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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 2: 69 - 80

DOI: https://doi.org/10.11978/2023087

Marine Biology

Testis development, spermatogenesis and sperm ultrastructure of Lutraria sieboldii in the Beibu Gulf, Guangxi

  • WU Tao , 1, 2 ,
  • PAN Ying , 1, 2 ,
  • LIU Yiming 1, 2 ,
  • LIAN Changpeng 1, 2 ,
  • XU Bingjie 1, 2 ,
  • WANG Chaoqi 1, 2 ,
  • YANG Ling 1, 2
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  • 1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China
  • 2. Key Laboratory of Aquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation of Guangxi Universities, Nanning 530004, China
PAN Ying. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2023-06-26

  Revised date: 2023-07-05

  Online published: 2023-07-24

Supported by

Guangxi Innovation Driven Development Project(Guike AA19254032)

Fold

Abstract

To explore the histological and ultrastructural changes of the annual development of the testis and spermatogenesis of Lutraria sieboldii in Beibu Gulf of Guangxi, the annual development of testis and ultrastructure of spermatozoa of L. sieboldii were studied through tissue section, scanning and transmission electron microscopy. Results showed that the testis completes a cycle in one year, which can be divided into proliferating stage, growing stage, maturing stage, spawning stage and resting stage. The spawning was from December to April of the following year, and the testis development of 5% ~ 10% individuals in each stage was slightly delayed. Spermatogenesis can be divided into proliferation period, growth period, mature period and metamorphosis period. The male reproductive cell can be divided into Spermatogonia stage, primary spermatocyte stage, secondary spermatocyte stage, spermatocyte stage and mature sperm stage. The sperm of L. sieboldii belongs to the flagella type, whose total length is (39.76 ± 0.50) μm. The sperm head was composed of a nearly subelliptic spermatic acrosome and nucleus, the bottom of the acrosome and the spermatozoa connected with the spermatozoa were depressed to form a subacrosomal cavity. The electron density in the nucleus was uniform, and there was a gap in the middle of the nucleus. There are four mitochondria around the centriole complex to form the middle part of sperm, and the mitochondria are nearly round with apparent internal ridge. The plasma membrane wraps around the axial filaments to form sperm tail, and the “9 + 2” doublet microtubule structure can be clearly observed in the transverse section of the tail. In addition, there are two different types of spermatogonia: type A spermatogonia has no nucleolus in the nucleus while type B spermatogonia has nucleolus in the nucleus, and type B spermatogonia is distributed in the testis at different stages.

Key words： Lutraria sieboldii; testis development; spermatogenesis; ultrastructure

Cite this article

WU Tao , PAN Ying , LIU Yiming , LIAN Changpeng , XU Bingjie , WANG Chaoqi , YANG Ling . Testis development, spermatogenesis and sperm ultrastructure of Lutraria sieboldii in the Beibu Gulf, Guangxi[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(2) : 69 -80 . DOI: 10.11978/2023087

施氏獭蛤(Lutraria sieboldii)俗称“象鼻螺、牛螺”, 隶属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、蛤蜊总科(Mactracea)、蛤蜊科(Mactridae)、獭蛤属(Lutraria)(徐凤山 等, 2008), 分布于热带-亚热带海区和我国东海及南海(蔡英亚 等, 2005)。施氏獭蛤肉质鲜美, 商业价值高, 具有很好的养殖前景。目前国内外对施氏獭蛤的研究主要集中在人工苗种培育和海区养殖(刘永 等, 2006; 刘永 等2007; 张春芳 等, 2010; 王斌 等, 2015; 王超奇 等, 2023)、核型研究(潘英 等, 2007a)、胚胎发育(焦宗垚 等, 2010)、软体部营养成分分析(潘英 等, 2007b)、遗传及表型性状研究(李斌 等, 2011; Su et al, 2013; 邹杰 等, 2020; 吴韬 等, 2023a)、早期生长性状遗传参数和育种值估计(邹杰 等, 2021)、水管肌和贝壳成分分析(Hunt, 1973)等方面。有关施氏獭蛤繁殖规律的研究相对较少, 仅见性腺发育和生殖周期的组织切片(曹伏君 等, 2012)以及卵巢发育、卵子和卵黄发生的超微结构研究(吴韬 等, 2023b)。
精巢发育、精子发生及超微结构是物种分类鉴定的重要依据, 对研究贝类受精机制和系统分类具有重要作用(Giribet et al, 2002; 郑学斌 等, 2018; 李猛 等, 2022)。众多学者利用组织切片技术对管角螺(Hemifusus tuba)(区小玲 等, 2015)、熊本牡蛎(Crassostrea sikamea) (武祥伟 等, 2020)、长牡蛎(C. gigas)(邓传敏 等, 2017)等经济贝类的精巢发育进行了研究, 利用电镜技术研究了褐蚶(Didimarca tenebrica)(杜晨 等, 2015)、魁蚶(Scapharca broughtoni)(叶婧 等, 2012)、毛蚶(Scapharca subcrenata)(竺俊全 等, 2004)、泥蚶(Tegillaca granosa)(孙慧玲 等, 2000)、钝缀锦蛤(Tapes conspersus)(连昌朋 等, 2022)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(韩厚伟 等, 2008)、长牡蛎(韩龙江 等, 2017)、文蛤(Meretrix meretrix)(董迎辉 等, 2010)、斧文蛤(M. lamarkii)(董迎辉 等, 2011)、帘文蛤(M. lyrate)(周小龙 等, 2012)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(代培芳 等, 2004)、沟纹巴非蛤(Paphia exarate)(陈寅山 等, 2006)、中国血蛤(Hiatula chinensis)(吴丽云 等, 2010)、彩虹明樱蛤(Moerella iridescens)(余红卫, 2012)、近江蛏(Sinonovacula rivularis sp. nov.)(黄瑞 等, 2011)、长竹蛏(Solen strictus)(饶小珍, 2007)、栉江珧(Atrina pectinate)(顾向飞 等, 2013)等双壳贝类的精子超微结构。目前广西北部湾施氏獭蛤精子发生及精巢发育过程的超微结构尚未见报道。本研究拟通过周年性腺指数和组织切片技术确定广西北部湾海域雄性施氏獭蛤繁殖周期, 采用扫描和透射电镜技术观察精子发生过程和成熟精子形态结构, 旨在了解施氏獭蛤精子结构特点, 为施氏獭蛤的繁殖生物学、人工育苗及增养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年11月至2021年10月, 每月从广西北海市铁山港区营盘镇大王岭海区(109°43′21″, 21°45′78″)随机取20个2~3龄施氏獭蛤, 共采集240个样品, 其中雄性112个, 雄性占样本总数46.70%。施氏獭蛤表型性状参数见表1。
表1 施氏獭蛤表型性状参数

Tab.1 Morphological parameters of male L. sieboldii

数值 壳长/mm 壳宽/mm 壳高/mm 体质量/g
平均值±标准差 94.17±6.46 31.97±3.08 46.03±3.05 99.05±21.69
最大值 116.80 43.83 57.74 199.96
最小值 80.12 24.72 39.53 55.40

1.2 方法

1.2.1 样品测量

采用数显游标卡尺(精度0.02mm)测量壳长、壳宽和壳高, 电子秤(精度0.01g)称量体质量。每月将施氏獭蛤样品解剖后, 取出软体部, 剥离精巢, 分别称量软体质量和精巢质量, 计算施氏獭蛤雄性性腺指数, 计算公式为: 雄性性腺指数=精巢质量/软体质量×100%。

1.2.2 数据处理

使用SPSS 26.0数据分析软件, 采用单因素方差分析方法(ANOVA, Duncan)比较1周年各月雄性性腺指数的差异显著性(p<0.05), Excel 2019整理数据和作图。

1.2.3 组织切片样品的制作及观察

取1~2g精巢组织放入EP管中, 加入Bouin’s液在常温下固定48h。样品送广西医科大学医学实验中心制成石蜡切片。使用70%的酒精置换保存样品的Bouin’s液, 随后将样品放入不同浓度(70%、80%、95%和100%)的酒精中脱水, 石蜡包埋, 轮转式切片机(RM2128, 中国)切片, 恒温水浴锅37℃烤片, 苏木精-伊红染色, 中性树脂包埋, 尼康正置显微镜(Nikon Eclipse E100, 日本)观察拍照。

1.2.4 扫描电镜样品的制样及观察

2021年4月随机取2个雄性样品, 用吸管吸取约1mL成熟精巢中的精子, 加入盐度28‰的海水稀释, 2.5%戊二醛(C5H8O2)固定, 4℃冰箱保存1d。固定后的样品送武汉赛维尔生物公司进行后续制样。使用0.1mol·L-1的磷酸缓冲液(PB)漂洗15min, 将漂洗后的样品放入不同浓度(70%、80%、95%和100%)的酒精中脱水, 随后用乙酸异戊酯(C7H14O2)置换。样品置换后放入40℃的临界点干燥仪(Quorom K850型, 英国)烘干, 干燥后的样品用镊子粘至导电胶带, 离子溅射仪(HITACHI MC100, 日本)喷金, 日立扫描电镜(HitachiSU8100, 日本)观察拍照。

1.2.5 透射电镜样品的制样及观察

每月随机选2个雄性样品, 剪取1g精巢组织, 加入2.5%戊二醛, 4℃固定1d, 固定后的样品切成1mm3小块, 再次放入装有2.5%戊二醛的EP管中保存。保存的样品送武汉赛维尔生物公司包埋观察。样品经浓度为0.1mol·L-1的磷酸缓冲液连续漂洗, 每次漂洗15min, 漂洗后的样品放入50%~100%体积分数的酒精中脱水, 每次脱水20min, 100%丙酮(CH3COCH3)再次漂洗15min, 环氧树脂包埋, 超薄切片机(Leica UC7, 德国)切片, 日立透射电镜(HitachiHT7700, 日本)观察。

2 结果与分析

2.1 施氏獭蛤雄性性腺指数的周年变化

2020年11月—2021年10月持续1周年的施氏獭蛤雄性性腺指数与水温周年变化见图1。由图1可知, 2020年11月—2021年1月, 水温从22.00℃降低至15.00℃, 性腺指数从2.07%上升至3.80%, 上升趋势不显著(p>0.05); 2021年2—3月, 水温先上升后降低, 平均水温23.65℃, 较2020年11月—2021年1月平均水温(18.00℃)升高5.65℃, 性腺指数从4.34%显著上升至全年最高的10.71%; 2021年4月水温升高至27.50℃, 性腺指数显著降低至1.19% (p<0.05)。2021年5—10月水温维持在25.50℃~30.50℃, 平均水温29.13℃, 6月水温达到全年最高30.50℃。性腺指数在5—8月有所上升, 性腺指数变化不显著(p>0.05), 平均性腺指数为1.37%, 8—10月性腺指数显著降至最低值0.45% (p<0.05)。
图1 施氏獭蛤雄性性腺指数与水温的周年变化

字母不同表示月间差异显著(p<0.05)

Fig. 1 Annual variation of gonad index and water temperature in male L. sieboldii.

Different letters indicate significant differences between months (p < 0.05)

2.2 施氏獭蛤精巢的发育分期

2020年11月—2021年10月, 总共采集到112个施氏獭蛤雄性样品。依据组织切片精巢内滤泡大小、雄性生殖细胞生长情况和肉眼观察精巢外观的周年变化, 施氏獭蛤精巢发育可划分为5个时期, 即增殖期(Ⅰ)、生长期(Ⅱ)、成熟期(Ⅲ)、排放期(Ⅳ)和休止期(Ⅴ), 如图2所示。结果表明, 施氏獭蛤精巢发育1年为1个生殖周期, 精巢从9月份开始增殖, 12月至翌年3月份精巢发育到成熟期, 翌年4月至8月份精巢逐渐萎缩。精巢发育各期特征见表2。
图2 施氏獭蛤精巢发育分期的组织切片

a. 增殖期; b. 生长期; c. 成熟期; d. 排放期; e. 休止期

Fig. 2 Development stages of spermary in L. sieboldii (Bar 1: 0.01 mm).

(a) Proliferating stage; (b) Growing stage; (c) Maturing stage; (d) Spawning stage; (e) Resting stage

表2 施氏獭蛤精巢发育特点

Tab.2 The characteristics of spermary development in L. sieboldii

发育周期 各期特点
增殖期(Ⅰ) 精巢透明, 结缔组织发达, 滤泡呈狭长状, 滤泡内空虚。滤泡壁上排列着单层精原细胞(图2a)。
生长期(Ⅱ) 精巢开始增殖, 滤泡增大, 滤泡间隙减小, 滤泡壁增厚, 精原细胞增殖, 滤泡壁上出现多层精原细胞。部分精原细胞分化形成不同发育时期的精细胞(图2b)。
成熟期(Ⅲ) 精巢扩展至软体部上缘, 精巢呈黄色, 肉眼可辨, 取部分精巢组织于载玻片上, 精巢内的精子遇水即散。滤泡间无结缔组织, 滤泡内充满成熟精子(图2c)。
排放期(Ⅳ) 精巢仍较饱满, 滤泡间隙增大。滤泡收缩, 滤泡壁变厚, 滤泡内成熟精子排出, 滤泡大小不一, 呈流水状(图2d)。
休止期(Ⅴ) 精巢消瘦, 肉眼无法分辨雌雄, 结缔组织增生, 滤泡萎缩。滤泡内大部分排空, 滤泡壁上可见部分未排出的精细胞紧贴滤泡壁固着、退化并被重吸收(图2e)。

2.3 施氏獭蛤精巢发育各期的周年变化规律

由表3可知, 在广西北部湾北海海域的1周年采样中, 雄性个体总数112个, 占总数的46.67%。施氏獭蛤精巢增殖期出现在10月, 水温平均值29.80℃; 精巢生长期为10月下旬—11月下旬, 水温22.00℃~25.50℃; 12月下旬—翌年3月为精巢成熟期, 水温15.00℃~ 26.30℃。每年4月为精巢排放期, 水温27.50℃; 精巢休止期为每年5—8月, 水温29.50℃~30.50℃。
表3 广西北部湾海域施氏獭蛤精巢发育各期的周年分布

Tab. 3 Annual distribution of spermary development stages of L. sieboldii in the Beibu Gulf, Guangxi

取样日期 盐度/‰ 水温/℃ 精巢发育分期 雄性总数/个
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
2020/11/26 27.4 22.0 10 1 11
2020/12/21 27.5 17.0 3 6 1 10
2021/1/8 29.4 15.0 2 9 11
2021/2/23 30.9 26.3 6 6
2021/3/20 30.0 21.0 2 7 9
2021/4/22 30.0 27.5 8 8
2021/5/26 28.0 29.5 1 7 8
2021/6/21 28.4 30.5 5 7 12
2021/7/14 29.0 29.7 5 3 8
2021/8/17 30.0 29.8 1 2 1 3 7
2021/9/15 31.0 29.8 10 1 11
2021/10/20 29.0 25.5 6 4 1 11

2.4 施氏獭蛤的精子发生

参考李霞(2019)的精子发生分期, 将施氏獭蛤雄性生殖细胞的发生分为4个时期, 即增殖期、生长期、成熟期和变态期, 各期特征见图3和表4。
图3 施氏獭蛤精子发生各期的组织切片

a. 增殖期, 示A型精原细胞(SpA)、B型精原细胞(SpB)、核仁(Nu); b. 生长期, 示B型精原细胞(SpB)、初级精母细胞(Ps); c. 成熟期, 示次级精母细胞(Ss)、精细胞(S); d. 变态期, 示精细胞前期(Sip)、精细胞中期(Sim)、成熟精子(Ms)、生精小管(St)

Fig. 3 Tissue sections of male L. sieboldii at different stages of spermatogenesis (Bar 1:0.01 mm).

(a) Proliferating stage, showing type A Spermatogonia (SpA), type B Spermatogonia (SpB) and Nucleolus (Nu); (b) Growing stage, showing type B Spermatogonia (SpB), Primary spermatocyte (Ps); (c) Maturing stage, showing secondary spermatocytes (Ss) and Spermatid (S); (d) Metamorphosis stage, showing spermatid in prophase (Sip), Spermatid in metaphase (Sim), Mature sperm (Ms), Seminiferous tubule (St)

表4 施氏獭蛤精子发生各期特点

Tab. 4 Characteristics of spermatogenesis stages in L. sieboldii

发生分期 各期发生特点
增殖期 精原细胞紧贴滤泡壁大量增殖的时期, 出现在施氏獭蛤Ⅰ~Ⅲ期精巢, 尤以Ⅰ~Ⅱ期精巢最常见, 精原细胞在滤泡壁上多层排列(图3a)。
生长期 同一滤泡内雄性生殖细胞发育不同步, 部分精原细胞分化形成初级精母细胞, 细胞体积减小, 逐渐脱离滤泡壁。此期出现在施氏獭蛤Ⅰ~Ⅲ精巢(图3b)。
成熟期 滤泡壁上排列大量次级精母细胞, 部分次级精母细胞黏连, 呈分裂趋势。从组织切片看, 染色较上一期更深。此期出现在施氏獭蛤精巢Ⅲ~Ⅳ期(图3c)。
变态期 次级精母细胞分化形成精细胞。组织切片中此期染色最深, 体积最小, 可观察到呈圆形的头部横切面和不规则的精子纵切面。此期出现在施氏獭蛤精巢Ⅲ~Ⅴ期(图3d)。

2.5 施氏獭蛤成熟精子形态和超微结构

施氏獭蛤精子属于鞭毛型, 由头部、中部和尾部3部分组成, 成熟精子全长(39.76±0.50)μm (图4a)。
图4 施氏獭蛤雄性生殖细胞发育各期的超微结构

a. 精子全长, 示头部(H)、线粒体(M)、鞭毛(F), ×3000; b. 精子头部, 示顶体(Ac)、细胞核(N)、线粒体(M)、核后窝(Pnf)、鞭毛(F), ×20000; c. 精原细胞, 示基膜(Bm)、致密颗粒(Dg)、线粒体(M)、细胞核(N)、染色质丝(Ch)、核膜(Nm), ×3000; d. 初级精母细胞, 示致密颗粒(Dg)、线粒体(M)、细胞核(N)、染色质丝(Ch), ×3000; e. 初级精母细胞, 示致密颗粒(Dg)、线粒体(M)、核仁(Nu), ×3000; f. 次级精母细胞, 示致密颗粒(Dg)、线粒体(M)、细胞核(N)、染色质丝(Ch), ×4000; g. 次级精母细胞, 示致密颗粒(Dg)、线粒体(M)、远端中心粒(Dc)、核仁(Nu), ×4000; h. 精细胞前期, 示细胞核(N)、线粒体(M), ×7000; i. 精细胞中期, 示顶体泡(Av)、细胞核(N)、线粒体(M)、远端中心粒(Dc)、鞭毛(F), ×7000; j. 精细胞中期, 示顶体(Ac)、核前窝(Anf)、细胞核(N)、核后窝(Pnf)、线粒体(M)、鞭毛(F), ×7000; k. 精细胞后期, 示顶体(Ac)、亚顶体腔(Ss)、核前窝(Anf)、细胞核(N)、核后窝(Pnf)、线粒体(M)、远端中心粒(Dc)、鞭毛(F), ×7000; l. 精细胞后期, 示线粒体(M)、远端中心粒(Dc)、近端中心粒(Pc), ×4000; m. 精细胞尾部横切, ×7000

Fig. 4 Ultrastructure of male L. sieboldii germ cells at different stages of development.

(a) Full-length spermatozoa, showing Head (H), Mitochondria (M) and Flagella (F), ×3000; (b) Sperm head, showing Acrosome (Ac), Nucleus (N), Mitochondria (M), Posterior nuclear fossa (Pnf), Flagella (F), ×20000; (c) Spermatogonia, showing Basement membrane (Bm), Dense granule (Dg), Mitochondria (M), Nucleus (N), Chromatin filaments (Ch), and Nuclear envelope (Nm), ×3000; (d) Primary spermatocytes, showing Dense granules (Dg), Mitochondria (M), Nuclei (N), and Chromatin filaments (Ch), ×3000; (e) Primary spermatocytes, showing Dense granules (Dg), Mitochondria (M), and Nucleoli (Nu), ×3000; (f) Secondary spermatocytes, showing dense granules (Dg), Mitochondria (M), Nuclei (N), and Chromatin filaments (Ch), ×4000; (g) Secondary spermatocytes, showing Dense granules (Dg), Mitochondria (M), Distal centrioles (Dc), and Nucleoli (Nu), ×4000; (h) Spermatocytic prophase, showing Nucleus (N) and Mitochondria (M), ×7000; (i) metaphase of spermatocytes, showing Acrosomal vesicles (Av), Nuclei (N), Mitochondria (M), Distal centrioles (Dc), Flagella (F), ×7000; (j) Spermatocyte metaphase, showing Acrosome (Ac), Anterior nuclear fossa (Anf), Nucleus (N), Post nuclear fossa (Pnf), Mitochondria (M), Flagella (F), ×7000; (k) In late spermatocyte stage, showing Acrosome (Ac), Subacrosomal cavity (Ss), Anterior nuclear fossa (Anf), Nucleus (N), Post nuclear fossa (Pnf), Mitochondria (M), Distal centriole (Dc), Flagella (F), ×7000; (l) In late spermatocyte stage, showing Mitochondria (M), Distal centriole (Dc) and Proximal centriole (Pc), ×4000; (m) spermatozoa caudal transection, ×7000

2.5.1 头部

施氏獭蛤成熟精子头部由顶体和细胞核组成, 头部全长(2.60±0.10)μm, 顶体位于头部前端, 近椭圆形, 全长(1.35±0.05)μm。精核位于头部后端, 精核全长(1.26±0.01)μm (图4b)。顶体内电子密度分布均匀, 下端与精核连接处内陷形成亚顶体腔, 亚顶体腔全长(0.46±0.01)μm。精核内电子密度不均匀, 中部存在间隙, 精核前端和后端有一明显的核前窝和核后窝(图4k)。

2.5.2 中部

成熟精子中部长度(1.31±0.01)μm。中部不发达, 透射电镜纵切面上两个线粒体环绕中心粒(图4k, 4l), 中心粒四周有4个线粒体排列(图4g), 线粒体内嵴发达。

2.5.3 尾部

远端中心粒伸出11对轴丝, 轴丝被质膜包裹形成了精子的尾部, 全长(34.55±0.23)μm, 直径(0.20± 0.03)μm, 尾部横切面为圆形, 可观察到典型的“9+2”双联体微管结构(图4m)。

2.6 施氏獭蛤雄性生殖细胞的发育

根据透射电镜观察施氏獭蛤雄性生殖细胞出现的位置、大小、内部变化情况, 将施氏獭蛤雄性生殖细胞的发育划分为5个时期, 即精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期、成熟精子期(图4)。

2.6.1 精原细胞期

精原细胞呈长条状紧贴基膜和滤泡壁, 细胞体积最大, 胞径(13.10±0.22)μm, 细胞核偏位, 核径(4.49± 0.10)μm, 动物极明显。核内染色质分布凌乱, 部分染色质聚集, 胞质内空虚, 分布少量致密颗粒和线粒体, 线粒体内嵴较少(图4c)。

2.6.2 初级精母细胞期

初级精母细胞部分脱离滤泡壁, 呈不规则多边状, 细胞体积较精原细胞小, 胞径(11.05±0.12)μm, 细胞核靠近细胞一边, 核径(5.40±0.41)μm。染色质丝逐渐向细胞核内部聚集, 处于偶线期和粗线期。细胞质内线粒体数量增加, 电子密度高, 线粒体环绕细胞核分布。初级精母细胞发育到后期, 染色质聚集于细胞核中央形成核仁(图4d, 4e)。

2.6.3 次级精母细胞期

初级精母细胞分裂过程中一分为二, 胞内细胞核消失。胞质内细胞器以线粒体为主, 线粒体与致密颗粒多集中分布于细胞一侧。分裂后产生的次级精母细胞直径(7.00±0.20)μm, 动物极不明显。细胞核内核仁明显, 核径(1.40±0.20)μm, 核膜清晰, 胞质内4个线粒体包围远端中心粒并逐渐移向细胞核尾部(图4f, 4g)。

2.6.4 精细胞期

精细胞前期, 胞径(3.17±0.20)μm, 胞质内的线粒体内嵴明显, 内嵴数量增加, 胞质内未出现尾部轴丝和前顶体。精细胞中期, 胞径(4.03±0.40)μm, 远端中心粒伸出轴丝, 胞质内的高电子密度物质聚集形成顶体泡, 不断向细胞核顶部靠近。精细胞后期, 胞径(5.42± 0.20)μm, 前顶体泡电子密度不断升高, 形成顶体并与细胞核顶部融合, 顶体由倒“V”型逐渐变为近椭圆形。细胞核靠近顶体处有核前窝, 靠近轴丝处有核后窝(图4h~4j)。

2.6.5 成熟精子期

成熟精子体积最小, 大量聚集于精巢内, 呈近椭圆形。成熟精子头部近椭圆形, 细胞核高度浓缩, 头部直径约2.62μm, 尾部细长(图4k~4m)。

3 讨论

3.1 广西北部湾海域雄性施氏獭蛤繁殖规律及影响因素

双壳贝类的繁殖周期一般为一年, 期间可能出现1~2个繁殖盛期(庄启谦, 2001)。宁军号等(2015)研究表明, 偏顶蛤(Modiolus modiolus)繁殖周期为1年, 6—10月为繁殖盛期。巫旗生等(2017)研究表明, 钝缀锦蛤繁殖周期为1年, 繁殖盛期为10—11月和翌年3月。本研究通过对广西北部湾北海海域施氏獭蛤周年性腺指数分析和周年组织切片观察表明, 施氏獭蛤精巢发育分期明显, 分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期, 1周年为1个发育周期, 每期5%~ 10%个体精巢发育略滞后, 全年只有1个繁殖盛期。双壳贝类的繁殖期与水温有关(柯巧珍 等, 2012)。鹿瑶等(2015)研究表明, 水温升高可促进薄片镜蛤(Dosinia corrugate)性腺成熟, 进入繁殖盛期。於锋等(2016)对不同养殖海区的长牡蛎性腺发育研究表明, 高温促进了长牡蛎性腺的成熟。本研究表明, 广西北部湾海域施氏獭蛤繁殖盛期与水温变化密切相关。当水温由11月的22.00℃下降至12月的17.00℃时, 施氏獭蛤精巢开始成熟, 进入繁殖盛期; 翌年4月, 水温升至27.50℃时, 精巢开始排放成熟精子, 翌年5月, 水温升高至29.50℃时, 精巢进入休止期。与薄片镜蛤(鹿瑶 等, 2015)、长牡蛎(吕敏 等, 2022)等在高温季节性腺成熟的双壳贝类不同, 施氏獭蛤精巢于水温降低的12月开始成熟, 推测与施氏獭蛤适宜性腺发育的水温有关。施氏獭蛤适宜生活的海区水温为20.00℃~ 28.00℃ (蔡英亚 等, 2005), 而广西北部湾北海海域夏季(5—7月)和秋季(8—10月)平均水温分别为29.90℃和28.37℃, 较高的水温可能抑制了施氏獭蛤精巢的成熟。
此外, 海产双壳贝类的繁殖周期还可能会受内在因素的调控(Liu et al, 2010; Nowland, 2019), 如脂质和糖原含量等(Berthelin et al, 2000; 朱星海 等, 2019)。Berthelin等(2000)对长牡蛎繁殖周期的研究表明, 性腺内脂质和蛋白质含量的增加有助于雌雄配子的排放。王朔等(2022)研究表明, 长牡蛎性腺结缔组织中的糖原为配子发生提供能量, 脂质可为雄性长牡蛎性腺发育提供能量。吕敏等(2022)对长牡蛎的研究表明, 糖原是配子发生的主要能源物质, 脂肪和蛋白质含量与配子成熟和排放密切相关。

3.2 施氏獭蛤精子发生和发育的特点

精子发生的过程中, 原始生殖细胞分化形成精原细胞, 精原细胞发育至成熟精子并排出体外(李霞, 2019)。本研究根据施氏獭蛤精细胞出现的时期及其在不同发育时期精巢内的表现, 将其精子的发生分为4个时期: 增殖期、生长期、成熟期和变态期, 与李霞(2019)对双壳贝类精子发生的分期相同, 而与彩虹明樱蛤(余红卫, 2012)、长竹蛏(饶小珍, 2007)等双壳贝类精子发生的分期不同。同时, 根据施氏獭蛤雄性生殖细胞不同发育时期的内外部变化, 可将雄性生殖细胞的发育过程划分为精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期、成熟精子期, 与管角螺(区小玲 等, 2015)、钝缀锦蛤(连昌朋 等, 2022)的雄性生殖细胞发育分期相同。
精原细胞是精细胞发育、分化的起点(杨学明 等, 2016), 不同学者对精原细胞的定义和功能不同。吴洪流等(2000)研究波纹巴非蛤(P. undulate)精原细胞内有无核仁、分布位置和是否静止, 将其分为A型和B型, A型精原细胞位置固定, B型精原细胞可继续生长发育。郭恩棉等(2017)研究表明, A型精原细胞体积大, 核仁不明显; B型精原细胞体积小, 核仁明显。曹伏君等(2012)研究表明, 广东湛江海域施氏獭蛤精原细胞的大小、分布位置、出现时期不同, 提出A型精原细胞可继续分化, B型精原细胞为干细胞。宁军号等(2015)对偏顶蛤精原细胞的研究表明A型精原细胞分布在各发育阶段的精巢内, B型精原细胞主要分布在增殖期的精巢。本研究表明, 在施氏獭蛤精子发生早期, 精原细胞分布在精巢基膜和滤泡内的滤泡壁边缘, 呈椭圆形, 在组织切片下, 精原细胞有A、B两种不同的类型。A型精原细胞体积大, 只出现在增殖期精巢内, 胞内核仁不明显。B型精原细胞体积小, 出现在增殖期和生长期精巢内, 胞内核仁明显。该结果与吴洪流等(2000)、郭恩棉等(2017)对精原细胞的分型相同, 与宁军号等(2015)、曹伏君等(2012)对精原细胞的分型不同。本研究中, A、B型精原细胞出现在多张精巢组织切片中, 可排除因切片位置不同而造成的误差。组织切片下未观察到A、B型精原细胞进一步发育的情况, 关于施氏獭蛤两种类型精原细胞能否相互转化, 何种精原细胞可以继续分化, 有待进一步研究。

3.3 施氏獭蛤精子的超微结构

不同双壳贝类成熟精子形态不同(董迎辉 等, 2010)。本研究探讨了施氏獭蛤精子超微结构, 并与不同双壳贝类成熟精子的超微结构进行比较, 表明不同贝类精子结构存在差异(表5)。施氏獭蛤精子头部包括顶体和细胞核, 呈椭圆形, 顶体呈近圆球形, 顶体底部有一明显的亚顶体腔。成熟精子外观上与褶纹冠蚌(Cristaria plicata)(邓道贵 等, 2001)、皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)(崔龙波 等, 2000)相似; 与部分双壳贝类不同, 如褐蚶(杜晨 等, 2015)、泥蚶(孙慧玲 等, 2000)的成熟精子顶体呈倒“V”形, 长牡蛎(韩龙江 等, 2017)的成熟精子顶体呈突出结构, 栉江珧(顾向飞 等, 2013)的成熟精子顶体外膜包裹一层弧状膜。施氏獭蛤的精核近椭圆形, 中间存在电子密度较小的间隙, 与魁蚶(叶婧 等, 2012)精子的精核相似。余红卫(2012)研究表明, 精核内存在间隙是精子形成过程中的自然现象。不同物种精核的核前窝与核后窝不同, 文蛤(Gwo et al, 2020)、毛蚶(竺俊全 等, 2004)均无核前窝, 有核后窝。本研究中, 施氏獭蛤精核顶部和底部有明显的核前窝和核后窝, 与上述两者不同。另外, 不同物种的精子中部线粒体数不同, 双壳贝类精子线粒体数大多为4~5个, 偶然出现6个(董迎辉 等, 2010)。施氏獭蛤精子中部包括线粒体、近端中心粒和远端中心粒, 4个圆球状线粒体围绕中心粒, 与长牡蛎(韩龙江 等, 2017)相同。施氏獭蛤精子尾部的远端中心粒伸出轴丝, 由质膜包裹轴丝组成尾部, 精子尾部结构与部分海产双壳贝类相同(表5), 均为“9+2”双联体微管结构。
表5 不同双壳贝类的精子超微结构比较

Tab. 5 Comparison of sperm ultrastructure of different bivalve mollusks

种类 精子头部 精子中部 精子尾部 参考文献
施氏獭蛤
Lutraria sieboldii		 顶体近圆球形, 细胞核近椭圆形,有核前窝和核后窝 4个线粒体环绕中心粒复合体排列 “9+2”双联体微管结构 本文
栉江珧
Atrina pectinata		 顶体呈倒“V”形, 近顶体外膜有一弧状膜, 细胞核近圆形, 有核前窝, 无核后窝 5个线粒体辐射状排列在中心粒周围 “9+2”双联体微管结构 顾向飞等(2013)
斧文蛤
Meretrix lamarkii		 顶体呈圆锥形, 细胞核为长圆柱形, 有核前窝和核后窝 5个线粒体单层梅花状围绕在中心粒周围 “9+2”双联体微管结构 董迎辉等(2011)
钝缀锦蛤
Tapes conspersus		 顶体呈倒“V”形, 细胞核呈长圆柱形, 有核前窝和核后窝 5个圆环状线粒体包裹中心粒复合体 “9+2”双联体微管结构 连昌朋等(2022)
文蛤
Meretrix meretrix		 顶体呈倒“V”形, 细胞核长圆柱形, 内含形状不规则的透明腔, 有核前窝和核后窝 5个线粒体围绕一对中心粒 “9+2”双联体微管结构 Gwo等(2020)
长牡蛎
Crassostrea gigas		 顶体突出, 成熟精子头部近似圆形, 头部包含亚顶体腔、细胞核, 有核前窝和核后窝 4个圆球形的线粒体围绕中心粒 “9+2”双联体微管结构 韩龙江等(2017)
关于精子顶体来源和形成过程, 代培芳等(2004)对菲律宾蛤仔精子发生过程的超微结构研究表明, 高尔基体囊泡扩大转移至精核前端, 形成前顶体囊, 囊泡不断融合形成顶体。杨学明等(2016)对糙海参(Holothuria scabra)的研究表明, 胞质内高电子密度物质与线粒体和高尔基体融合, 形成糙海参精子顶体。本研究中未明显观察到施氏獭蛤精子胞质内高尔基体和高电子密度物质变化情况。关于施氏獭蛤精子顶体的来源、形成过程和机理有待进一步研究。

4 结论

广西北部湾海域雄性施氏獭蛤繁殖周期为1年, 分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期。精子发生可分为增殖期、生长期、成熟期和变态期。雄性生殖细胞的发育分为精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期、成熟精子期。施氏獭蛤精子属于鞭毛型, 全长(39.76±0.50)μm, 成熟精子头部近椭圆形, 具顶体, 精核内存在间隙, 精核前端和后端有一明显的核前窝和核后窝, 中部有4个线粒体, 尾部有11对轴丝, 呈“9+2”双联体微管结构。此外, 精原细胞可分为A型和B型, A型精原细胞核内核仁不明显, B型精原细胞核内核仁明显。

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