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Journal of Tropical Oceanography >

2023 , Vol. 42 >Issue 5: 56 - 63

DOI: https://doi.org/10.11978/2023038

Marine Chemistry

Cytotoxic steroids from the soft coral Sinularia flexibilis collected off the Xisha

  • GAO Yaxin , 1, 2 ,
  • WANG Hao 2 ,
  • DAI Haofu 2 ,
  • XIA Zhihui , 1 ,
  • ZENG Yanbo , 1, 2
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  • 1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, China
  • 2. Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
ZENG Yanbo. email: ;
XIA Zhihui. email:

Received date: 2023-03-23

  Revised date: 2023-04-21

  Online published: 2023-05-06

Supported by

Key Research and Development Project of Hainan Province(ZDYF2021SHFZ107)

National Natural Science Foundation of China(41776093)

Financial Fund of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P. R. of China(NFZX2021)

Fold

Abstract

Thin layer chromatography, silica gel column chromatography, gel column chromatography and semi preparative high-performance liquid chromatography were used to study the chemical compositions of Sinularia flexibilis, a soft coral collected off the Xisha islands in the South China Sea. Eight steroids were identified from the soft coral S. flexibilis, 24-methylcholesta-5,24(28)-diene-3β,19-diol (1), (3β,23S)-ergosta-5,24(28)-diene-3,23-diol (2), 4α-methyl-3β,14β-dihydroxy-5α-ergost-24(28)-en-23-one (3), sinulasterol C (4), nephalsterol C (5), 24-methylene-cholesterol (6), 4α-methyl-3β, 8β-dihydroxy-5α-ergost-24(28)-en-23-one (7) and 4α-methyl-ergosterol-24-en-3β-ol (8) by the physical and chemical properties, extensive spectroscopic analysis and comparison with the reported data from literatures. The results of cytotoxic activity test showed compounds 2, 3 and 5 had strong inhibitory activity on K562 (human chronic myeloid leukemia cells), with IC50 (half maximal inhibitory concentration) values of (5.48 ± 0.22) μmol·L-1, (4.80 ± 0.11) μmol·L-1 and (2.08 ± 0.11) μmol·L-1, respectively.

Key words： soft coral; Sinularia flexibilis; chemical constituent; steroids; cytotoxicity

Cite this article

GAO Yaxin , WANG Hao , DAI Haofu , XIA Zhihui , ZENG Yanbo . Cytotoxic steroids from the soft coral Sinularia flexibilis collected off the Xisha[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2023 , 42(5) : 56 -63 . DOI: 10.11978/2023038

软珊瑚是海洋中最普遍的低等无脊椎动物之一, 种类繁多, 广泛分布于我国热带和亚热带海域。它们固着在先辈珊瑚的石灰质遗骨堆上生长, 身体柔软, 没有形态学上的物理防御机制, 处于食物链底层, 易受到海洋中其他海洋生物的捕食, 但是它们却能够在低温、寡营养、高压、高盐的严苛海洋环境中长久生存, 这说明它们可以分泌一些具有自卫能力, 可以避免动、植物和微生物侵害的毒性化学物质(王长云 等, 2008)。自20世纪60年代起, 研究人员们从软珊瑚的次级代谢产物中发现了一批具有抗病毒、拒捕食、抗肿瘤、抗菌、防污等生物活性的化合物, 为海洋药物的开发及其先导化合物的筛选提供了重要条件(李蕊, 2012)。
短指软珊瑚(Sinularia属)在分类学上属于珊瑚虫纲(Anthozoa), 八放珊瑚亚纲(Octocorallia), 软珊瑚目(Alcyonacea), 海鸡冠亚目(Alcyoniina), 海鸡冠科(Alcyoniidae), 是海洋生物活性天然产物的重要来源之一(张乃霞, 2014)。自1975年以来, 许多次生代谢产物已从各种Sinularia属的软珊瑚中分离出来, 主要包括甾体类、萜类、生物碱类、含氮化合物和脂肪族类化合物, 其中有不少结构新颖的化学成分。这些次生代谢物表现出广泛的生物活性, 例如细胞毒性、抗炎、防污和抗菌等(严小红 等, 2005; 梁林富 等, 2013)。Sinularia属软珊瑚是多种含氧甾体的丰富来源(Zhang et al, 2006; Lakshmi et al, 2009; Sarma et al, 2009)。含氧甾体的化学多样性源于氧化甾醇碳骨架, 其具有不同侧链的各种组合、氧化水平、环断裂和四环核仁的重排, 不同的甾体具有不同的生物活性(Carvalho et al, 2011; Liang et al, 2013; Tseng et al, 2016; Wu et al, 2018)。
在我们从南海软珊瑚中发现生物活性成分的过程中(Li et al, 2021; 李金凤 等, 2022; 吴敏 等, 2023), 本次研究选用采集自中国南海西沙群岛的软珊瑚S. flexibilis为研究对象, 综合运用凝胶柱层析、硅胶柱层析以及半制备HPLC (高效液相色谱)等分离技术, 对软珊瑚S. flexibilis的丙酮提取物进行了分离鉴定, 得到了8个化合物(化合物1~8)(图1), 并对这8个化合物进行了肿瘤细胞毒活性测试。
图1 化合物1~8的结构

Fig. 1 The chemical structures of compounds1~8

1 材料与方法

1.1 试验材料

短指软珊瑚样品(干重473.8g)采自中国南海西沙海域-20m深处的海底(2019年5月), 经海南大学李秀保教授鉴定为Sinularia flexibilis, 标本保存于中国科学院上海药物所新药研究国家重点实验室(编号19-XS-7)。
人慢性髓原白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌细胞(Hela)均购于中国科学院生命科学研究院细胞库。

1.2 主要仪器与试剂

仪器: 旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社), Agilent 1260分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司), 半制备高效液相色谱仪(南京元宝峰医药科技有限公司), 超净工作台(上海昕仪仪表有限公司), Bruker AV Ⅲ (400MHz, 500MHz)型超导核磁共振仪(德国Bruker公司)。
试剂: 甲醇(色谱纯, 天津康科德科技有限公司), 丙酮(分析纯, 广东西陇科学有限公司), 石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇(工业级重蒸, 西陇科学股份有限公司), 薄层硅胶板GF254 (青岛海洋化工有限公司), 柱色谱用硅胶(60~80目、200~300目、300~400目, 青岛海洋化工有限公司), Sephadex LH-20凝胶(Merck公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 提取与分离

化合物提取和分离方法如图2所示。
图2 短指软珊瑚Sinularia flexibilis的化学成分提取与分离流程图

Fig. 2 Flow chart of extraction and isolation from Sinularia flexibilis

将-20℃冷冻保存的短指软珊瑚S. flexibilis (干重473.8g)切碎, 丙酮超声提取3次, 提取液过滤后经减压浓缩除去丙酮, 均匀分散在水中, 用等体积的乙醚、正丁醇分别萃取3次, 收集到的有机相萃取液分别减压浓缩后得到乙醚部分20.3g, 正丁醇部分6.2g。将乙醚部分经过硅胶柱层析, 用石油醚-乙酸乙酯(100%~0, v/v)、氯仿-甲醇(7:3, v/v)梯度洗脱, 分得17个组分, 极性由低到高分别为Fr. A (0.3g)、Fr. B (0.1g)、Fr. C (3.4g)、Fr. D (3.1g)、Fr. E (1.0g)、Fr. G (1.6g)、Fr. H (0.5g)、Fr. I (0.4g)、Fr. J (0.2g)、Fr. K (0.7g)、Fr. L (0.4g)、Fr. M (0.3g)、Fr. N (0.4g)、Fr. O (0.3g)、Fr. P (0.2g)、Fr. Q (0.5g)和Fr. R (3.0g)。
Fr. E (1.0g)经Sephadex LH-20柱层析, 用石油醚-氯仿-甲醇(2:1:1, v/v)洗脱, 得13馏分(Fr. E1 ~ Fr. E13)。第9馏分(Fr. E9)经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯(20:1, v/v)洗脱, 再得7个馏分(Fr. E9A ~ Fr. E9G), 将第3个馏分(Fr. E9C)经硅胶柱层析, 石油醚-二氯甲烷(4:1, v/v)洗脱, 得到化合物8 (23.5mg)。
Fr. I (0.4g)经Sephadex LH-20柱层析, 用石油醚-氯仿-甲醇(2:1:1, v/v)洗脱, 得6馏分(Fr. I1 ~ Fr. I6)。第4馏分(Fr. I4)经硅胶柱层析, 石油醚-二氯甲烷(2:3, v/v), 再得7个馏分(Fr. I4A ~ Fr. I4G), 将第7馏分(Fr. I4G)经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯(9:1, v/v)洗脱, 又得5个馏分(Fr. I4G1 ~ Fr. I4G5), 将第4馏分(Fr. I4G4)经半制备高效液相色谱(MeOH-H2O, 90:10, v/v)得到化合物7 (22.7mg, tR=20.5min, 流速3mL·min-1)。
Fr. J (0.2g)经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯(20:1 ~ 3:1, v/v)梯度洗脱, 得15个馏分(Fr. J1 ~ Fr. J15), 第10馏分(Fr. J10)经硅胶柱层析, 二氯甲烷-丙酮(5:1, v/v)洗脱, 得11个馏分(Fr. J10A ~ Fr. J10K), 将第1馏分(Fr. J10A)经硅胶柱层析, 石油醚-丙酮(12:1, v/v)洗脱得到化合物2 (3.6mg)。第9馏分(Fr. J9)经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯(12:1, v/v)洗脱, 得5个馏分(Fr. J9A ~ Fr. J9E), 将第3馏分(Fr. J9C)经半制备高效液相色谱(MeOH-H2O, 90:10, v/v)得到化合物3 (3.4mg, tR=8.1min, 流速4mL·min-1)。第11馏分(Fr. J11)经硅胶柱层析, 二氯甲烷洗脱得到化合物4 (7.2mg)。
Fr. O (0.3g)经Sephadex LH-20柱层析, 用石油醚-氯仿-甲醇(2:1:1, v/v)洗脱, 得6馏分(Fr. O1 ~ Fr. O6), 第4馏分(Fr. O4)经半制备高效液相色谱(MeOH-H2O, 90:10, v/v)得到化合物1 (7.9mg, tR=16.0min, 流速4mL·min-1)。
Fr. Q (0.5g)经硅胶柱层析, 石油醚-丙酮梯度洗脱, 分成13个馏分(Fr. Q1 ~ Fr. Q13), 第11馏分(Fr. Q11)经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯(3:1 ~ 2:1, v/v)梯度洗脱, 得6个馏分(Fr. Q11A ~ Fr. Q11F), 第4馏分(Fr. Q11D)经硅胶柱层析, 二氯甲烷-丙酮(20:1, v/v)洗脱得到化合物5 (20mg)。第4馏分(Fr. Q4)经半制备高效液相色谱(MeOH-H2O, 98:2, v/v)得到化合物6 (4.8mg, tR=10.3min, 流速3mL·min-1)。

1.3.2 肿瘤细胞毒活性测试方法

采用MTT [5-二苯基四氮唑溴盐]比色法测试化合物1~8对5种人体肿瘤细胞的体外细胞毒活性。试验设阴性对照组[二甲基亚砜(DMSO)溶剂]、阳性对照组(顺铂)和6个不同质量浓度(0.2、0.6、1.8、5.4、16.2、48.6μg·mL-1)的待测样品溶液, 每个浓度设3个平行。
试验步骤: 1) 将5种人体肿瘤细胞制成单细胞悬液(浓度约为5×104个·mL-1), 接种100μL至96孔板上; 2) 置于恒温箱中培养24h (37℃, 5% CO2, 湿度90%); 3) 加入待测样品溶液10μL, 继续培养72h; 4) 再加入15μL配制好的MTT溶液(5mg·mL-1), 在恒温箱中孵育4h; 5) 吸去上清液, 再向每孔加入100μL DMSO, 使其充分溶解; 6) 使用酶标仪测量其在波长为490nm下的吸光度(A), 计算生长抑制率及其半数最大抑制浓度(IC50)值(于淼 等, 2021)。

2 试验结果

2.1 结构鉴定

化合物1: 白色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈紫红色; HRESIMS m/z 437.3378 [M+Na]+ (计算值: C28H46O2Na, 437.3390); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$-22.8° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (500MHz, CD3OD) δH: 3.47(1H, m, H-3), 5.64(1H, m, H-6), 0.81(3H, s, H-18), 3.60(1H, d, J=11.6Hz, H-19a), 3.86(1H, d, J=11.6Hz, H-19b), 1.01(3H, d, J=6.5Hz, H-21), 1.06(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.07(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 4.69(1H, br s, H-28a), 4.76(1H, br s, H-28b); 13C-NMR (125MHz, CD3OD) δC: 34.6(C-1), 32.6(C-2), 72.4(C-3), 43.3(C-4), 138.0(C-5), 126.4(C-6), 32.7(C-7), 34.4(C-8), 52.2(C-9), 42.5(C-10), 23.0(C-11), 41.6(C-12), 43.8(C-13), 59.0(C-14), 25.2(C-15), 29.3(C-16), 57.4(C-17), 12.6(C-18), 63.5(C-19), 37.0(C-20), 19.2(C-21), 36.0(C-22), 32.1(C-23), 157.8(C-24), 34.9(C-25), 22.3(C-26), 22.5(C-27), 106.9(C-28)。以上理化特征及波谱数据与文献(Duh et al, 1998)对照基本一致, 故鉴定化合物1为24-亚甲基胆甾-5,24(28)-二烯-3,19-二醇(24-methylcholesta-5,24(28)-diene-3β,19-diol)。
化合物2: 淡绿色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈红棕色; HRESIMS m/z 437.3378 [M+Na]+ (计算值: C28H46O2Na, 437.3390); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+13.7° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 1.05(1H, m, H-1a), 1.87(1H, m, H-1b), 1.42(1H, m, H-2a), 1.84(1H, m, H-2b), 3.52(1H, m, H-3), 2.23(1H, m, H-4a), 2.30(1H, m, H-4b), 5.35(1H, br d, J=5.2Hz, H-6), 1.60(1H, m, H-7a), 1.99(1H, m, H-7b), 1.50(1H, m, H-8), 0.87(1H, m, H-9), 1.43(1H, m, H-11a), 1.53(1H, m, H-11b), 1.18(1H, m, H-12a), 2.03(1H, m, H-12b), 0.95(1H, m, H-14), 1.17(1H, m, H-15a), 1.61(1H, m, H-15b), 1.25(1H, m, H-16a), 1.91(1H, m, H-16b), 1.16(1H, m, H-17), 0.67(3H, s, H-18), 1.01(3H, s, H-19), 1.43(1H, m, H-20), 1.00(3H, d, J=6.5Hz, H-21), 1.28(1H, m, H-22a), 1.77(1H, m, H-22b), 4.20(1H, t, J=6.7Hz, H-23), 2.29(1H, m, H-25), 1.08(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.09(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 4.92(1H, s, H-28a), 5.01(1H, s, H-28b); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 37.4(C-1), 31.8(C-2), 72.0(C-3), 42.4(C-4), 140.9(C-5), 121.8(C-6), 32.1(C-7), 32.0(C-8), 50.2(C-9), 36.7(C-10), 21.2(C-11), 39.9(C-12), 42.6(C-13), 56.9(C-14), 24.4(C-15), 28.5(C-16), 57.0(C-17), 12.0(C-18), 19.6(C-19), 34.2(C-20), 19.7(C-21), 42.8(C-22), 74.6(C-23), 159.4(C-24), 30.0(C-25), 23.3(C-26), 23.7(C-27), 108.2(C-28)。以上理化特征及波谱数据与文献(Cheng et al, 2009)对照基本一致, 故鉴定化合物2为(3β,23S)-ergosta-5,24(28)-diene-3,23-diol。
化合物3: 白色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈紫色; HRESIMS m/z 911.7063 [2M+Na]+ (计算值: C58H96O6Na, 911.7099); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+65.1° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 1.80(1H, m, H-15), 0.97(3H, s, H-18), 0.98(3H, s, H-19), 2.37(1H, m, H-20), 0.87(3H, d, J=6.4Hz, H-21), 2.68(1H, dd, J=15.4, 3.3Hz, H-22a), 3.07(1H, td, J=10.7, 5.0Hz, H-22b), 2.91(1H, m, H-25), 1.00(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.02(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 5.65(1H, br s, H-28a), 5.90(1H, br s, H-28b), 0.96(3H, s, H-29); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 27.9(C-1), 41.0(C-2), 76.7(C-3), 51.6(C-4), 59.4(C-5), 18.9(C-6), 20.0(C-7), 38.6(C-8), 56.3(C-9), 36.3(C-10), 18.3(C-11), 39.8(C-12), 43.2(C-13), 73.6(C-14), 37.5(C-15), 30.6(C-16), 57.1(C-17), 13.5(C-18), 13.5(C-19), 32.9(C-20), 19.4(C-21), 45.0(C-22), 202.7(C-23), 156.0(C-24), 27.8(C-25), 22.0(C-26), 21.9(C-27), 120.7(C-28), 15.1(C-29)。以上理化特征及波谱数据与文献(Zhang et al, 2003)对照基本一致, 故鉴定化合物3为4α-methyl-3β,14β-dihydroxy-5α-ergost-24(28)-en-23-one。
化合物4: 淡黄色油状物质, 10%硫酸–乙醇显色呈蓝色; HRESIMS m/z 479.3494 [M+Na]+ (计算值: C30H48O3Na, 479.3496); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+40.2° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δH: 1.08(1H, m, H-1a), 1.85(1H, m, H-1b), 1.22(1H, m, H-2a), 1.43(1H, m, H-2b), 3.53(1H, m, H-3), 2.27(2H, m, H-4), 5.21(1H, s, H-6), 5.02(1H, d, J=8.7Hz, H-7), 1.68(1H, d, J=8.9Hz, H-8), 1.12(1H, m, H-9), 1.51(2H, m, H-11), 1.13(1H, m, H-12a), 1.99(1H, m, H-12b), 1.11(1H, m, H-14), 1.28(2H, m, H-15), 1.21(2H, m, H-16), 1.12(1H, m, H-17), 0.69(3H, s, H-18), 1.07 (3H, s, H-19), 1.56 (1H, m, H-20), 0.94 (3H, d, J=6.6Hz, H-21), 1.55 (2H, m, H-22), 1.89 (1H, m, H-23a), 2.08(1H, m, H-23b), 2.22(1H, m, H-25), 1.01(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.02(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 4.65(1H, s, H-28a), 4.71(1H, s, H-28b), 2.02(3H, s, H-OAc); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 37.0(C-1), 31.1(C-2), 71.4(C-3), 41.8(C-4), 145.4(C-5), 121.5(C-6), 75.9(C-7), 36.7(C-8), 55.7(C-9), 36.6(C-10), 21.2(C-11), 39.5(C-12), 43.0(C-13), 48.3(C-14), 25.3(C-15), 28.5(C-16), 55.4(C-17), 12.0(C-18), 19.2(C-19), 35.8(C-20), 18.9(C-21), 34.8(C-22), 31.6(C-23), 156.9(C-24), 33.9(C-25), 22.0(C-26), 22.1(C-27), 106.2(C-28), 21.8(CH3COO-), 171.4(MeCOO-)。以上理化特征及波谱数据与文献(Yang et al, 2020)对照基本一致, 故鉴定化合物4为sinulasterol C。
化合物5: 无色片状晶体, 10%硫酸–乙醇显色呈绿色; HRESIMS m/z 495.3456 [M+Na]+ (计算值: C30H48O4Na, 495.3445); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+45.5° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δH: 3.56(1H, m, H-3), 2.20(1H, d, J=6.7Hz, H-4a), 2.38(1H, ddd, J=13.2, 4.8, 2.2Hz, H-4b), 5.56(1H, s, H-6), 4.95(1H, d, J=8.7Hz, H-7), 0.74(3H, s, H-18), 3.64(1H, d, J=11.6Hz, H-19a), 3.87(1H, d, J=11.5Hz, H-19b), 0.93(3H, d, J=6.5Hz, H-21), 1.02(3H, d, J=6.9Hz, H-26), 1.00(3H, d, J=6.9Hz, H-27), 4.64(1H, s, H-28a), 4.70(1H, s, H-28b), 2.02(3H, s, H-OAc); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 33.3(C-1), 31.9(C-2), 71.0(C-3), 41.8(C-4), 140.3(C-5), 126.8(C-6), 75.3(C-7), 35.8(C-8), 48.7(C-9), 41.6(C-10), 22.1(C-11), 39.9(C-12), 43.3(C-13), 56.7(C-14), 25.1(C-15), 28.5(C-16), 55.4(C-17), 12.26(C-18), 63.0(C-19), 38.0(C-20), 18.9(C-21), 34.8(C-22), 31.1(C-23), 156.9(C-24), 33.9(C-25), 21.9(C-26), 22.0(C-27), 106.2(C-28), 21.8(CH3COO-), 171.5(MeCOO-)。以上理化特征及波谱数据与文献(Al-Footy et al, 2016)对照基本一致, 故鉴定化合物5为nephalsterol C。
化合物6: 白色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈粉紫色; HRESIMS m/z 421.3449 [M+Na]+ (计算值: C28H46ONa, 421.3441); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$-41.3° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δH: 3.52(1H, m, H-3), 5.35(1H, d, J=5.4Hz, H-6), 0.68(3H, s, H-18), 1.01(3H, s, H-19), 0.95(3H, d, J=6.6Hz, H-21), 1.03(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.01(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 4.66(1H, br s, H-28a), 4.71(1H, br s, H-28b); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 37.4(C-1), 31.8(C-2), 72.0(C-3), 42.5(C-4), 140.9(C-5), 121.9(C-6), 32.1(C-7), 32.1(C-8), 50.3(C-9), 36.7(C-10), 21.3(C-11), 40.0(C-12), 42.5(C-13), 56.9(C-14), 24.5(C-15), 28.4(C-16), 56.2(C-17), 12.0(C-18), 19.6(C-19), 35.9(C-20), 18.9(C-21), 34.9(C-22), 31.1(C-23), 157.0(C-24), 34.0(C-25), 22.0(C-26), 22.2(C-27), 106.1(C-28)。以上理化特征及波谱数据与文献(Lu et al, 2004)对照基本一致, 故鉴定化合物6为24-亚甲基胆固醇(24-methylene-cholesterol)。
化合物7: 白色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈紫色; HRESIMS m/z 467.3497 [M+Na]+ (计算值: C29H48O3Na, 467.3496); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+38.1° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 0.89(1H, m, H-1a), 1.73(1H, m, H-1b), 1.50(1H, m, H-2a), 1.78(1H, m, H-2b), 3.06(1H, td, J=10.5, 4.8Hz, H-3), 1.33(1H, m, H-4), 0.70(1H, m, H-5), 1.32(1H, m, H-6a), 1.50(1H, m, H-6b), 1.67(1H, m, H-7), 0.82(1H, m, H-9), 1.14(1H, m, H-12a), 1.99(1H, d, J=3.5Hz, H-12b), 1.24(1H, m, H-14), 1.53(1H, m, H-15), 1.30(1H, m, H-16a), 1.83(1H, m, H-16b), 1.11(1H, m, H-17), 0.97(3H, s, H-18), 0.95(3H, s, H-19), 2.01(1H, d, J=4.2Hz, H-20), 0.86(3H, d, J=6.4Hz, H-21), 2.36(1H, dd, J=15.4, 9.9Hz, H-22a), 2.67(1H, dd, J=15.4, 3.4Hz, H-22b), 2.90(1H, m, H-25), 0.99(3H, d, J=6.8Hz, H-26), 1.01(3H, d, J=6.8Hz, H-27), 5.64(1H, s, H-28a), 5.90(1H, s, H-28b), 0.95(3H, d, J=6.4Hz, H-29); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 37.6(C-1), 30.7(C-2), 76.8(C-3), 38.7(C-4), 51.7(C-5), 19.1(C-6), 39.9(C-7), 73.7(C-8), 56.4(C-9), 36.5(C-10), 18.4(C-11), 41.1(C-12), 43.3(C-13), 59.5(C-14), 20.1(C-15), 28.0(C-16), 57.2(C-17), 13.7(C-18), 13.6(C-19), 33.1(C-20), 19.5(C-21), 45.1(C-22), 202.8(C-23), 156.1(C-24), 27.9(C-25), 22.0(C-26), 22.1(C-27), 120.9(C-28), 15.3(C-29)。以上理化特征及波谱数据与文献(Hegazy et al, 2016)对照基本一致, 故鉴定化合物7为4α-methyl-3β,8β-dihydroxy-5α-ergost-24(28)-en-23-one。
化合物8: 白色不定型固体, 10%硫酸–乙醇显色呈紫红色; HRESIMS m/z 437.3700 [M+Na]+ (计算值: C29H50ONa, 437.3754); $\left[ \alpha \right]_{\mathrm{D}}^{25}$+18.2° (c 0.1, CH3OH)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δH: 0.75(1H, m, H-1a), 1.53(1H, m, H-1b), 1.45(1H, m, H-2a), 1.82(1H, m, H-2b), 3.07(1H, td, J=10.5, 4.8Hz, H-3), 1.09(1H, m, H-4), 0.70(1H, m, H-5), 1.66(1H, m, H-6a), 1.72(1H, m, H-6b), 1.28(1H, m, H-7a), 1.31(1H, m, H-7b), 1.39(1H, m, H-8), 0.59(1H, m, H-9), 1.48(1H, m, H-11a), 1.50(1H, m, H-11b), 1.96(1H, m, H-12a), 2.08(1H, m, H-12b), 0.98(1H, m, H-14), 1.61(1H, m, H-15a), 1.70(1H, m, H-15b), 1.15(1H, m, H-16a), 1.26(1H, m, H-16b), 1.07(1H, m, H-17), 0.64(3H, s, H-18), 0.82(3H, s, H-19), 1.13(1H, m, H-20), 0.95(3H, d, J=6.8Hz, H-21), 1.21(1H, m, H-22a), 1.56(1H, m, H-22b), 1.79(1H, m, H-23a), 1.88(1H, m, H-23b), 2.22(1H, m, H-25), 1.01(3H, d, J=7.2Hz, H-26), 1.02(3H, d, J=7.2Hz, H-27), 4.65(1H, s, H-28a), 4.70(1H, s, H-28b), 0.92(3H, d, J=6.7Hz, H-29); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 37.0(C-1), 28.4(C-2), 76.8(C-3), 39.4(C-4), 51.1(C-5), 24.3(C-6), 33.9(C-7), 31.2(C-8), 54.7(C-9), 36.1(C-10), 21.3(C-11), 40.2(C-12), 42.7(C-13), 56.7(C-14), 24.3(C-15), 31.1(C-16), 56.2(C-17), 12.2(C-18), 13.5(C-19), 35.9(C-20), 18.8(C-21), 35.0(C-22), 32.4(C-23), 157.0(C-24), 34.8(C-25), 22.0(C-26), 22.2(C-27), 106.1(C-28), 15.3(C-29)。以上理化特征及波谱数据与文献(金鹏飞 等, 2007)对照基本一致, 故鉴定化合物8为4α-甲基-麦角甾-24-烯-3β-醇(4α-methyl- ergosterol-24-en-3β-ol)。

2.2 活性测试

对以上8种化合物进行了肿瘤细胞毒活性测试。运用MTT法, 测试化合物1~8对人慢性髓原白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌细胞(Hela)的体外细胞毒活性, 结果表明化合物2、3和5对这5种肿瘤细胞均有不同强度的细胞毒性, 其IC50值如表1所示。其中, 化合物5的对白血病细胞K562具有强细胞毒活性, 其IC50值为(2.08± 0.11)μmol·L-1。
表1 化合物1~8对5种肿瘤细胞的细胞毒活性测试结果

Tab. 1 The cytotoxic activities of compounds 1~8 on five tumor cells

化合物 (IC50 ± SD)/(μmol·L-1)a
K562 BEL-7402 SGC-7901 A549 Hela
1 - - - - -
2 5.48 ± 0.22 26.76 ± 0.10 19.40 ± 0.27 43.69 ± 0.60 44.44 ± 0.65
3 4.80 ± 0.11 29.64 ± 0.52 23.54 ± 0.68 36.44 ± 0.29 42.00 ± 1.17
4 - - - - -
5 2.08 ± 0.11 9.09 ± 0.08 16.57 ± 0.04 28.69 ± 0.25 20.10 ± 0.19
6 - - - - -
7 - - - - -
8 - - - - -
顺铂b 3.08 ± 0.05 4.02 ± 0.08 4.11 ± 0.02 1.93 ± 0.02 11.29 ± 0.15

注: a: 基于3次平行试验的平均值; b: 阳性对照; -: 无细胞毒活性

3 讨论

本研究选用采集自我国南海西沙群岛的短指软珊瑚S. flexibilis为研究对象, 对其次生代谢产物进行分离鉴定, 共分离鉴定了8个甾体类化合物(1~8)。根据化合物的结构, 可分为4-去甲基甾体(化合物1、2、4、5和6)和4α-甲基甾体(化合物3、7和8)。4α-甲基甾体是软珊瑚共生甲藻(虫黄藻)甾体合成的最终产物, 因此, 本文中的4α-甲基甾体(化合物3、7和8)可能是由软珊瑚共生甲藻(虫黄藻)合成的(Takahiro et al, 2009)。对化合物1~8进行了细胞毒活性筛选, 发现化合物2、3和5对5种肿瘤细胞均有不同的抑制活性, 其中化合物5对人慢性髓原白血病细胞(K562)的细胞毒活性最好, IC50值达(2.08±0.11)μmol·L-1。根据文献报道, 化合物1对HT-29 (人结肠癌细胞)、KB (人口腔表皮样癌细胞)和P-388 (小鼠白血病细胞)的生长具有显著的细胞毒性(Duh et al, 1998); 化合物5对U937 (人组织细胞淋巴瘤细胞)表现出高选择性(选择指数SI为2.9)和较强的细胞毒性[IC50为(10.6±0.12)μmol·L-1](Ellithey et al, 2013); 化合物7对MCF-7 (人乳腺癌细胞)有弱细胞毒活性(Elkady et al, 2016); 化合物8对HL-60 (人原髓细胞白血病细胞)、PC-3MIE8 (人前列腺癌高转移细胞)、BGC-823 (人胃腺癌细胞)和MDA-MB-435 (人乳导管癌细胞)有弱细胞毒性(金鹏飞 等, 2007)。对比4-去甲基甾体化合物1、2、4、5和6的结构及其肿瘤细胞毒活性, 推测在C19位和C23位上羟基的取代可能增强了甾体对肿瘤细胞的毒活性, C7位上的乙酰基氧化对甾体的肿瘤细胞毒活性可能有降低作用; 对比4α-甲基甾体化合物3、7和8的结构, 除了它们在C4位上都存在甲基外, 它们的侧链类型, 内酯环的氧化程度均不同, C14位上羟基取代可能对甾体肿瘤细胞毒活性有提升作用。本研究在一定程度上丰富了短指软珊瑚S. flexibilis的化学多样性, 同时也对甾体类化合物与其肿瘤细胞毒活性之间构效关系的研究提供了一定的参考价值。

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