Marine Biology

The study on ovarian development, oogenesis and vitellogenesis of Lutraria sieboldii in Beibu Gulf of Guangxi

  • WU Tao , 1, 2 ,
  • PAN Ying , 1, 2 ,
  • LIAN Changpeng 1, 2 ,
  • LIU Yiming 1, 2 ,
  • XU Bingjie 1, 2 ,
  • WANG Chaoqi 1, 2 ,
  • YANG Ling 1, 2
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  • 1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China
  • 2. Key Laboratory of Aquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation of Guangxi Universities, Nanning 530004, China
PAN Ying. email:

Copy editor: LIN Qiang

Received date: 2023-03-03

  Revised date: 2023-05-05

  Online published: 2023-04-25

Supported by

Guangxi Innovation Driven Development Project(AA19254032)

National Key Research and Development Program of China(2018YFD0901400)

Abstract

For understanding the ovarian development, oogenesis and vitellogenesis of Lutraria sieboldii in the Beibu Gulf of Guangxi, we used tissue section, optical and electronic microscope observed the annual change process of female germ cells. The results showed that the ovary development of L. sieboldii in the Beibu Gulf of Guangxi was a reproductive cycle every year, and the peak period of reproduction was from December to April of the next year when the gonads were full, 5%~15% individual development lagged behind the population in each stage. During oogenesis, female reproductive cell gradually detached from the follicle walls, and entered the follicular cavity. In the process of ovum development, the oocyte diameter changed from 6.9~8.3 μm to 70.0~74.9 μm, the number of organelles in the cytoplasm increased, and appeared yolk granules, autophagy vesicles engulf lipid droplets and mitochondria. During vitellogenesis, the nucleolus turned into two parts with different staining depth, material exchange occurred between nucleoplasm. Oocytes formed polyvesicular bodies through plasma membrane depression and formed microphagulation vesicles near the perioval space, which absorb exogenous yolk substances from perioval space and follicles, respectively. In addition, we observed that there were follicular mixed type and follicular coexisting type hermaphroditism, and the direction of sexual transformation was from female to male. The results provide basic data for the artificial breeding of L. sieboldii.

Cite this article

WU Tao , PAN Ying , LIAN Changpeng , LIU Yiming , XU Bingjie , WANG Chaoqi , YANG Ling . The study on ovarian development, oogenesis and vitellogenesis of Lutraria sieboldii in Beibu Gulf of Guangxi[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(6) : 137 -149 . DOI: 10.11978/2023027

施氏獭蛤(Lutraria sieboldii)隶属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、蛤蜊总科(Mactracea)、蛤蜊科(Mactridae)、獭蛤属(Lutraria)(徐凤山 等, 2008), 分布于热带-亚热带海区(蔡英亚 等, 2005)。施氏獭蛤营养价值高, 规模化养殖潜力和市场前景广阔(王斌 等, 2015)。然而, 由于人工养殖规模小, 过度捕捞和海洋环境的恶化导致其自然资源短缺, 限制了其产业的发展。目前国内对施氏獭蛤的研究主要集中在人工苗种培育和养殖(王斌 等, 2015; 王超奇 等, 2023)、环境耐受性及生长存活(刘超 等, 2015; 彭慧婧 等, 2019)、营养成分分析(潘英 等, 2007)、胚胎发育(焦宗垚 等, 2010)、遗传及表型性状研究(Su et al, 2013; 邹杰 等, 2020)等方面, 国外相关研究主要在种质资源调查(Hauton et al, 2003)、水管肌和贝壳成分分析(Hunt et al, 1973)等方面。关于施氏獭蛤繁殖规律方面仅见曹伏君 等(2012)使用性腺指数、肥满度和周年组织切片对广东湛江海域施氏獭蛤性腺发育和生殖周期进行研究, 表明广东湛江海域施氏獭蛤繁殖周期为10月至翌年2月, 性腺发育分为5期, 性腺周年发育过程中出现雌雄同体现象。但未指明雌雄同体的类型和性转换方向, 对卵子发生过程中雌性生殖细胞的内外部变化也仅停留在组织切片观察, 未观察到卵黄发生过程中细胞器的变化情况和外源卵黄物质来源。
卵巢发育和卵子发生、发育过程是繁殖生物学的基础, 了解其特征有助于确定繁殖规律, 开展资源调查、种质资源保护和人工育苗等工作(阮飞腾 等, 2014; 吴明灿 等, 2015)。众多学者从个体、组织和细胞的层面对海产双壳贝类卵巢发育和卵子发生进行了研究(宁军号 等, 2015; 连昌朋 等, 2022), 关于施氏獭蛤卵子和卵黄发生过程的超微结构观察未见报道。本研究使用电子显微镜, 结合周年性腺组织切片, 对广西北部湾施氏獭蛤卵巢发育、卵子发生、发育和卵黄发育进行研究, 同时观察雌雄同体与性转换现象, 旨在为施氏獭蛤的生殖生理机制研究和人工繁育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用施氏獭蛤于2020年11月—2021年10月采自广西北部湾海域北海市铁山港区营盘镇大王岭海区(109°25′48″E, 21°27′N), 每月随机取20个活力较好、体型正常、无损伤的2~3龄个体。在一周年的采样中共采集到 123个雌性施氏獭蛤, 112个雄性施氏獭蛤, 5个雌雄同体施氏獭蛤。形态参数见表1, 同龄雌性和雄性个体外表、大小无明显区别。
表1 施氏獭蛤形态参数

Tab.1 Morphological parameters of L. sieboldii

数值 壳长/mm 壳高/mm 壳宽/mm 体质量/g
平均值 94.12 46.03 32.61 98.89
最大值 116.80 57.74 43.83 199.96
最小值 80.12 39.53 24.72 55.30

1.2 方法

1.2.1 样品测量

擦干样品后使用广陆数显游标卡尺测量壳长、壳宽和壳高,电子数码称(MH-555)称量体质量。将每月样品解剖后, 分别取软体部和性腺, 称量后计算性腺指数和肥满度, 计算公式如下: 性腺指数=性腺重/软体重×100%; 肥满度=软体重/体质量×100%。

1.2.2 施氏獭蛤卵巢的组织学观察

每月样品测量称重后对其活体解剖, 用剪刀取1g性腺组织并用Bouin’s液固定1d。样品送往广西医科大学医学实验中心制成石蜡切片, 参考姜永华 等(2009)方法将样品脱水、包埋、切片, 尼康E100正置显微镜观察拍照。

1.2.3 透射电镜的制样及观察

每月从样品中选取2个雌性个体, 活体解剖并用剪刀取1g卵巢组织放入EP管内, 加入2.5%电镜固定液(C₅H₈O₂), 4℃冰箱内固定保存过夜, 固定后的样品切成1mm3小块并置换新的电镜液于4℃下二次固定。固定后的样品送至武汉赛维尔生物公司包埋观察, 参考韩龙江 等(2017)方法, 将样品经浓度为0.1mol·L-1的磷酸缓冲液(phosphate buffer)连续漂洗后, 脱水、包埋、切片, 日立HT7700透射电镜观察。

1.2.4 扫描电镜的制样及观察

每月从性腺饱满的样品中取2个雌性个体, 活体解剖后用巴氏吸管吸取部分成熟卵子, 放入EP管中, 加入盐度28‰的海水稀释。固定后的样品送至武汉赛维尔生物公司制备观察, 参考陈昭廷 等(2017)方法制样, 将样品漂洗、脱水、置换后放入40℃烘箱烘干, 干燥后的样品用镊子粘至导电胶带, 喷金, 日立SU8100扫描电镜观察拍照。

2 结果与分析

2.1 雌性施氏獭蛤性腺指数和肥满度的周年变化

图1可知, 从2020年11月到翌年3月, 随着水温降低, 雌性施氏獭蛤性腺指数不断上升, 3月下旬性腺指数最高(10.71%); 从4月开始, 随水温升高, 性腺指数逐渐下降, 9月中旬性腺指数最低(0.26%); 4—10月性腺指数在1.10%的较低水平。
图1 雌性施氏獭蛤性腺指数与水温的周年变化

Fig. 1 Annual variation of gonad index and water temperature in female L. sieboldii

图2可知, 8—12月, 雌性施氏獭蛤肥满度随水温的降低而下降; 12月下旬肥满度最低(36.77%); 此后肥满度不断上升, 在翌年3—7月维持在47.81%左右的较高水平。
图2 雌性施氏獭蛤肥满度与水温的周年变化

Fig. 2 Annual variation of fertilizer and water temperature in female L. sieboldii

2.2 施氏獭蛤卵巢发育分期

采用组织学方法, 根据组织切片中滤泡和雌性生殖细胞的变化, 将施氏獭蛤的卵巢划分成Ⅰ—Ⅴ期, 各期发育特点如图3表2所示。
图3 施氏獭蛤各期卵巢的发育

a. 增殖期(Ⅰ); b. 生长期(Ⅱ); c. 成熟期(Ⅲ); d. 排放期(Ⅳ); e. 休止期(Ⅴ)

Fig. 3 Ovary development in different stages of L. sieboldii. (a) Ⅰ: proliferating stage; (b) Ⅱ: growing stage; (c) Ⅲ: maturing stage; (d) Ⅳ: spawning stage; (e) Ⅴ: resting stage

表2 施氏獭蛤各期卵巢的特点

Tab. 2 Ovarian characteristics in each stage of L. sieboldii

发育分期 各期特点
增殖期(Ⅰ) 结缔组织包裹至软体部上缘, 性腺颜色透明, 雌雄外观无区别, 呈细线分布。结缔组织间形状不规则且狭长的滤泡构成性腺, 滤泡末端分支由少变多, 滤泡由小变大形成滤泡腔, 滤泡间隙较大。此时期滤泡腔大多为空腔, 滤泡壁厚, 滤泡内大部分为卵原细胞, 卵原细胞松散分布在滤泡壁上。此期为8月下旬—9月
生长期(Ⅱ) 性腺增殖至软体部上缘, 仍无法从性腺颜色分辨雌雄。滤泡不断增大, 数量不断增多, 结缔组织减少, 滤泡间存在间隙。滤泡壁变薄, 滤泡壁上雌性生殖细胞数量增加, 部分次级卵母细胞生成卵柄。小部分成熟卵母细胞从滤泡壁脱落进入滤泡腔, 大量未发育成熟的卵母细胞占据着滤泡。此期为10月—11月下旬
成熟期(Ⅲ) 性腺增殖至软体部腹缘和足基部, 呈白色, 肉眼可分辨雌雄。此期滤泡最大, 结缔组织退化, 滤泡相互挤压呈不规则形。滤泡壁变为单层, 其上残留少数初级卵母细胞。次级卵母细胞卵柄断裂进入滤泡腔内, 发育为成熟卵子, 滤泡腔内卵子形状不规则。此期为12月—次年3月底
排放期(Ⅳ) 性腺仍饱满, 大部分成熟卵子排出体外, 腔内残留着少量成熟卵子与滤泡壁相连。滤泡壁变厚, 滤泡逐渐缩小, 呈现出大小不一的空腔, 滤泡间结缔组织开始增多。此期为次年4月
休止期(Ⅴ) 软体部消瘦, 性腺变薄, 无法从软体部颜色分辨雌雄。滤泡间隙进一步加大, 结缔组织增长挤压滤泡。滤泡内已无成熟卵子, 滤泡壁上可见少量处于重吸收的卵原细胞, 滤泡壁变厚呈粗线条状。此期为5月下旬—8月中旬

2.3 施氏獭蛤卵巢发育各期的周年变化规律

表3可知, 在广西北部湾施氏獭蛤一周年采集的240个样品中, 雌性个体123个,雌性个体占总数的51.25%, 雌雄同体5个, 占全年采样总数的2.08%。施氏獭蛤雌性生长群体增殖期出现在每年8月下旬—9月中旬, 水温29.70℃~29.80℃; 10月下旬—11月下旬为主要生长期, 水温22.0℃~25.5℃; 12月至翌年3月份为成熟期, 水温15.0℃~26.3℃; 每年4月份为排放期, 水温27.5℃; 每年5—8月为休止期, 水温29.5℃~30.5℃。
表3 广西北部湾施氏獭蛤卵巢发育各期的周年分布

Tab. 3 Annual distribution of ovarian development stages of L. sieboldii in Beibu Gulf, Guangxi

取样日期 盐度/‰ 水温/℃ 总数 雌雄同体数 卵巢发育分期
2020-11-26 27.4 22.0 9 8 1
2020-12-21 27.5 17.0 10 2 2 5 1
2021-01-08 29.4 15.0 9 1 8
2021-02-23 30.9 26.3 14 4 10
2021-03-20 30.0 21.0 11 3 8
2021-04-22 30.0 27.5 12 10 2
2021-05-26 28.0 29.5 12 12
2021-06-21 28.4 30.5 7 1 1 1 5
2021-07-14 29.0 29.7 11 2 4 6
2021-08-17 30.0 29.8 10 1 1 1 1 3 4
2021-09-15 31.0 29.8 9 1 4 1 1 3
2021-10-20 29.0 25.5 9 2 5 2

2.4 施氏獭蛤卵子的发生

参考李霞(2019)对卵子发生的分期, 将施氏獭蛤卵子发生分为4个时期, 各时期特征见图4表4
图4 施氏獭蛤卵子发生各期组织切片

a. 增殖期, 示卵原细胞(OG)、核仁(NU); b. 小生长期, 示卵原细胞(OG)、初级卵母细胞(PO)、核仁(NU)、滤泡细胞(FC); c. 大生长期, 示次级卵母细胞(SO)、核仁(NU)、卵原细胞(OG)、初级卵母细胞(PO); d.成熟期, 示成熟卵母细胞(OV)、核仁(NU)、卵原细胞(OG); e. 卵巢排放期, 示成熟卵子退化(DO)、核仁(NU)

Fig. 4 Tissue sections of female L. sieboldii at different stages of oogenesis. (a) Proliferation period, showing oogenocyte (OG), nucleoli (NU); (b) small-growth period, showing oogenocyte (OG), primary oocyte (PO), nucleoli (NU), follicular cells (FC); (c) large-growth period, showing secondary oocyte (SO), nucleoli (NU), oogenocyte (OG), primary oocyte (PO); (d) mature period, showing ovum (OV), nucleoli (NU), oogenocyte (OG); (e) Ovarian spawning stage: degenerative oocyte (DO), nucleoli (NU)

表4 施氏獭蛤卵子发生各期特点

Tab. 4 Characteristics of oogenesis stages of L. sieboldii

发生分期 各期发生特点
增殖期 出现在Ⅰ—Ⅳ期卵巢。体积小、染色浅的卵原细胞大量增殖, 与滤泡细胞一起平行排列于滤泡壁基膜上
小生长期 出现在Ⅰ—Ⅳ期卵巢。卵原细胞体积增大, 分化形成生长较缓慢的初级卵母细胞, 细胞的大部分仍紧贴滤泡壁基膜, 细胞核内有一核仁常偏位, 细胞周围围绕着一层滤泡细胞。细胞内较为空虚, 染色质数量较少且不清晰, 细胞核染色较浅
大生长期 初级卵母细胞迅速生长, 细胞核内卵黄粒大量形成, 细胞质内细胞器大量形成, 生长期可延续到第一次减数分裂形成次级卵母细胞前, 出现在Ⅰ—Ⅳ期卵巢
成熟期 出现在施氏獭蛤卵巢发育的Ⅲ—Ⅳ期。此期成熟卵子体积达到最大, 成熟卵子呈不规则圆形。初级卵母细胞经过小、大生长期, 胞质内物质大量累积, 发育到次级卵母细胞, 逐渐脱离滤泡壁基膜, 后期卵柄断裂萎缩, 卵母细胞发育成熟进入滤泡腔内, 少数成熟卵子退化被滤泡重吸收

2.5 施氏獭蛤雌性生殖细胞的发育

根据施氏獭蛤雌性生殖细胞出现的时期及分布位置, 滤泡细胞生成情况等, 将施氏獭蛤雌性生殖细胞的发育划分5个时期。根据细胞质中卵黄粒和细胞器的变化情况, 从次级卵母细胞发育到成熟卵子的过程分为3个阶段。

2.5.1 卵原细胞

Ⅰ—Ⅳ期卵巢内均可见, 细胞直径6.9~8.3μm(图5a), 常见于增殖期和生长期卵巢的滤泡中, 细胞面积的3/4常附于滤泡壁基膜并与其平行。整体染色较浅, 周围围绕着一层滤泡细胞。组织切片观察下, 部分卵原细胞核内核仁清晰, 靠近细胞内膜, 部分卵原细胞内核仁不清晰, 胞质空虚(图4a、b)。
图5 施氏獭蛤雌性生殖细胞发育各期超微结构

a. 卵原细胞(OG)和初级卵母细胞(PO), ×1000; b. 卵巢局部及次级卵母细胞(SO), ×1500; c. 成熟卵母细胞(OV), ×1500

Fig. 5 Ultrastructure of female L. sieboldii germ cells at different developmental stages (SEM). (a) Oocyte (OG) and primary oocyte (PO), ×1000; (b) secondary oocyte (SO), ×1500; (c) mature oocytes (OV), ×1500

2.5.2 初级卵母细胞

Ⅰ—Ⅳ期卵巢内均可见, 细胞体积增大呈突起状, 直径约为11.4~15.6μm(图5a), 卵巢增殖期及生长期的滤泡中最常见, 细胞面积的1/2常附于滤泡壁的基膜上。出现生发泡, 周围常被滤泡细胞包裹, 组织切片观察下染色加深。细胞内出现生发泡, 生发泡内有一个核仁, 核内染色质不明显(图4b)。

2.5.3 次级卵母细胞

Ⅱ—Ⅳ期卵巢内均可见, 细胞体积继续增大, 直径约为22.0~31.8μm(图5b), 生长期和成熟期卵巢的滤泡中最常见, 细胞小部分面积与滤泡壁基膜相连。细胞呈梨形, 周围仍残留滤泡细胞, 细胞尾部变长, 头部伸向滤泡腔内, 此时组织切片染色最深。组织切片观察可见胞内生发泡明显, 核质染色较浅, 染色质呈丝状清晰分布于细胞核内, 核仁明显且位于细胞核一侧(图4c)。

2.5.4 卵黄合成前期卵母细胞

常见于Ⅱ—Ⅳ期卵巢的滤泡中, 卵巢生长期和成熟期滤泡内数目最多, 附着于滤泡壁上的面积进一步减少。细胞呈扁平梨形, 周围仍有少量滤泡细胞, 细胞尾部开始变得细长, 卵黄膜表面凹凸不平, 开始出现微绒毛, 细胞出现极性, 体积较上一期更大, 胞体直径为34.1μm。细胞核较小呈扁平状, 直径14.89μm, 核膜清晰。核仁由单质变成双质, 核仁直径5.57μm, 双质核仁一大一小, 体积较大的部分核仁染色深, 体积较小的部分核仁染色浅。细胞质内存在少量卵黄粒, 细胞器不发达, 出现少量线粒体、滑面内质网和脂滴, 少量线粒体和脂滴被自噬泡包裹。线粒体内管状嵴不明显, 内质网呈条形靠近核膜外侧。细胞核内染色质呈颗粒状分布在核膜边上(图6a—c)。
图6 施氏獭蛤卵子发生及卵黄发生的超微结构

a. 卵黄合成前期卵母细胞, 示细胞核(N)、核仁(NU)、核膜(NM)、染色质(CH)、滤泡(F)、基膜(BM)、卵柄(ES)、多泡小体(MB), ×1000; b. 卵黄合成前期, 示线粒体(M)、滑面内质网(SER)、脂滴(L)、滤泡(F)、微吞饮泡(MP), ×2000; c. 卵黄合成前期吞噬泡, 示线粒体(M)、卵黄(Y)、脂滴(L), ×5000; d. 卵黄合成期卵母细胞, 示细胞核(NU)、基膜(BM), ×300; e. 卵黄合成期, 示线粒体(M)、卵黄(Y)、脂滴(L)、核糖体(R), ×5000; f. 卵黄合成期, 示溶酶体(LY)、卵黄(Y)、线粒体(M), ×5000; g. 卵黄合成期细胞核与细胞质进行物质交换, 示染色质(CH)、细胞核(N)、核孔(NP), ×2000; h. 卵黄合成期, 示粗面内质网(RER)、核膜(NM)、卵黄(Y)、线粒体(M), ×2000; i. 卵黄合成期卵黄形成, ×5000; j. 卵黄合成期, 示高尔基复合体(G)、核糖体(R), ×2000; k. 卵黄合成后期卵母细胞, 示细胞核(N)、核仁(NU), ×300; l. 卵黄合成后期, 示粗面内质网(RER)、线粒体(M), ×2000; m. 成熟卵母细胞, 示细胞核(N)、核仁(NU), ×300; n. 成熟卵母细胞, 示细胞核(N), ×300

Fig. 6 Ultrastructural of oogenesis and vitellogenesis of L. sieboldii. (a) The early period of vitellogenesis oocyte, showing nucleus (N), nucleolus (NU), nuclear membrane (NM), chromatin (CH), follicles (F), basement membrane (BM), egg stalk (ES), multivesicular body (MB), ×1000; (b) previtollogenic stage, showing mitochondria (M), smooth endoplasmic reticulum (SER), lipid droplets (L), follicles (F), micropinocytoticvesicie (MP), ×2000; (c) early yolk synthesis phagocytic vesicle, showing mitochondria (M), yolk granules (Y), lipid droplets (L), ×5000; (d) period of vitellogenesis oocyte, showing nucleus (NU), basement membrane (BM), ×300; (e) vitellogenic stage, showing mitochondria (M), yolk granules (Y), lipid droplets (L), ribosome (R), ×5000; (f) vitellogenic stage, showing primary lysosome (LY), yolk granule (Y), mitochondria (M), ×5000; (g) vitellogenic period nucleus and cytoplasm exchange materials, showing chromatin (CH), nucleus (N), nuclear pore (NP), ×2000; (h) vitellogenic stage, showing rough endoplasmic reticulum (RER), nuclear membrane (NM), yolk granules (Y), mitochondria (M), ×2000; (i) yolk synthesis stage yolk granules are formed, ×5000; (j) vitellogenic stage, showing golgi complex (G), ribosome (R), ×2000; (k) late period of vitellogenesis oocyte, showing nuclei (N), nucleoli (NU), ×300; (l) postvitellogenic stage, showing rough endoplasmic reticulum (RER), mitochondria (M), ×2000; (m) mature oocyte, showing nuclei (N), nucleoli (NU), ×300; (n) mature oocyte, showing nuclei (N), ×300

2.5.5 卵黄合成期卵母细胞

卵母细胞体积增大, 呈椭圆形, 尾部形成卵柄, 细胞极性较上期不明显, 卵黄膜较卵黄合成前期圆滑, 胞体直径61.10μm。细胞核增大, 直径29.98μm。双质核仁直径13.65μm, 染色深的部分核仁体积减小, 染色浅的部分核仁体积增大, 细胞质内线粒体等细胞器和卵黄粒数量增加。线粒体嵴明显, 部分线粒体转化为卵黄。内质网呈环状和多层条状两种形式。高尔基复合体内部包裹形成囊泡。细胞核部分核膜泡化, 以小泡包裹的形式将核内生成的高电子密度物质裹入其中并通过核孔传递到细胞质中, 实现核内外物质交换(图6d—j)。

2.5.6 卵黄合成后期卵母细胞

此时期的大部分卵母细胞已成熟, 进入滤泡腔内, 卵柄退化。卵母细胞体积进一步扩大, 卵黄膜光滑, 胞体直径约为64.64μm。透射电镜观察下, 细胞核近圆形, 直径31.02μm。胞核内双质核仁逐渐消失并开始转变为单核仁, 此时体积较大的核仁染色浅, 小的核仁染色深, 核仁直径14.63μm。细胞质内细胞器数量较多, 线粒体数量显著, 线粒体嵴消失, 转化为卵黄粒。高尔基复合体特征不明显, 以囊泡的形式存在于细胞质中。粗面内质网内卷包裹形成卵黄粒。胞质内卵黄数量增多(图6k—n)。

2.5.7 成熟卵母细胞

卵巢发育的Ⅱ~Ⅳ期均可见, 常见于卵巢成熟期和排放期的滤泡腔中。成熟卵母细胞近圆形, 胞体直径70.00~74.90μm(图5c)。胞质内大小不等的卵黄分布于整个卵母细胞。细胞核体积达到最大, 呈圆形, 直径约为35.36μm, 双质核仁消失, 细胞核内只剩一个或没有核仁, 核仁直径9.49μm, 细胞整体染色较深。部分成熟卵母细胞核仁缺失(图6m—n)。

2.5.8 退化卵子

卵巢发育的Ⅳ—Ⅴ期可见, 存在于排放后期和休止期的卵巢滤泡壁。滤泡壁变厚, 未排放出滤泡的成熟卵子固缩在滤泡壁上, 胞质萎缩, 核仁逐渐消失, 细胞体积减小, 胞体直径25.58~32.39μm(图4e)。

2.6 施氏獭蛤卵母细胞卵黄发生的超微结构特征

施氏獭蛤卵子属均黄卵, 卵黄合成中期卵母细胞的胞质中卵黄大量形成, 卵黄合成物质来源不同, 分为内、外源性卵黄。

2.6.1 内源性卵黄的形成

根据施氏獭蛤卵黄不同发生时期卵母细胞透射电镜的观察结果, 内源性卵黄形成过程中各细胞器特征和变化情况见表5图6
表5 施氏獭蛤内源性卵黄形成过程各细胞器特点

Tab. 5 Characteristics of organelles during endogenous vitellogenesis in L. sieboldii

细胞器 细胞器变化情况
线粒体 线粒体为细胞内部活动提供能量, 卵黄合成前期胞质中线粒体数量较少, 内部嵴少且清晰。随着卵黄的合成, 线粒体数量逐渐增多, 内部嵴模糊, 卵黄物质在线粒体基质中的内膜沉积并逐渐充满整个线粒体, 线粒体内膜逐渐溶解消失, 最终形成单层膜结构的卵黄粒(图6e—f)
粗面内质网 卵黄合成期粗面内质网呈环形状和片条状, 片条状粗面内质网两端形成囊泡, 环状粗面内质网内部包裹成椭圆形囊泡, 胞质中高电子密度物质沉积逐渐形成卵黄粒。环状粗面内质网中央盘绕成球状, 胞质中的脂滴、蛋白质等物质沉积在中央, 随着沉淀物质的增加体积不断扩大最终形成卵黄粒(图6h)
高尔基复合体 扁平囊两端发育形成囊泡, 部分囊泡内部被脂类物质沉积形成电子密度较浅的脂滴, 囊泡通过内质网和核糖体的加工, 内部沉积卵黄蛋白形成卵黄粒(图6j)
溶酶体 溶酶体体积较小, 约0.5μm, 电子密度高, 基质均匀, 吞噬胞质内的核糖体、线粒体等细胞器和蛋白质等物质并将其分解沉积形成卵黄(图6e—f)
核糖体 核糖体在施氏獭蛤卵黄发生期间大量游离在细胞质中并被各细胞器及囊泡吸收, 间接参与合成卵黄(图6e、j)

2.6.2 外源性卵黄的形成

根据施氏獭蛤透射电镜观察结果, 卵黄合成前期卵母细胞以质膜凹陷和微吞饮两种方式分别从卵周隙和滤泡吸收合成卵黄所需的蛋白质等营养物质。卵母细胞靠近滤泡壁基质的质膜内形成微吞饮泡与滤泡壁基质内的滤泡进行物质交换。靠近卵周隙一侧的质膜内陷产生小泡并逐渐脱离质膜形成多泡小体, 通过多泡小体转运、吸收外源性物质, 部分多泡小体内卵黄物质沉积逐渐形成卵黄粒(图6a、b)。卵黄合成期和后期卵母细胞脱离滤泡壁, 卵柄退化消失, 细胞呈近圆形, 与胞外物质交换活动减弱(图6d、k)。

2.7 施氏獭蛤雌雄同体及性转换现象

2.7.1 雌雄同体类型

根据广西北部湾海域雌性施氏獭蛤的周年性腺组织切片观察结果, 雌性施氏獭蛤成贝性腺内出现雌雄生殖细胞共存于同一滤泡内(A)和雌雄滤泡并存于同一性腺内(B)两种类型的雌雄同体, A型较为少见, B型较为常见。A、B型雌雄同体可同时出现在同一性腺中(图7a), B型雌雄同体可单独出现在性腺中(图7b—d)。
图7 施氏獭蛤雌雄同体组织切片

a—d. 雌性向雄性转换, 示雌雄生殖细胞共存同一滤泡(A)、雌雄滤泡并存同一性腺(B); c—d. 雌雄性腺共存, 精巢处于排放期, 卵巢处于休止期

Fig. 7 Tissue section of hermaphroditism of L. sieboldii. (a-d) Female to male conversion showing male and female germ cells coexist in the same follicle (A), male and female follicles coexist in the same gonad (B); (c-d) Coexistence of male and female gonads with the spermary in the spawning stage and the ovarian in the resting stage

2.7.2 性转换方向

根据施氏獭蛤组织切片中雌雄滤泡占比及滤泡内雌雄生殖细胞发育程度, 施氏獭蛤性转换趋向表现为雌性向雄性转换。
A、B型雌雄同体共存的性腺和B型雌雄同体独存的性腺内, 雌性滤泡数量少, 雄性滤泡数量多, 性腺整体处于成熟、排放和休止期(图7)。A、B型雌雄同体共存的性腺中: A型雌雄同体滤泡的滤泡壁较薄, 卵母细胞萎缩退化, 紧贴滤泡壁, 滤泡内存在大量精母细胞且大部分已成熟; B型雌雄同体中雌性滤泡内的雌性生殖细胞处于成熟卵母细胞期, 大部分已排放, 雄性滤泡内的雄性生殖细胞处于成熟精细胞期, 大部分仍未排放。性腺处于成熟期(图7a)。B型雌雄同体单独存在的性腺中: 部分雌性滤泡内仍有少量成熟卵母细胞, 大部分雌性滤泡空虚, 滤泡内残留的成熟卵母细胞逐渐退化被滤泡重吸收, 滤泡壁增厚, 滤泡周围结缔组织大量增生。雄性滤泡空虚, 处于排放后期—休止期(图7b—d)。

3 讨论

3.1 广西北部湾雌性施氏獭蛤繁殖周期及影响因素

双壳贝类的生长和繁殖具有年度周期性, 不同种类及不同地理群体相同种类的繁殖周期和产卵高峰期存在差异(Joaquim et al, 2008; 郭春阳 等, 2016)。正确划分广西北部湾施氏獭蛤性腺的发育时期并判定成熟度, 有助于了解其性腺发育规律, 确定繁殖周期和产卵季节。本研究以施氏獭蛤卵巢为研究对象, 利用周年组织切片和群体划分的方法表明, 施氏獭蛤卵巢分期明显, 卵巢发育周期为1年, 根据全年性腺指数和肥满度发现, 全年只有1个繁殖期和1个产卵高峰期, 结合组织切片观察结果, 广西北部湾雌性施氏獭蛤繁殖盛期为12月份至翌年4月份, 较广东湛江海域施氏獭蛤推迟2个月进入繁殖盛期(曹伏君 等, 2012), 可能与取样地点、盐度和光照有关。此外, 本研究中施氏獭蛤个体和群体性腺发育时间不完全一致, 部分个体性腺发育比群体提前或滞后, 与钝缀锦蛤(Tapes conspersus)性腺发育相似(连昌朋 等, 2022)。性腺指数和肥满度并未在1月份达到最高, 而是在3月底达到最高, 表明广西北部湾雌性施氏獭蛤在每年3月底前后达到成熟期, 与组织切片观察到的性腺成熟期时间相同。较低的水温和盐度可能推迟了广西北部湾海域雌性施氏獭蛤卵巢的成熟, 广西北部湾海域12—1月水温15.0℃~17.0℃, 盐度27.4‰~29.4‰, 远低于施氏獭蛤的最适生长温度(蔡英亚 等, 2005), 略低于湛江海域当月水温(15.1℃~18.1℃)及盐度(30.7‰~31‰) (刘志刚 等, 2011)。栗志民 等(2011)研究表明, 在盐度28.3‰~29.1‰, 水温14℃~19℃条件下, 企鹅珍珠贝(Pteria penguin)的滤食率和吸收率随水温的升高而增大; 在水温27.4℃~27.8℃, 盐度19‰~31‰条件下, 滤食率和吸收率随盐度升高而增大。Cross等(2014)研究表明, 较低水温可推迟爱尔兰大竹蛏(Ensis siliqua)产卵期的到来。
贝类产卵高峰期与性腺成熟期的时间不一致, 产卵高峰期略滞后于性腺成熟期(巫旗生 等, 2017)。本研究中, 组织切片的结果显示, 施氏獭蛤卵巢发育成熟后仍无成熟卵子排出, 进入4月后, 水温上升至27.5℃, 盐度上升至30‰, 在水温和盐度满足施氏獭蛤最适生长环境后卵巢滤泡壁破裂, 大量成熟卵子排出体外, 达到施氏獭蛤产卵高峰期。
双壳贝类的繁殖活动受内外因素影响显著(Li et al, 2006; 种金豆 等, 2020), 如性腺内脂质和蛋白质含量、水温、藻类丰度等(Dridi et al, 2007; Ras et al, 2013)。柯巧珍等(2012)研究发现, 水温和藻类数量对山东沿海四角蛤蜊(Mactra veneriformis)性腺发育影响显著, 较高的水温和藻类数量促进四角蛤蜊配子的排放。Berthelin等(2000)研究发现, 长牡蛎(Crassostrea gigas)配子在春季和夏季的发生与其性腺中脂质和蛋白质含量增加有关。本研究发现, 广西北部湾施氏獭蛤卵巢于9月份开始发育, 此时水温较高, 与淮河橄榄蛏蚌(Solenaia oleivora Heude)(闻海波 等, 2020)相同, 与大部分性腺在高温季节成熟的贝类不同(刘文广 等, 2011; Bi et al, 2016); 4月份水温上升时成熟卵子大量排放, 推测由体外环境变化和体内营养物质含量增加所致。

3.2 施氏獭蛤卵子发生和发育的特点

划分卵子发生的过程对掌握贝类的繁殖具有重要意义。许多研究者依据卵子发生过程中卵子的大小, 卵子胞质内的变化对卵子的发生进行不同的划分。余祥勇 等(2010)根据斗嫁䗩(Cellana grata)卵细胞形态特征将其发生分为卵原细胞至退化卵子共6个时期。应雪萍(2002a)根据透射电镜中泥螺(Bullacta exarate)卵母细胞体积、卵黄生成量及胞质内细胞器的变化特点将卵母细胞划分为卵原细胞至卵黄合成后期卵母细胞4个时期。本实验使用组织切片和透射电镜手段, 根据施氏獭蛤雌性生殖细胞出现的时期及其在不同发育时期的卵巢滤泡内表现等将雌性生殖细胞划分为4个时期, 分别为增殖期、小生长期、大生长期和成熟期, 与李霞(2019)对水产动物卵子发生的分期相同, 与潘彬斌 等(2010)对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)卵子发生的分期相似。同时, 根据卵子发生过程中雌性生殖细胞内外部变化情况, 将广西北部湾施氏獭蛤卵子发育分为卵原细胞至卵子退化8个时期, 与吴洪流(2000)对波纹巴非蛤(Paphia undulata)卵子发育分期相似, 由于组织切片下施氏獭蛤初级卵原细胞和次级卵原细胞体积区分不大, 内部物质区别不明显, 故没有将两者区分。
不同发育时期的卵母细胞核仁结构发生变化(Attila et al, 2018)。广西北部湾施氏獭蛤卵子发育过程中, 卵径由卵原细胞6.90~8.30μm发育到成熟卵子70.00~74.90μm, 核膜随着卵母细胞的发育由平滑变为不规则, 发育至成熟卵子时核膜又变得圆滑。此外, 卵黄合成中期, 核仁开始产生明显变化, 核膜内陷或突起与细胞质交换物质, 出现核质外排物, 卵黄发生期卵母细胞的核仁一端凸出, 核仁变为两个, 与大部分双壳贝类卵子发育相同(顾海龙 等, 2013; 邵艳卿 等, 2017)。姜永华 等(2005)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)卵子发生的研究发现, 细胞核经核孔排出大量核仁外排物, 核质之间物质交换强烈。核质外排物可能与线粒体和内质网囊泡融合, 最终合成卵黄粒(Żelazowska et al, 2020)。杨耀聪 等(1994)对尖紫蛤(Hiatula acuta)生殖周期的研究表明, 核仁蛋白质组分含量的不同是双质核仁产生的原因。此外, 由于本实验组织切片制样和透射电镜制样对样品的制备和处理方法不同, 导致细胞体积大小在组织切片和透射电镜下呈现一定差异。

3.3 卵黄的来源与发生

细胞器自身合成的内源性卵黄和胞质外其他细胞、器官合成的卵黄前体等物质进入胞质后形成的外源性卵黄共同构成了动物卵黄(丁汉波, 1987)。Eckelbarger等(2021)研究表明, 双壳贝类卵母细胞可通过细胞膜表面受体介导作用从卵泡细胞、体细胞基质和脂肪粒细胞吸收营养物质。顾海龙 等(2013)在研究泥蚶(Tegillarca granosa)初级卵母细胞的研究发现, 卵黄发生过程中, 内源性卵黄来源于质膜凹陷形成的微吞饮泡, 外源性卵黄来源于滤泡细胞和消化腺。本研究中, 卵母细胞与滤泡细胞粘连, 细胞膜表面微绒毛发达, 胞内多泡小体和微吞饮泡靠近细胞膜内且内部有高电子密度物质沉积, 根据以上特征, 卵母细胞可能从卵周隙和滤泡吸收细胞外源卵黄物质。施氏獭蛤内源性卵黄期间, 线粒体、粗面内质网和高尔基体两端或中部产生囊泡并沉积高电子密度物质, 内源性卵黄的形成方式与文蛤(Meretrix meretrix)(应雪萍, 2002b)、糙海参(Holothuria scabra)(吴明灿 等, 2015)相同。此外, 施氏獭蛤卵黄发生前期, 卵母细胞质中分布着内含线粒体等细胞器和脂滴的自噬泡。自噬泡在卵母细胞发育过程中可能与线粒体、溶酶体和高尔基体等细胞器的囊泡结合, 形成卵黄粒(Żelazowska et al, 2020)。施氏獭蛤外源性卵黄的组成物质有待进一步研究确定。

3.4 施氏獭蛤雌雄同体及性转换方向

海产双壳贝类性别类型分为雌雄异体, 一生中无性转换的雌雄同体, 生长发育的某时期出现性反转, 性腺内短时出现雌雄同体(于非非 等, 2007)。曹伏君 等(2012)在对广东湛江海域施氏獭蛤性腺发育的研究中发现雌雄同体现象, 但未阐明属于何种雌雄同体类型和性转换方向。本研究根据周年性腺组织切片观察, 在当年6—10月份发现部分雌性施氏獭蛤在其性腺成熟后期至休止期间短暂发生性转换, 出现雌雄同体现象, 与虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(周丽青 等, 2014)雌雄同体出现时期和性转换发生时期相同。不同双壳贝类存在多种性转换方向, 根据性腺和滤泡中雌雄生殖细胞的分布和数量可判断性转换方向(于非非 等, 2007), 同样的判断方法已应用在其他双壳贝类中。吴洪流(2002)根据波纹巴非蛤同一性腺内雌雄滤泡的生长情况和滤泡中雌雄生殖细胞的发育情况, 判断性转换方向为雌性向雄性转换。王梅芳 等(1999)根据栉江珧(Atrina pectinate Linnaeus)和二色裂江珧(Pinna bicolor Gemlin)性腺发育情况和性腺内不同类型雌雄同体的生殖细胞分布情况, 将性转换方向分为雄性向雌性转换、雌性向雄性转换和性腺均衡发育。
双壳贝类性别转换受内外部因素影响显著(于非非 等, 2007)。广西北部湾海域施氏獭蛤雌雄同体出现在平均水温29.10℃的下半年, 推测较高的水温和持续的高温诱导施氏獭蛤由雌性向雄性转换。Pouvreau等(2000)研究表明, 1龄性成熟的黑蝶贝(Pinctada margaritifera)出现雌雄同体的比例高于3龄贝, 充足的食物供应有利于性转换的发生。徐红琴 等(2022)对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)雌雄同体和性逆转的研究表明, 高温时产生雌雄同体现象, 表现为雄性向雌性逆转, 低温时表现为雌性向雄性逆转, 温度可能通过调控决定性别的基因表达量, 从而调节生殖滤泡的分化。王如才 等(2008)提出牡蛎性变可能与水温、代谢物质、营养条件和寄居豆蟹有关。影响施氏獭蛤性转换的相关基因和功能有待进一步研究验证。
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