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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 2: 21 - 33

DOI: https://doi.org/10.11978/2023093

Marine Biology

Study on the community structure of eukaryotic phytoplankton in the Shenzhen Bay based on high-throughput sequencing technology

  • HUANG Yuan , 1, 2 ,
  • CEN Jingyi 1, 2 ,
  • LIANG Qianyan 1 ,
  • LYU Songhui 1, 2 ,
  • WANG Jianyan , 3
Expand
  • 1. Research Center of Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
  • 2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory, Zhuhai 519082, China
  • 3. Department of Life Sciences, National Natural History Museum of China, Beijing 100050, China
WANG Jianyan. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2023-07-03

  Revised date: 2023-08-17

  Online published: 2023-08-28

Supported by

Beijing Natural Science Foundation(8232026)

National Natural Science Foundation of China(41906112)

National Science and Technology Fundamental Resources Investigation Programme(2018FY100200)

Fold

Abstract

Using the 18S rDNA V4 region as the target gene, Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was applied to study the phytoplankton community in the seawater of the Shenzhen Bay during the four seasons from the winter of 2019 to the spring of 2021, and to compare with the historical data of harmful algal blooms species in this area, in order to explore the community composition and succession pattern of toxic and harmful phytoplankton in the Shenzhen Bay. The high-throughput sequencing results showed that the eukaryotic phytoplankton in the sea waters of the Shenzhen Bay consisted of 7 groups, including Bacillariophyta, Dinoflagellata, Chlorophyta, Ochrophyta, Haptophyta, Cryptophyta, and Rhodophyta, with a total of 82 families and 269 species. Among them, microphytoplankton was the main group, Nannochloris sp. was the dominant species in spring and autumn, Isochrysis galbana was the dominant species in summer, and Thalassiosira minima was the dominant species in winter. The phytoplankton diversity index in winter was the highest in the four seasons. A total of 32 species of toxic and harmful phytoplankton were detected in this survey, including 15 dinoflagellata species, 13 bacillariophyta species, 3 ochrophyta species, and 1 of haptophyta species. Compared with the historical data, the toxic and harmful phytoplankton in the Shenzhen Bay showed a miniaturization trend and an increasing diversity. The monophasic harmful blooms dominated by dinoflagellates or diatoms have been succeeded to polyphasic blooms of dinoflagellates and diatoms.

Key words： Shenzhen Bay; eukaryotic phytoplankton; toxic and harmful algae; high-throughput sequencing

Cite this article

HUANG Yuan , CEN Jingyi , LIANG Qianyan , LYU Songhui , WANG Jianyan . Study on the community structure of eukaryotic phytoplankton in the Shenzhen Bay based on high-throughput sequencing technology[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(2) : 21 -33 . DOI: 10.11978/2023093

深圳湾位于香港特别行政区新界西北部和深圳市西南部之间, 为半封闭海域。海湾为亚热带海洋性气候区, 地处东亚—澳大利西亚候鸟迁徙路线(Mackinnon et al, 2012; Zhou et al, 2020), 邻近内伶仃岛-福田国家级自然保护区、大鹏半岛国家级自然保护区, 是华南地区生态系统的重要组成区域(陈思 等, 2021)。然而, 根据2012—2020年深圳市环境国家公报, 深圳湾海水水质已低于中国海水水质标准(GB3097-1997) Ⅳ类标准, 水体富营养化问题严重。由水体富营养化引起的藻华频繁暴发, 是该海区重要的生态问题之一。1980年至2021年, 深圳湾海域共记录有害藻华34次(张冬鹏 等, 2001; 吴振斌 等, 2002; 冷科明 等, 2004; 孙金水 等, 2010b; 张才学 等, 2010; 赵东至, 2010; 袁超 等, 2015; 桓清柳 等, 2016; Wang et al, 2020a; Wang et al, 2020b; 陈思 等, 2021; Huang et al, 2021)。其中, 1998年深圳湾暴发的大规模环沟藻(Gyrodinium sp.)有害藻华灾害面积逾200km2, 此次有害藻华是深圳湾水体环境严重恶化的表现(王朝晖 等, 2001)。
浮游植物群落作为海洋生态系统的初级生产者, 其群落结构的变化(包括种类组成、数量和优势种的变动)与环境因子密切相关, 可反映环境现状与变化(Krukc et al, 2017; 刘华健 等, 2017; 朱广伟 等, 2020; 李港 等, 2021; Zhang et al, 2021)。近20年来, 已有诸多研究基于传统的形态分类学对深圳湾浮游植物多样性进行了分析。如张冬鹏等(2001)对1998年深圳湾的浮游植物进行了调查研究, 发现该海域浮游植物种类达125种, 其中, 硅藻为优势种类, 占总体浮游植物数量的90%以上。孙金水等(2010a)调查了2006年深圳湾浮游植物的分布情况, 鉴定出27个属共34种浮游植物。其中, 硅藻占比52.94%, 甲藻占比29.41%, 其他藻类所占比例17.65%。袁超等(2015)分析了2010年深圳湾浮游植物的季节性变化, 共鉴定出5个门45个属的83种浮游植物, 硅藻占比高达到83.10%, 甲藻占比为10.80%。陈思等(2021)分析了2013年深圳湾浮游植物群落的组成, 发现所鉴定出的111种浮游植物中硅藻占比为77.5%、甲藻占比为13.5%、绿藻和蓝藻占比分别为5%和4%。尽管基于形态学的浮游植物种类研究为掌握海域浮游生物群落的种类多样性和变化提供了直观高效的参考数据, 但掌握形态分类鉴定技术多需较长时间的专业训练和积累, 且鉴定结果较主观, 容易导致物种多样性被低估, 难以全面、准确地评价海域浮游植物多样性。
高通量测序方法是最近几十年发展起来的分子生物学技术, 通过对环境样本的特定DNA区域进行PCR扩增测序, 以分析环境DNA中物种组成、物种相对丰度及时空变化。高通量测序方法具有快速、高效等特点, 可以对大批次样品进行集中分析, 同时可以实现对显微镜观察下易忽视和混淆的微型和微微型浮游植物种类的鉴定。微型和微微型浮游植物是海洋初级生产力的重要贡献者, 是各大海域尤其是热带寡营养海域能量流动和物质循环的动力泵, 贡献了超过50%的初级生产力(Sieburth et al, 1978; Wang et al, 1997; Agawin et al, 2000; 向晨晖 等, 2021)。然而, 因其细胞粒径小, 在显微镜观察下容易忽视。例如, 定鞭藻门和隐藻门由于细胞粒径较小, 很难用光学显微镜检测和识别, 只有借助于扫描电子显微镜才能实现种水平的识别(Esenkulova et al, 2020; Liu et al, 2020)。真核生物核糖体小亚基18S V4区域具有高度变异性, 可作为物种区分鉴定的有效标记基因, 现已广泛应用于浮游植物多样性测序研究中(Kataoka et al, 2017; Penna et al, 2017; Xu et al, 2017; Song et al, 2019; Cui et al, 2021)。Wang等(2022)结合形态学和高通量测序方法调查了南海海域浮游植物群落组成, 测序显示显微镜观察下未观察到的定鞭藻门(Haptophyta)和隐藻门(Cryptophyta)藻类的存在。另外, 高通量测序还可以发现一些未报道的新种(de Vargas et al, 2015)。高通量测序方法与经典形态学鉴定方法结合后可获得调查海域较全面的浮游植物多样性及群落组成特征(Lee et al, 2016; Esenkulova et al, 2020), 用以促进对浮游植物多样性的认识, 并为探究某些关键种类如有害藻华藻类的潜在分布情况提供理论依据。
本研究针对深圳近岸海域日趋严峻的有毒有害藻华问题, 采集深圳湾4个季节的海水浮游植物样品, 利用高通量测序技术系统分析深圳湾真核浮游植物的群落组成和多样性。同时, 结合历史数据, 比对分析深圳湾有毒有害浮游植物的种类以及历年演替特征, 以期为深圳海域有害藻华的监测与防控以及海湾生态保护策略的制定提供参考。

1 数据和方法

1.1 样品采集

在深圳湾自湾口至湾内共设置5个调查站位S1~ S5 (图1和表1), 于2019年12月(冬季)、2020年8月(夏季)、2020年11月(秋季)和2021年4月(春季)开展了深圳湾4个季节的样品采集。使用容量为3L的采水器采集表层(0.5~1m)海水样品, 摇匀后, 用孔径为200µm的筛绢滤除大于200µm的生物, 取500mL初步过滤后的海水经孔径0.45µm混合纤维滤膜(HAWP04700, MF-Millipore)过滤。过滤后, 将滤膜对折放于5mL冻存管中, 于液氮中冷冻运输至实验室, 随后置于-80℃冰箱中保存, 等待后续分析。每个站位采集3个平行样品。
图1 采样站位图

该图基于广东省标准地图服务网站下载的审图号为粤s(2009)077号标准地图制作, 底图无修改。黑点为站位

Fig. 1 Map of sampling sites

表1 采样站位表

Tab. 1 List of sampling sites

海域 站位 经度/E 纬度/N
深圳湾 S1 113°52′ 22°27′
S2 113°55′ 22°28′
S3 113°57′ 22°29′
S4 113°58′ 22°30′
S5 114°00′ 22°30′

1.2 总DNA提取与PCR扩增

采用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)试剂盒, 按照该试剂盒的说明书提取浮游生物总DNA。利用真核生物18S V4区引物(上游引物3NDF: GGCAAGTCTGGTGCCAG, 下游引物V4-euk-R2R: ACGGTATCTRATCRTCTTCG)扩增总DNA的18S V4区(Mora et al, 2019)。PCR反应体系为: 4µL 5×FastPfu Buffer, 2µL 2.5mmol·L-1 dNTPs, 0.8µL上游引物(5µmol·L-1), 0.8µL下游引物(5µmol·L-1), 0.4µL FastPfu Polymerase, 0.2µL牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA), 10ng模板DNA, 补全ddH2O至20µL。PCR反应程序为: 95℃预变性3min, 95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s, 共循环35次, 最后72℃延伸10min。采用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳回收纯化, 采用Quantus™ Fluorometer对PCR产物进行定量。

1.3 PE文库构建及Illumina测序

使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit进行建库, 利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。基于97%的相似度, 使用UPARSE软件(Edgar, 2013)(http://drive5. com/uparse/, version7.1)对序列进行可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)聚类, 筛选出与代表序列相似性高的序列, 生成OTUs表格。利用RDP classifier对序列进行物种分类(Wang et al, 2007) (http://rdp.cme.msu.edu/, version2.2), 使用Silva 18S rRNA数据库对物种信息进行比对注释, 设置比对的阈值为70%。利用Primer 5计算群落特征指数。Shannon-Wiener指数(H')、丰富度指数(D)和Pielou均匀度指数(J)的计算公式如下:
$ H^{\prime}=-\sum_{i}^{s}\left(\frac{n_{i}}{N}\right) \times \log \left(\frac{n_{i}}{N}\right)$
$ D=\frac{\sum n(n-1)}{N(N-1)}$
$ J=\frac{H^{\prime}}{\log _{2} S}$
式中: S为样品中的种类数, ni为第i种类的个体数, N为样品中所有种类的总个数。

1.4 有毒有害物种的历史对比

依据联合国教科文组织政府间海洋学委员会(The Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO)的有害微藻分类清单(https://www. marinespecies.org/hab)(Lundholm et al, 2009), 对已公开发表的论文及历年海洋环境质量公报等资料中深圳海域的有害藻华生物进行统计(张冬鹏 等, 2001; 吴振斌等, 2002; 冷科明 等, 2004; 孙金水 等, 2010a; 张才学 等, 2010; 赵东至, 2010; 袁超 等, 2015; 桓清柳 等, 2016; Wang et al, 2020a; Wang et al, 2020b; 陈思 等, 2021; Huang et al, 2021), 分析深圳湾有毒有害藻华种类多样性和历史演替情况。参考的海洋环境公报有《广东省海洋环境质量公报》(2009—2010年, 广东省海洋与渔业局)、《广东省海洋环境状况公报》(2011—2017年, 广东省海洋与渔业局)和《广东省生态环境状况公报》(2018—2021年, 广东省生态环境厅)。

2 结果

2.1 深圳湾真核浮游植物群落结构

2.1.1 真核浮游植物组成

4个季节样品的高通量测序结果见表2, 其中春季鉴定出756个OTUs, 浮游植物OTUs占32.28%; 夏季鉴定出2522个OTUs, 浮游植物OTUs占26.17%; 秋季鉴定出1058个OTUs, 浮游植物OTUs占33.65%; 冬季鉴定出2057个OTUs, 浮游植物OTUs占24.94%。
表2 深圳湾4个季节OTUs注释结果

Tab. 2 The amount of annotation OTUs of the four season seawater samples in the Shenzhen Bay

季节 序列数 OTUs总数 浮游植物OTUs数目 浮游植物OTUs占比/%
2021年春季 41964~71230 756 244 32.28
2020年夏季 54698~118350 2522 660 26.17
2020年秋季 69035~73509 1058 356 33.65
2019年冬季 50352~53527 2057 513 24.94
对所得的OTUs进行注释, 得到浮游植物种类共有7个类群, 分别为甲藻(Dinoflagellata)、硅藻(Bacillariophyta)、绿藻(Chlorophyta)、定鞭藻(Haptophyta)、褐藻(Ochrophyta)、隐藻(Cryptophyta)和红藻(Rhodophyta), 共82科269种。春季样品中鉴定出真核浮游植物7门49科80种, 夏季样品中真核浮游植物共6门36科75种, 秋季样品中真核浮游植物7门53科112种, 冬季样品中真核浮游植物6门26科46种。深圳湾浮游植物组成表现出显著的季节特征(图2): 春季, 甲藻为优势类群(种类数量占比83.27%) > 绿藻(12.10%) > 硅藻(4.39%); 夏季, 绿藻(68.01%) > 硅藻(11.65%) > 甲藻(10.35%); 秋季, 绿藻(73.44%) > 硅藻(10.90%) > 甲藻(8.01%); 冬季, 绿藻(42.18%) > 硅藻(24.15%) > 甲藻(22.23%)。总体看, 除了春季, 其他3个季节浮游植物在门水平上均表现为绿藻 > 硅藻 > 甲藻。从春季到夏季甲藻种类数明显下降(83.27%→10.35%), 绿藻种类数显著增加(12.10%→68.01%)。隐藻在春季(12种)、秋季(16种)物种数量高于夏季(8种)、冬季(9种)。褐藻在冬季的物种数量最高, 达26种。
图2 深圳湾4个季节真核浮游植物种类组成情况(门水平)

Fig. 2 Species composition of phytoplankton eukaryote OTUs in the Shenzhen Bay at phylum level

站位分布上, 浮游植物群落组成在门分类水平上表现出一定的规律。春季, 甲藻丰度在深圳湾各站点均占优势, 硅藻丰度呈现由湾口向湾内减少的趋势; 夏季, 绿藻丰度在各站点均占优势, 甲藻丰度在夏、秋和冬季均呈现由湾口向湾内减少的趋势(图3)。除S1站点, 秋季和冬季绿藻丰度在各站点均占优势, 硅藻丰度在各站点占比相近。在科水平上(图4), 春季深圳湾海域各站点的浮游植物科群分布相对均匀, 没有明显的优势科; 夏季以骨条藻科(Skeletonemaceae)、圆筛藻科(Coscinodiscaceae)和栅藻科(Scenedesmaceae)为主。其中, 骨条藻科和圆筛藻科的分布呈现由湾口向湾内减少的趋势, 而栅藻科的分布则呈现由湾口向湾内增加的趋势; 秋季以角毛藻科(Chaetocerotaceae)和圆筛藻科为主, 呈现由湾口向湾内增加的趋势; 冬季以圆筛藻科、杆状藻科(Bacillariaceae)和舟形藻科(Naviculaceae)为主, 湾口至湾内分布较均匀。
图3 深圳湾4个季节不同类群真核浮游植物OTUs相对丰度

Fig. 3 Relative abundance of phytoplankton eukaryote OTUs of different seasons in the Shenzhen Bay

图4 深圳湾4个季节真核浮游植物在科水平上的种类组成情况

Fig. 4 Species composition of phytoplankton eukaryote OTUs in the Shenzhen Bay at family level

2.1.2 真核浮游植物优势种

以优势度≥0.02界定优势种、优势度≥0.1为绝对优势种, 对深圳湾各季节样品进行物种优势度分析(表3)。基于高通量测序数据, 本次调查中浮游植物优势种共23种, 其中春季5种、夏季5种、秋季6种、冬季7种。春季的绝对优势种为绿藻门微拟球藻(Nannochloris sp.)(优势度为0.54), 其次为硅藻门小环藻(Cyclotella choctawhatcheeana)(优势度为0.17); 夏季的绝对优势种为定鞭藻门球等鞭金藻(Isochrysis galbana)(优势度为0.47), 其次为硅藻门威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)(优势度为0.08); 秋季的绝对优势种为绿藻门微拟球藻(优势度为0.71), 其次为硅藻门骨条藻(Skeletonema spp.)(优势度为0.05); 冬季的绝对优势种为硅藻门极小海链藻(Thalassiosira minima)(优势度为0.43), 其次为褐藻门赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)(优势度为0.26)。深圳湾海域4个季节的优势物种中, 硅藻类出现频率最高, 绿藻门微拟球藻是春、秋两季的共有优势种。
表3 深圳湾4个季节浮游植物优势种

Tab. 3 Dominant phytoplankton in Shenzhen Bay

季节 物种 拉丁名 优势度 出现频率/% 平均丰度/(×103个·m-3)
2021年春季 微拟球藻 Nannochloris sp. 0.54 100 43.12
小环藻 Cyclotella choctawhatcheeana 0.17 100 13.77
Picochlorum maculatum Picochlorum maculatum 0.08 80 8.13
环沟藻 Gyrodinium sp. 0.08 100 6.40
新月筒柱藻 Cylindrotheca closterium 0.02 80 2.41
2020年夏季 球等鞭金藻 Isochrysis galbana 0.47 100 46.71
小球藻 Chlorella sorokiniana 0.07 60 11.78
威氏海链藻 Thalassiosira weissflogii 0.08 80 10.34
吉思纳海链藻 Thalassiosira gessneri 0.06 60 9.20
双眉藻 Sellaphora sp. 0.04 60 5.91
2020年秋季 微拟球藻 Nannochloris sp. 0.71 100 103.40
垂裂莱万藻 Levanderina fissa 0.02 100 2.94
骨条藻 Skeletonema sp. 0.05 100 7.61
异帽藻 Heterocapsa sp. 0.03 100 3.59
海链藻 Thalassiosira sp. 0.04 100 5.63
小环藻 Cyclotella choctawhatcheeana 0.02 100 3.10
2019年冬季 赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo 0.26 100 7.75
舟形藻 Navicula sp. 0.04 100 1.18
亚当斯骨条藻 Skeletonema ardens 0.06 100 1.93
菱形藻 Nitzschia sp. 0.03 100 0.88
新月筒柱藻 Cylindrotheca closterium 0.06 100 1.79
极小海链藻 Thalassiosira minima 0.43 100 12.83
梅尼小环藻 Cyclotella meneghiniana 0.03 80 0.93

2.2 真核浮游植物群落特征指数分析

各季节浮游植物多样性指数如表4所示。冬季浮游植物多样性指数(H')平均值最高(1.85), 春季最低(1.34)。春季和夏季, 多样性指数由湾口向湾中逐渐增高, 湾中多样性指数最高。秋季和冬季, 湾口处多样性指数最高, 由湾口向湾内逐渐降低。春季和夏季, 深圳湾湾内的浮游植物群落结构比湾口较为稳定, 秋冬季湾口浮游植物群落结构较湾内的稳定。丰富度指数(D)平均值冬季最高(0.59), 秋季最低(0.34)。其中, 春季湾口丰富度指数最高, 夏季自湾中部向湾内丰富度指数逐渐增加, 秋冬季丰富度指数均为自湾口向湾内逐渐降低。均匀度指数(J)平均值为秋季最高(6.43), 夏季最低(2.13)。其中, 春季均匀度指数湾中部高于湾口和湾内, 夏季湾中部和湾内高于湾口, 秋季由湾口向湾内均匀度指数逐渐降低, 冬季湾口处的S1站位和湾内部的S5站位均匀度指数高于湾中部站位。
表4 深圳湾浮游植物多样性指数

Tab. 4 The diversity indices of phytoplankton in the Shenzhen Bay

季节 站位 Shannon-Wiener多样性指数 Margalef丰富度指数 Pielou均匀度指数
2021年春季 S1 1.03 6.03 0.25
S2 1.20 3.37 0.35
S3 1.88 3.58 0.57
S4 1.51 3.20 0.44
S5 1.11 3.83 0.30
2020年夏季 S1 1.41 1.89 0.48
S2 1.51 3.46 0.44
S3 1.53 1.39 0.60
S4 1.25 1.94 0.41
S5 1.75 1.97 0.57
2020年秋季 S1 2.74 8.12 0.63
S2 1.45 7.22 0.33
S3 1.44 7.02 0.33
S4 0.85 5.42 0.21
S5 0.71 4.38 0.19
2019年冬季 S1 2.96 4.57 0.84
S2 1.38 3.06 0.41
S3 1.29 2.29 0.42
S4 1.69 2.12 0.58
S5 1.93 1.66 0.71

2.3 深圳湾海域真核有毒有害浮游植物多样性

结合高通量数据所注释的物种信息, 本研究在深圳湾共鉴定出有毒有害浮游植物32种(表5)。春季深圳湾海域有毒有害浮游植物有7种, 主要为甲藻门(3种)和褐藻门(2种); 夏季有12种, 主要为甲藻门(9种), 其中亚历山大藻属(Alexandrium)与海链藻属(Thalassiosira)的各有3种; 秋季有17种, 主要为硅藻门(9种), 其中角毛藻属(Chaetoceros)与圆筛藻属(Coscinodiscus)各有3种; 冬季有16种, 主要为甲藻门(8种)和硅藻门(6种), 其中甲藻门亚历山大藻属的种类3种。不同季节的深圳湾有毒有害浮游植物的种类有所不同: 春季的有毒有害浮游植物种类主要为甲藻和硅藻; 夏季和冬季以甲藻为主; 秋季以硅藻为主。春季深圳湾海域中有毒有害浮游植物各属的丰富度相当, 无明显优势属。夏季, 深圳湾有毒有害的亚历山大藻属与海链藻属的种类较多。秋季深圳湾有毒有害浮游植物以角毛藻属与圆筛藻属的种类居多。冬季则是亚历山大藻属种类数最多。
表5 深圳湾4个季节有毒有害浮游植物名录

Tab. 5 List of toxic and harmful phytoplankton in the Shenzhen Bay

序号 门类 种名 拉丁文名 危害 春季 夏季 秋季 冬季
1 甲藻门 近缘亚历山大藻 Alexandrium affine 有毒 √ √ √
2 广野亚历山大藻 Alexandrium hiranoi 有毒 √
3 链状亚历山大藻 Alexandrium catenella 有毒 √
4 奥斯亚历山大藻 Alexandrium ostenfeldii 有毒 √ √
5 安德森亚历山大藻 Alexandrium andersonii 有毒 √
6 塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense 有毒 √
7 渐尖鳍藻 Dinophysis acuminata 有毒 √
8 具刺膝沟藻 Gonyaulax spinifera 有毒 √ √ √
9 垂裂莱万藻(原名条纹环沟藻) Levanderina fissa 有害 √
10 剧毒卡尔藻 Karlodinium veneficum 有毒 √ √
11 夜光藻 Noctiluca scintillans 有害 √ √ √ √
12 凹面原甲藻 Prorocentrum concavum 有毒 √ √
13 钝齿原甲藻(原名东海原甲藻) Prorocentrum obtusidens 有害 √
14 巴哈马麦甲藻 Pyrodinium bahamense 有毒 √
15 双胞多沟藻 Polykrikos geminatum 有害 √
16 硅藻门 薄壁几内亚藻 Guinardia flaccida 有害 √
17 柔弱角毛藻 Chaetoceros debilis 有害 √
18 并基角毛藻 Chaetoceros decipiens 有害 √
19 平孢角毛藻 Chaetoceros laevisporus 有害 √
20 格氏圆筛藻 Coscinodiscus granii 有害 √
21 琼氏圆筛藻 Coscinodiscus jonesianus 有害 √ √
22 辐射圆筛藻 Coscinodiscus radiatus 有害 √ √
23 环纹娄氏藻 Lauderia annulata 有害 √
24 丹麦细柱藻 Leptocylindrus danicus 有害 √ √
25 伦德海链藻 Thalassiosira lundiana 有害 √ √
26 极小海链藻 Thalassiosira minima 有害 √ √
27 威氏海链藻 Thalassiosira weissflogii 有害 √
28 萎软海链藻 Thalassiosira mala 有害 √
29 褐藻门 海洋卡盾藻 Chattonella marina 有害 √
30 盐生卡盾藻 Chattonella subsalsa 有毒 √ √
31 赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo 有害 √ √ √
32 定鞭藻门 球形棕囊藻 Phaeocystis globosa 有害 √ √

注: √表示此季节出现的有毒有害浮游植物; 空白表示此季节未出现的有毒有害浮游植物

2.4 深圳海域有毒有害浮游植物的历史演替

自20世纪80年代至2021年, 深圳海域有害藻华发生次数和有毒有害浮游植物种类见图5。20世纪80年代共发生有害藻华30次, 肇事种有9种, 主要包括夜光藻(Noctiluca scintillans)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)和中肋骨条藻(Skeletonima costatum)。其中, 甲藻是主要的有害藻华肇事类群, 占有害藻华次数的93.33%。20世纪90年代, 深圳海域有害藻华次数共46次, 涉及25种有毒有害浮游植物。其中, 甲藻和硅藻共引发了44次有害藻华, 占有害藻华次数的95.65%, 甲藻引发有害藻华的占比为47.83%。2000至2009年期间, 深圳海域有害藻华次数达60次。由硅藻引发的有害藻华明显增多, 特别是2000至2004年期间, 共发生了13次有害藻华。在此期间, 甲藻引发有害藻华的占比下降, 为38.33%。2010至2021年, 有害藻华肇事物种达到31种, 多样性进一步增加。其中, 甲藻有14种, 主要为亚历山大藻属和鳍藻属(Dinophysis)种类; 硅藻有14种, 主要为角毛藻属(Chaetoceros)和圆筛藻属(Coscinodiscus)种类; 褐藻有2种, 分别为海洋卡盾藻(Chattonella marina)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo); 定鞭藻有1种, 为球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)。值得关注的是, 仅2020至2021年深圳湾就暴发有害藻华16次, 涉及有害藻华肇事物种高达19种。总体看, 近40年来深圳海域有毒有害藻华肇事种类变化规律较明显: 20世纪80年代和90年代主要肇事种为甲藻; 2000至2004年海域有毒有害浮游植物种类增多且主要为甲藻和硅藻; 2005至2009年有害藻华肇事种甲藻和硅藻的数量下降; 2010—2014年, 有害藻华肇事种甲藻数量明显减少, 仅有2种; 2015年后至今, 甲藻有害藻华的数量持续维持较低水平, 硅藻有害藻华占比上升。对有害藻华生物粒径的年代变化趋势进行统计显示, 20世纪90年代后微型浮游植物的物种数目未见明显变化, 而小型浮游植物的种类数则在2010—2021年期间有所减少。本研究鉴定出32种有毒有害浮游植物(表6), 其中微型浮游植物(2~20µm)共7种, 占比21.88%; 小型浮游植物(>20µm)共25种, 占比78.13%。本研究所得有毒有害物种在历史记录已见报道的有13种, 其中微型浮游植物2种, 小型浮游植物占比为11种。
图5 深圳海域有毒有害浮游植物赤潮爆发情况

Fig. 5 Toxic and harmful algal blooms in the coastal waters of Shenzhen from 1980 to 2021

表6 深圳湾有毒有害浮游植物粒级变化

Tab. 6 Changes in the size of toxic and harmful phytoplankton in the Shenzhen Bay

粒径水平 物种数目(占比)
20世纪80年代 20世纪90年代 2000—2010年 2010—2021年 本研究
微型浮游植物 1 (8.33%) 4 (16.67%) 4 (15.38%) 3 (16.67%) 7 (21.88%)
小型浮游植物 11 (91.67%) 20 (83.33%) 22 (84.62%) 15 (83.33%) 25 (78.12%)
总数 12 24 26 18 32
2001—2021年间深圳湾海域共爆发有毒有害藻华34起(图6)。其中, 海链藻有害藻华达5次, 中肋骨条藻有害藻华次之为4次, 赤潮异弯藻、红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)和垂裂莱万藻(Levanderina fissa)有害藻华各出现了2次。这些赤潮肇事种在本次高通量测序中均有检出, 赤潮异弯藻为本研究中冬季深圳湾海域浮游植物的优势种。
图6 2001—2021年期间深圳湾海域赤潮发生状况

Fig. 6 Toxic and harmful algal blooms in the Shenzhen Bay from 2001 to 2021

3 讨论

深圳湾不同季节海水中浮游植物的优势种不同(冷科明 等, 2004; 孙金水 等, 2010a)。据张才学等(2010)报道, 2008年春季与夏季深圳湾浮游植物优势种为湖沼圆筛藻(Coscinodiscus lacustris), 秋季为中肋骨条藻, 冬季优势种为中肋骨条藻和夜光藻。陈思等(2021)报道, 2013年春季深圳湾浮游植物优势种为角毛藻, 夏季是小型月牙藻(Selenastrum minutum)和微小色球藻(Chroococcus minutus), 冬季和秋季优势种为中肋骨条藻。2016年深圳湾春夏秋冬4个季节的优势种分别为夜光藻、颗粒直链藻(Melosira granulata)、中肋骨条藻和变异直链藻(Melosira varians)(Tang et al, 2019)。总体而言, 中肋骨条藻在深圳湾出现频率较高, 是较为稳定的优势种。传统鉴定海域浮游植物的多是基于形态分类学方法, 鉴定物种主要为细胞粒径大于20µm的个体。本文研究基于高通量分析方法, 对粒径大于0.45µm的浮游植物种类进行分析, 发现微微型浮游植物(包括微球藻、细小微胞藻、Bathycoccus及Picochlorum maculatum)在深圳湾海域广泛分布。春季和秋季浮游植物优势种为以微拟球藻, 夏季以球等鞭金藻为主要优势种, 冬季以极小海链藻为主要优势种。同时, 检测到7种有毒有害的微型浮游植物(包括剧毒卡尔藻、钝齿原甲藻、丹麦细柱藻、极小海链藻、萎软海链藻、盐生卡盾藻、球形棕囊藻)也在深圳湾出现。
本研究共鉴定出真核浮游植物269种, 以硅藻门、甲藻门和绿藻门为主, 占比分别为25.84%、28.38%和24.16%。与2000—2002年、2010年传统显微镜方法调查的浮游植物种类125种和83种相比, 本研究基于高通量测序结果显示该海域物种多样性更高, 但其中硅藻门种类占比相对降低, 甲藻门和绿藻门(尤其是微微型浮游植物)所占比例相对增高。基于光学显微镜的传统形态学鉴定技术对很多小型和微型浮游植物难以鉴定到种, 容易造成物种多样性被低估(Not et al, 2007; Palińska et al, 2008; Xiao et al, 2014)。基于核糖体大小亚基的扩增子高通量测序方法已被证明是强有力的物种多样性分析技术, 可以实现对环境DNA中物种多样性的大批量分析。但是该方法对物种种类的注释鉴定仍需基于传统分类方法对已有物种的正确鉴定和特定分子序列的获得, 无法对未知种进行注释。同时, 高通量PCR扩增过程中的引物不匹配或某些物种基因的优势扩增等可能会导致结果与传统的镜检结果有所差异(Sun et al, 2019)。
多样性指数可指示海水中浮游植物群落结构稳定性, 数值越大表明物种多样性越高, 数值减小表明群落结构趋于简单, 稳定性变差, 水质下降(张才学 等, 2010)。本次调查结果表明, 2019年冬季—2021年春季深圳湾海域浮游植物群落结构的多样性指数和均匀度指数在季节间呈现明显变化, 多样性指数范围为0.71~2.96, 而均匀度指数范围为0.21~0.84。参考邱阳凌等(2018)以多样性指数评价浮游植物群落结构的标准, 深圳湾海域大部分站点处于中度污染状态, 浮游植物群落结构单一, 稳定性较差。
1981—2002年深圳湾海域有害藻华种类主要为甲藻[亚历山大藻、角甲藻(Ceratium sp.)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、红色赤潮藻、裸甲藻、垂裂莱万藻、夜光藻]和硅藻(中肋骨条藻和海链藻)(冷科明 等, 2004)。2013年深圳湾海域引发有害藻华种类有12种, 甲藻仅有2种[叉状新角藻(Neoceratium furca)和三角新角藻(Neoceratium tripos)], 硅藻有10种[中肋骨条藻、萎软海链藻(Thalassiosira mala)、旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、并基角毛藻(Chaetoceros decipiens)、窄隙角毛藻(Chaetoceros affinis)、冕孢角毛藻(Chaetoceros subsecundus)、格式圆筛藻(Coscinodiscus granii)、琼氏圆筛藻(Coscinodiscus jonesianus)、辐射圆筛藻(Coscinodiscus radiatus)], 其中小型浮游植物占比91.67% (陈思, 2020)。本文整理发现, 20世纪80年代和90年代深圳湾的主要有害藻华肇事种为甲藻, 2000年前后硅藻逐渐成为主要有害藻华生物。从2005年开始, 硅藻有害藻华开始减少, 甲藻和其他门类有害藻华开始增多, 球形棕囊藻、红色赤潮藻、赤潮异湾藻和夜光藻在深圳湾海域近年来频繁发生, 藻华种类存在有毒有害化和微型化趋势。

4 结论

1) 基于高通量测序数据, 深圳湾海域2019年冬季—2021年春季4个季节的调查共鉴定出浮游植物7门82科269种。春季和秋季的优势种是微拟球藻, 夏季的优势种是球等鞭金藻, 冬季的优势种是极小海链藻。在4个季节中, 冬季深圳湾浮游植物多样性指数最高。
2) 高通量数据共注释出有毒有害浮游植物32种, 其中甲藻类群有15种, 硅藻类群有13种, 褐藻类群3种, 定鞭藻类群有1种。
3) 梳理深圳湾海域的历史数据, 发现研究海域的有毒有害浮游植物种类呈现微型化和多样性逐渐增加趋势, 存在由甲藻或硅藻为主的有毒有害单类群群落向以甲藻和硅藻为主的有毒有害双类群群落演替的现象。

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