(Acetyl-CoA acetyltransferase) [EC:2.3.1.16] THAPSDRAFT_34809 ACAA2
超长链酮酰-CoA还原酶(Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA reductase) [EC:1.1.1.330] THAPSDRAFT_22650 KCR1
THAPS_35459 ACLA_070510
超长链羟酰-CoA脱水酶(Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase) [EC:4.2.1.134] THAPS_6781 PAS2A
烯酰-CoA水合酶(Probable enoyl-CoA hydratase 1) [EC:4.2.1.17] THAPSDRAFT_34511 ECHS1
图6 不同盐度条件下假微型海链藻与脂肪酸合成有关的基因差异表达

a. THAPS_6770; b. THAPSDRAFT_12234; c. THAPSDRAFT_5219; d. THAPSDRAFT_961; e. THAPSDRAFT_12152; f. THAPSDRAFT_5021; g. THAPSDRAFT_262879; h. THAPSDRAFT_270141; i. THAPSDRAFT_263105; j. THAPSDRAFT_11953; k. THAPSDRAFT_270334; l. THAPSDRAFT_29867; m. THAPSDRAFT_13156; n. THAPSDRAFT_25042; o. THAPSDRAFT_262242; p. THAPSDRAFT_34681; q. THAPSDRAFT_32860; r. THAPSDRAFT_270321; s. THAPSDRAFT_bd1192。上下线代表FPKM值的误差棒; *代表同一时间不同组别或者是同一组别在不同时间的FPKM值具有显著差异

Fig. 6 Gene expression involving in fatty acid synthesis in the T. pseudonana under different salinity conditions

近海环境中盐度发生变化时, 藻细胞会通过合成分泌一些代谢物来应对渗透压胁迫, 防止细胞在高盐环境下皱缩或者低盐环境下胀破(Yang et al, 2011)。有研究表明, 改变盐度可以促进微藻脂肪酸的累积, 盐胁迫条件下藻类的固碳作用可能转向脂肪酸等脂质的合成, 因而可以促使微藻积累大量的油脂, 并且改变脂肪酸的含量和组成, 影响脂肪酸的质量(BenMoussa-Dahmen et al, 2016)。

2.3.1 脂肪酸合成途径的基因差异表达分析

在不同盐度处理组中假微型海链藻细胞催化脂肪酸合成第一步反应的乙酰-CoA羧化酶(ACC1, THAPS_6770)以及对从头合成脂肪酸起关键作用的丙二酸单酰CoA转移酶基因(armB, THAPSDRAFT_ 5219)表达量随培养时间变化均显著升高(p<0.05)(图6a~6c)。对照组和中盐组中这两种功能基因的表达量在试验第1天即显著增加, 低盐组的表达量于第2天开始显著升高, 藻细胞对于低盐环境的响应可能存在一定的适应期。有研究表明, ACC1活性对于植物中脂肪酸合成速率具有关键调控作用, 显著升高的隐环藻(Cyclotella cryptica) ACC活性会引起脂质含量的增加(Roessler et al, 1993)。ACC1是脂肪酸合成过程中催化第一步反应的关键酶, 是催化脂肪酸合成的限速酶, 具有调控脂肪酸合成速率及产量的重要作用(Sun et al, 2019; 刘璇 等, 2022)。裂壶藻(Schizochytrium sp. TIO1101)细胞的ScTIOMCAT基因可以提高丙二酸单酰-CoA转移酶的活性继而可以显著增加脂肪酸积累量(Cheng et al, 2013)。ACC1、armB表达量升高表明脂肪酸合成速率显著增加, 使更多的乙酰-CoA (acetyl-CoA)生成丙二酸单酰-CoA (malonyl-CoA)继而转化为丙二酸单酰-ACP (malonyl-[acp]), 使得假微型海链藻细胞中的脂肪酸合成量增加。随着生长时期的变化, 微藻的固碳作用可能转向脂肪酸合成而使脂肪酸的生成量增加, 这一结果与其他学者在混合培养下的栅藻 (位文倩 等, 2022)以及氮胁迫条件下的微藻(聂煜东 等, 2021)研究结果相似。
在脂肪酸的生物合成过程中, 植物脂肪酸合成酶(FAS)中的β-酮酰基-ACP合酶(KAS, 包括KASⅠ、KASⅡ、KASⅢ)催化的一系列反应是脂肪酸的延伸反应所必需的(Msanne et al, 2012)。每两个碳原子为一个单位被β-酮酰基-ACP合成酶(KAS)家族添加到不断延伸的脂肪酰基链上, 通常会形成C16:0-acp和C18:0-acp脂肪酸。其中KAS家族中的KASⅢ负责将C2:0-acp缩合为C4:0-acp; KASⅠ催化C4:0-acp到C16:0-acp的反应(Msanne et al, 2012); 而KASⅡ催化C16:0-acp延伸至C18:0-acp的过程, 其在脂肪酸形成及积累过程具有重要作用(Aslan et al, 2015)。KAS表达量上升, 可以促进碱蓬种子中脂肪酸的生成(高羽荞 等, 2018)。通过RNAi干扰拟南芥KASⅡ的表达, 早期胚胎发育似乎对C16:0的升高很敏感, 而在后期, 可容忍53%的C16:0, 比野生型水平增加7倍, 证明了对拟南芥KASⅡ基因水平的调节足以将其温带油料成分转化为棕榈类热带油料成分(Pidkowich et al, 2007)。在缺氮和高盐度胁迫条件下二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)和四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的KASⅢ基因表达量明显上调, 油脂含量有明显提高(Sharma et al, 2015)。以上研究说明KAS家族对于油脂的合成有影响。由图6d可以发现, 低盐组假微型海链藻细胞的KASⅡ (THAPSDRAFT_961)基因表达量随时间变化显著增加, 并且低盐组和中盐组第2天、第4天的基因表达量均显著高于对照组(p<0.05); 低盐组的KAS (THAPSDRAFT_12152)、KASⅠ (THAPSDRAFT_ 5021)基因表达量随培养时间推移均显著升高, 且与同期对照组和中盐组的表达量存在显著性差异(p<0.05)(图6e、6f), 本结果表明可能随着假微型海链藻培养时间的增长, 脂肪酸的生成量逐渐累积。
长链酰基-CoA合成酶(LACS)可以将游离脂肪酸从质体转移到内质网中以进行脂肪酸合成, 将其酯化形成酰基-CoA (Tonon et al, 2005)。LACS基因过表达可以增加植株种子的含油量。由图6i~6l可以发现, 不同组别在试验第4天均存在显著差异(p<0.05), 低盐组的LACS (THAPS_263105、THAPSDRAFT_11953、THAPSDRAFT_270334、THAPSDRAFT_29867)表达量远远高于对照组; 随着时间增加, 低盐组的基因表达量明显提高, 可能是随着时间的增加, 脂肪酸的运输以及生物合成更加活跃, 并且低盐环境可能会促进游离脂肪酸的转移, 有利于脂肪酸的合成。低盐组和中盐组的LACS7 (THAPSDRAFT_11953)基因表达量显著高于对照组(p<0.05)(图6j), 并且远高于发挥同样作用的其他功能基因, 表明LACS7在低盐限制的脂肪酸合成过程中发挥着十分重要的作用。
由图6p~6s可以看出, 低盐组中与脂肪酸合成密切相关的β-羟酰-acp脱水酶(fabZ, THAPSDRAFT_ 34681)、烯酰-ACP还原酶(fabI, THAPSDRAFT_ 32860)、β-酮酰-ACP合酶Ⅲ (fabG, THAPSDRAFT_ 270321)、羟基-ACP去饱合酶 (SSI2, THAPSDRAFT_ bd1192)的基因表达量在试验第4天均显著升高, 与试验第1、2天相比存在显著差异, 并且与中盐组、对照组相比亦存在显著差异(p<0.05)。结果表明不同盐度处理条件下假微型海链藻细胞的脂肪酸生成量逐渐增加, 且低盐胁迫条件可能会促进了脂肪酸合成。

2.3.2 脂肪酸延伸途径的基因差异表达分析

超长链脂肪酸延伸蛋白(ELO3, THAPSDRAFT_ 3741)、超长链羟酰-CoA脱水酶(PAS2A, THAPS_ 6781)和超长链酮酰-CoA还原酶(KCR1, THAPSDRAFT_22650)基因均作用于脂肪酸延长过程, 可将短链脂肪酸延伸为长链脂肪酸。从图7a~7e可以看出这些基因的表达量随培养时间增长而递增。与脂肪酸延伸相关的乙酰-CoA酰基转移酶2 (ACAA2, THAPSDRAFT_34809)的基因表达量一直处于较高状态(图7d), 与中盐组和对照组相比差异显著(p<0.05), 并且是调控脂肪酸延伸的关键基因。低温处理会使莴苣种子脂肪酸合成通路功能富集, 并且随着低温处理时间的增加, 超长链脂肪酸延伸酶相关基因的表达量呈上升趋势(高彦龙 等, 2022)。生菜种子在低温冷冻环境下, 为了提高种子的耐寒性, 通过增加超长链脂肪酸延伸酶基因的表达量以提升高度长链脂肪酸生成量, 从而提高其抗冷性(周婧雯 等, 2020)。假微型海链藻极有可能通过脂肪酸延长过程相关的基因表达量升高以提高环境适应能力, 抵御外界胁迫。
图7 不同盐度条件下假微型海链藻与脂肪酸延伸有关的基因差异表达

a. THAPSDRAFT_3741; b. THAPSDRAFT_728; c. THAPSDRAFT_23362; d. THAPSDRAFT_34809; e. THAPSDRAFT_22650;
f. THAPSDRAFT_35459; g. THAPS_6781; h. THAPSDRAFT_34511。上下线代表FPKM值的误差棒; *代表同一时间不同组别或者是同一组别在不同时间的FPKM值具有显著差异

Fig. 7 Gene expression involving in the fatty acid elongation in the T. pseudonana under different salinity conditions

2.3.3 脂肪酸降解途径的基因差异表达分析

由上述可见, 假微型海链藻细胞脂肪酸的生物合成与延伸相关的功能基因表达量显著升高, 继而促进藻细胞的脂肪酸合成。而在脂肪酸降解过程中起重要作用的酰基-CoA脱氢酶基因(ACADM, THAPSDRAFT_bd1760)无论是不同时间梯度还是各组别之间均无显著变化(图8j)。低盐组的烯酰-CoA水合酶基因(MFP2, THAPSDRAFT_26365)表达量随时间先上升后下降, 试验第2天时与中盐组和对照组存在显著差异(p<0.05), 但是第1天和第4天的基因表达量差异不显著。盐度胁迫处理组中假微型海链藻细胞的烯酰-CoaΔ异构酶基因(ECI1, THAPSDRAFT_268835)表达量在试验第4天时低于对照组(图8i)。不同处理组的假微型海链藻细胞的乙醇脱氢酶基因(ADHⅢ, THAPSDRAFT_26523)表达量在试验第2天、第4天均显著低于第1天(p<0.05), 且试验组的基因表达量显著低于对照组(图8h)。结果表明不同盐度处理条件下, 假微型海链藻细胞随着培养天数的增加, 其脂肪酸的合成亦更加活跃, 与脂肪酸降解相关的基因大多数受到显著抑制, 一定程度上抑制了脂肪酸的降解过程。本试验相关结果可能与藻细胞在盐胁迫条件下对能量存储的需求增加有关。但是, 在试验第4天低盐组中, 在脂肪酸降解过程中发挥重要作用的乙酰-CoA酰基转移酶1 (ACAA1, THAPSDRAFT_36742)、乙酰-CoA酰基转移酶2 (ACAA2, THAPSDRAFT_28651)的基因表达量均显著升高(图8b~8f), 表明藻细胞在低盐环境下相对于对照组以及中盐组可能存在适应过程, 因而脂肪酸的累积相对较慢。
图8 不同盐度条件下假微型海链藻与脂肪酸降解有关的基因差异表达

a. THAPSDRAFT_23830; b. THAPSDRAFT_28651; c. THAPSDRAFT_26365; d. THAPSDRAFT_34511; e. THAPSDRAFT_263878;
f. THAPSDRAFT_36742; g. THAPS_269316; h. THAPSDRAFT_26523; i. THAPSDRAFT_268835; j. THAPSDRAFT_bd1760;
k. THAPSDRAFT_21238。上下线代表FPKM值的误差棒; *代表同一时间不同组别或者是同一组别在不同时间的FPKM值具有显著差异

Fig. 8 Gene expression involving in the fatty acid degradation in the T. pseudonana under different salinity conditions

2.4 假微型海链藻脂肪酸代谢特点

不同盐度处理的假微型海链藻随培养时间推移, 脂肪酸生物合成以及延伸过程的差异基因表达量呈上升状态, 这反映了脂质积累的生物学过程。脂肪酸降解途径的差异基因表达量呈降低状态, 说明脂肪酸积累可能不止在于脂肪酸合成过程的加强, 也在于脂肪酸分解过程的减弱, 两者同时作用促进了假微型海链藻细胞内脂肪酸的积累。另外, 通过比较同一时间不同组别的差异基因表达量发现, 低盐组相对于对照组脂肪酸代谢相关的功能基因变化明显, 而中盐组变化相对较小。在低盐限制条件下, 假微型海链藻细胞的生命活动受到胁迫。脂肪酸代谢作为能量代谢的主要形式之一, 可为细胞的快速分裂增殖提供必需能量(王延莉 等, 2022)。因此, 可能需要消耗藻细胞内储存的能量物质为细胞正常生命活动供能。尽管细胞内与脂肪酸合成、延伸过程相关基因的表达存在差异, 但脂肪酸降解过程相关的关键基因表达量显著增加, 表明假微型海链藻应对低盐环境具有明显的适应性。在低盐胁迫条件下主要是对之前储存的脂肪酸降解以释放能量物质及其他代谢物以维持细胞的渗透压与正常的生命活动(庄珊珊, 2019)。
此外, 假微型海链藻应对休眠状态会上调脂肪酸延伸和去饱和酶相关基因, 将细胞内脂肪酸进一步加工形成长链不饱和脂肪酸(黄璐, 2020); 玛氏骨条藻在稳定期和衰亡期在Δ12－去饱和酶(delta - 12 fatty acid desaturase, Δ12D)的编码基因均出现显著上调, 有利于多不饱和脂肪酸合成(张梅 等, 2018)。本研究对假微型海链藻的盐度胁迫下脂肪酸代谢途径进行研究, 未发现与不饱和脂肪酸合成相关的差异基因, 说明该胁迫条件下, 假微型海链藻可能并未通过不饱和脂肪酸的生成来应对盐度的变化。
综上所述, 盐度胁迫条件对于假微型海链藻的脂肪酸代谢途径具有显著影响。脂肪酸的生物合成、延伸与降解过程的功能基因差异表达表明, 假微型海链藻为应对近海盐度波动以及低盐胁迫环境条件可能会增加脂肪酸的积累, 在生命活动受到威胁时对积累的脂肪酸进行降解, 以维持正常生命活动。不同盐度环境条件下, 假微型海链藻脂肪酸代谢途径的生存与适应策略, 为维持其生长与消亡过程的平衡和在环境适宜时迅速繁殖形成大规模藻华提供支持。

3 结论

本研究通过对假微型海链藻转录组测序分析发现该藻存在26个与脂肪酸代谢有关的酶(蛋白)以及40个编码这些酶的基因。通过比较假微型海链藻在不同盐度处理下的转录组水平脂肪酸代谢途径功能基因差异表达结果发现, 盐度胁迫组的假微型海链藻中许多与脂肪酸代谢途径相关的功能基因存在差异表达现象, 而且不同培养时间亦存在差异。随培养时间推移, 脂肪酸生物合成以及延伸过程的相关基因表达量升高, 而脂肪酸降解途径的相关基因表达量降低, 可能促进了假微型海链藻细胞内脂肪酸的积累; 同一时间不同组别进行比较, 低盐组相对于对照组脂肪酸代谢相关的功能基因变化明显。本研究表明河口持续的淡水输入造成的近海盐度波动条件与假微型海链藻脂肪酸的代谢过程有着密切联系。

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