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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 4: 123 - 136

DOI: https://doi.org/10.11978/2023134

Marine Biology

Predicted family characteristics and evolution of the heat shock protein HSP70 in Sinularia acuta

  • LI Ziruo , 1, 2, 3 ,
  • LUO Yanjie 1, 2, 3 ,
  • CAO Zheng 4 ,
  • CHIN Yaoxian 1, 2 ,
  • WANG Peizheng , 1, 2, 3, 5, 6
Expand
  • 1. Yazhou Bay Innovation Institute of Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China
  • 2. Nansha Islands Coral Reef Ecosystem National Observation and Research Station, Guangzhou 510300, China
  • 3. College of Ecology and Environment, Hainan Institute of Tropical Oceanography, Sanya 572022, China
  • 4. Sanya Haichang Fantasy Town, Sanya 572022, China
  • 5. Modern marine ranching engineering research center of Hainan, Sanya 572022, China
  • 6. Hainan Provincial Key Laboratory of Marine Ecological Environment Processes and Carbon Sequestration, Sanya Hainan 572022, China
WANG Peizheng. Email:

Copy editor: SUN Cuici

Received date: 2023-09-17

  Revised date: 2023-10-07

  Online published: 2023-11-29

Supported by

Key Research and Development Project of Hainan Province(ZDYF2021SHFZ104)

Provincial Student Innovation and Entrepreneurship Training Program(S202111100016)

Special Fund for Green Mountain Public Welfare of Meituan Takeout of China Environmental Protection Foundation(CEPFQS202169-27)

Fold

Abstract

Heat shock protein 70 (HSP70) is a highly conserved protein that plays a key role in protecting biological cells or tissues from heat or oxidative stress. Due to the continuous warming of the global environment and the widespread bleaching and death of corals, how corals respond to the stress resistance mechanism of continuous warming is a scientific research hotspot. However, current research on the characteristics of the HSP70 family in corals are relatively rare. In this study, 28 members of the HSP70 family were identified by analysis of the Sinularia acuta protein sequences under high temperature stress, all of which were acidic hydrophilic proteins with relatively stable structure. Subcellular localization showed that HSP70 was mainly found in coral nuclei and cytoplasm, with lesser amount in mitochondria and endoplasmic reticulum. Signal peptide predictions showed that 26 of the 28 HSP70 members did not have signal peptides, most of them do not secrete proteins and did not have a transmembrane structure. The phylogenetic tree showed that the members of the S. acuta HSP70 family can be clustered into 5 classes. Analysis of the structure and conserved regions of the hsp70 gene family of S. acuta predicted 10 motifs which could be divided into 5 subfamilies. The main secondary structure of the HSP70 protein in S. acuta was α-helix followed by random coiling. N-glycosylation sites were predicted in 25 of the 28 HSP70 family proteins, with the number of sites ranging from 1 to 9. All 28 HSP70 family proteins were predicted to have phosphorylation and O-glycosylation sites, with a total number in the range of 41~96 and 1~23, respectively. The results of this study on the HSP70 family lay the foundation for future research on the adaptive mechanisms of corals in response to global warming stress.

Key words： Sinularia acuta; heat shock proteins; HSP70 family; evolution

Cite this article

LI Ziruo , LUO Yanjie , CAO Zheng , CHIN Yaoxian , WANG Peizheng . Predicted family characteristics and evolution of the heat shock protein HSP70 in Sinularia acuta[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(4) : 123 -136 . DOI: 10.11978/2023134

软珊瑚主要分布在热带、亚热带海区珊瑚礁和岩礁区浅水区域。目前已知软珊瑚有1000多种, 从东非到西太平洋海区均有分布(何伶俐, 2013)。作为海洋底栖固着生物, 有拒捕食、克生等化学防御作用(王长云 等, 2008)。指形软珊瑚(Sinularia)是软珊瑚物种中多样性高、分布较为广泛的珊瑚种类。目前有记录的指形软珊瑚约有180多种(王正 等, 2018)。软珊瑚主要分布在热带海域, 尤其是印度洋和太平洋地区的浅海水域, 其分布深度范围从海平面到水深30米之间。我国南海有着丰富的珊瑚礁资源, 也是软珊瑚喜好分布的区域。在海南省三亚海域分布广泛的软珊瑚, 多以指形软珊瑚为主。软珊瑚大都分布在浅水区域, 生长较为密集, 分布呈地毯状, 对维护珊瑚礁生态系统的稳定和生物多样性方面起着重要作用(黄丁勇 等, 2021)。
热激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是普遍存在于生物细胞内的一类分子伴侣, 其主要功能是帮助细胞内肽链正确折叠。生物体在外界不利环境因子(如低温、高温和紫外线辐射等)的胁迫下, 蛋白功能受损, 细胞稳态被破坏, 此时HSPs大量表达, 帮助生物体抵御外界胁迫, 从而增强生物体的抗逆能力(Richter-Landsberg et al, 2003)。在生物的热休克反应过程中体内抑制正常基因表达, 并迅速合成大量热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)。热休克蛋白是大部分蛋白质中进化最保守的蛋白质(徐秀菊, 2015), 其蛋白家族庞大, 根据不同的分类标准有不同的分类结果。通常倾向于基于其分子量(KDalton)大小划分为六个主要的家族, 分别是HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小热休克蛋白。不同家族它们的结构特征、亚细胞定位、行使功能等各不相同。
在所有热休克蛋白中HSP70最为常见, 引起了较多的关注和研究。HSP70是一个普遍存在的分子伴侣家族, 在蛋白稳定的过程中起核心作用, 参与蛋白质折叠和转运, 它们分布广、保守性强。HSP70在细胞耐受过程中发挥重要的作用, 通过抑制氧自由基等不利因素的生成, 抑制死亡受体等(彭乔烽 等, 2019)。HSP70参与细胞凋亡、自噬等调节, 发挥抗细胞凋亡的功能(Ribeil et al, 2007; Hishiya et al, 2010)。HSP70是细胞内重要的分子伴侣, 它利用ATP水解引发的构象变化来帮助蛋白质折叠、分解和降解, 在细胞蛋白稳定中有着举足轻重的作用(Fernández-Fernández et al, 2017)。
近年来, 由于自然环境的转变, 随着频繁、广泛的珊瑚白化事件的发生, 人们对温度升高珊瑚产生热休克蛋白相关研究越来越感兴趣, 目前hsp70基因已经在许多石珊瑚中被鉴定和表征。Black等1995年探究了热应激条件下造礁珊瑚(Montastraea faveolata)热休克蛋白的种类, 初步认为热休克蛋白可能与珊瑚耐热性和白化相关(Black et al, 1995)。同年, Hayes等研究表明, 热胁迫能诱导珊瑚表达HSP70(Hayes et al, 1995)。随后, Sharp等研究了热带珊瑚礁中大管孔珊瑚(Goniopora djiboutiensis) 在热胁迫条件下HSP70表达情况, 发现该珊瑚在升温处理后HSP70表达量有明显上升趋势(Sharp et al, 1997)。Mayfield等在2011年报道升温引起尖枝列孔珊瑚(Seriatopora hystrix) HSP70蛋白的增加而发挥耐热作用(Mayfield et al, 2011)。Zhang等(2018)从鹿角杯形珊瑚转录物组装鉴定到30个hsp70基因, 并观察到一个关键的hsp70在高温下表达。
珊瑚在应对环境变化的情况下, 有自身的抗逆机制, 如通过热休克蛋白调控使机体能适应在恶劣的环境中生存。因此解析珊瑚与环境应激相关功能上紧密相关的热休克蛋白, 对于研究珊瑚礁生态系统对环境胁迫的响应机制具有重要的意义。但珊瑚热休克蛋白家族特征解析和结构特征方面国内外鲜有研究报道, 目前知之甚少。本研究基于已测序的短指软珊瑚基因组蛋白序列信息, 挖掘出hsp70基因家族成员进行探究, 了解其家族的理化性质、进化关系以及在应对热胁迫中发挥的作用, 为进一步研究短指软珊瑚生态系统对环境胁迫的响应机制提供理论基础。

1 实验材料

短指软珊瑚(Sinularia acuta)采集于海南三亚西岛海域, 暂养在学校珊瑚馆完全恢复正常后用于后期升温胁迫实验及蛋白质组学测序。研究数据库有 Gene Bank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、Pfam (http://pfam-legacy.xfam.org/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/)、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。涉及的软件有MEGA、Tbtools, 其他分析软件及功能详见(表1)。
表1 分析工具网址及功能

Tab. 1 Website and use of analysis tools

分析工具 网址 功能
NCBI CD-search https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/ 保守结构域预测
ExPASy-ProtParam tool https://web.expasy.org/protparam/ 蛋白质的氨基酸数量、分子量、等电点、稳定性
Singa IP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 信号肽预测
ExPASy-ProtScale tool https://www.expasy.org/resources/protscale 蛋白质的亲水性
TMHMM 2.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0 跨膜区域预测
WoLF PSORT https://wolfpsort.hgc.jp/ 亚细胞定位预测
MEME https://meme-suite.org/meme/tools/meme 保守结构域分析
SWISS-MODEL https://swissmodel.expasy.org 蛋白质三维结构
SOPMA http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html 蛋白质的二级结构
NetPhos 3.1 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1 磷酸化位点预测
NetNGlyc 1.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0 N-糖基化位点预测
NetOGlyc 4.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0 O-糖基化位点预测

2 实验方法

2.1 HSP70家族基因鉴定

短指软珊瑚在实验室经32℃高温胁迫12小时, 取样后送公司进行总蛋白质高通量测序, 获得全基因组蛋白序列数据库。测序方法为iTRAQ定量蛋白质组学技术(isobaric tag for relative absolute quantitation), 该技术是应用广泛的蛋白质定量技术。对质谱下机的原始文件进行峰识别, 得到峰列表。建立参考数据库, 进行肽段及蛋白质的鉴定。依据蛋白质的鉴定结果从该数据库中获取全部可能HSP70序列。通过pfam数据库获取HSP70保守区域的隐马尔可夫模型(PF00012), 以其作为搜索模型通过使用Tbtools软件中的HMM search程序全基因组蛋白序列中筛选HSP70序列设置E-value < 0.001, 并去除冗余。利用NCBI-CDD数据库进行结构域预测。利用PfamScan数据库确定是否含有HSP70结构域的基因。

2.2 HSP70家族理化性质和进化分析

在线软件 ExPASy-ProtParam tool分析短指软珊瑚HSP70家族成员理化性质。在线软件WoLF PSORT预测短指软珊瑚HSP70家族成员的亚细胞定位, 选择得分最高的作为预测结果。使用SingaIP 5.0对蛋白的信号肽进行预测。使用TMHMM 2.0在线分析蛋白是否含有跨膜区域。MEGA软件进行蛋白序列多重比对, 基于邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建系统发育进化树, Bootstrap值设置1000, 其余参数使用默认值。利用Interaction Tree Of Life网站进行进化树美化。

2.3 HSP70家族基因结构、二级结构和三级结构预测

在线软件MEME预测HSP70蛋白序列的基序(motif), 参数设置为: 检索最大的Motif数为10, 保存MAST XML output。将HSP70蛋白序列、MEME导出文件、HSP70进化树文件和保守结构域预测的文本文件导入TBtools, 利用TBtools中的Gene structure工具对进化树、Motif结构图、保守结构域图进行三图合一可视化。将蛋白序列提交至SOPMA在线网站进行蛋白的二级结构预测。使用Swiss-Model在线工具对HSP70的三级结构进行预测, 当模板序列与目标序列的相似度大于30%时, 作为建模结果。

2.4 HSP70磷酸化位点、O-糖基化位点和N-糖基化位点的预测

使用生物序列分析中心NetPhos 3.1在线分析网站对HSP70磷酸化位点进行分析预测, 并统计蛋白含有丝氨酸(serine, Ser)、苏氨酸(threonine, Thr)、酪氨酸(tyrosine, Tyr)的位点数量, 分析磷酸化位点所对应的蛋白激酶。使用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0分别进行潜在的N-糖基化位点和O-糖基化位点的预测。

3 结果分析

3.1 HSP70蛋白家族理化性质和亚细胞定位

HSP70蛋白家族理化性质如大小、等电点分析以及亚细胞定位对预测蛋白家族在细胞内的主要生理功能有重要意义。实验使用iTRAQ质谱技术, 通过分析后共得到Unique 谱图数量2.9万张, 共鉴定到2千多个蛋白。基于HSP70的隐马尔可夫模型(PF00012), 利用TBtools软件初步筛选得到49条HSP70蛋白家族序列。采用PfamScan预测这49条蛋白序列的结构域, 去除掉7个不含有HSP70蛋白结构域序列, 并筛去分子量预测小于60000Da蛋白, 最终得到28条蛋白序列。短指软珊瑚HSP70家族蛋白依据分子量的大小依次编号为SaHSP70-1至SaHSP70-28(表2)。
表2 短指软珊瑚HSP70家族信息

Tab. 2 Information on HSP70 family in S. acuta

基因编号 蛋白质ID 氨基酸数量 分子量 等电点 亚细胞定位
aHSP70-1 CL1233.Contig3_All 912 101494.21 4.82 细胞核
SaHSP70-2 CL1233.Contig2_All 901 100456.04 4.80 细胞核
SaHSP70-3 Unigene26028_All 893 100307.02 5.87 细胞核
SaHSP70-4 Unigene39656_All 877 99089.04 5.12 细胞质膜和细胞核膜
SaHSP70-5 CL1233.Contig1_All 878 98371.94 4.87 细胞核
SaHSP70-6 Unigene40238_All 834 92628.05 5.22 内质网
SaHSP70-7 Unigene35289_All 748 82074.38 5.31 细胞核、细胞质
SaHSP70-8 Unigene25760_All 717 79097.83 5.36 细胞质膜和细胞核膜
SaHSP70-9 CL1357.Contig5_All 725 76099.19 5.03 线粒体
SaHSP70-10 CL1357.Contig6_All 725 76099.19 5.03 线粒体
SaHSP70-11 CL1357.Contig10_All 698 73525.14 4.92 细胞质
SaHSP70-12 CL1357.Contig9_All 698 73525.14 4.92 细胞质
SaHSP70-13 CL1357.Contig4_All 689 72820.29 4.91 细胞质
SaHSP70-14 Unigene31979_All 655 71933.13 5.20 细胞质
SaHSP70-15 CL3978.Contig10_All 648 71104.23 5.07 细胞质
SaHSP70-16 Unigene1394_All 657 70957.30 5.18 线粒体
SaHSP70-17 CL3978.Contig3_All 643 70673.78 5.12 细胞质
SaHSP70-18 CL3978.Contig1_All 643 70638.72 5.12 细胞质
SaHSP70-19 CL3356.Contig1_All 647 70578.80 5.08 细胞质
SaHSP70-20 CL3356.Contig2_All 647 70562.86 5.13 细胞质
SaHSP70-21 CL3978.Contig2_All 642 70453.51 5.12 细胞质
SaHSP70-22 Unigene797_All 626 70077.35 5.37 细胞质
SaHSP70-23 CL3978.Contig6_All 633 69758.80 5.03 细胞质
SaHSP70-24 CL3978.Contig8_All 633 69666.51 4.96 细胞质
SaHSP70-25 Unigene40279_All 617 68987.59 5.98 细胞质
SaHSP70-26 Unigene35732_All 624 67397.85 4.98 细胞核、细胞质
SaHSP70-27 Unigene45234_All 630 67279.60 5.22 细胞质基质外
SaHSP70-28 Unigene5923_All 560 61929.42 5.92 细胞质
表2可以看出短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员氨基酸序列长度范围较大, 从560aa到912aa不等。HSP70家族蛋白质分子量在61929.42~101494.21Da之间。HSP70家族成员蛋白质理论等电点的范围在4.80~5.98之间, 28条家族成员等电点均小于7, 全部以酸性形式存在。蛋白质不稳定指数以40作为分界线, HSP70蛋白家族成员中有23条蛋白序列不稳定指数小于40, 表明其成员大部分是稳定蛋白质(图1)。HSP70蛋白家族28条蛋白序列总平均亲水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)均为负值, 表明这些蛋白均为亲水性蛋白。
图1 短指软珊瑚HSP70家族成员不稳定指数和总平均亲水性

Fig. 1 Family member instability index and GRAVY of HSP70 in S. acuta

研究表明HSP70蛋白家族大部分成员位于细胞质中, 其次是细胞核, 有3个定位在线粒体中, 有1个(Unigene40238_All)定位在内质网上, 1个蛋白(Unigene45234_All)定位于细胞质基质外。跨膜区域预测结果显示28个HSP70蛋白均不含有跨膜区域, 为非分泌蛋白。只有Unigene45234_All、Unigene40238_All这两个序列所编码的蛋白检测出存在信号肽, 分别存在于细胞质基质外和内质网中(图2)。Unigene45234_All蛋白的剪切位点在第13~14位氨基酸之间, 而Unigene40238_All蛋白的剪切位点在第14~15位氨基酸之间。
图2 SaHSP70的信号肽预测

Fig. 2 Signal peptide prediction for SaHSP70

3.2 HSP70蛋白家族进化分析

HSP70蛋白家族在生物体抗应激过程中发挥着重要作用, 进化上高度保守, 研究其家族进化有助于揭示其在应对热胁迫中发挥的作用。基于已测序的短指软珊瑚基因组蛋白序列信息, 对其HSP70蛋白家族成员进化进行探究, 为便于与其他相近参考物种之间进行进化关系比较, 参考物种选择考虑到进化上较为相近、同时形态结构也相似比如都为多细胞或多聚体等特征。从Gene Bank数据库中选取了4个暗色海葵Actinia tenebrosa、4个海葵Exaiptasia diaphana、4个鹿角杯形珊瑚Pocillopora damicornis、4个疣状杯形珊瑚Pocillopora verrucosa、4个柱形珊瑚Stylophora mamillata、2个桶状海绵Xestospongia muta和1个软珊瑚Capnella imbricata共7个物种的HSP70蛋白序列共23条作为参考基因组(表3)。参考基因组与28个HSP70蛋白家族成员, 共51条蛋白序列绘制系统发育进化树及蛋白相似度(图3)。结果表明, 包括参考序列的HSP70蛋白家族可以分为8大类(Class Ⅰ—Ⅷ)而短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员聚成5大类, 分布在Class Ⅱ—Ⅵ。Class Ⅰ、Class Ⅶ、Class Ⅷ分别包含鹿角杯型珊瑚、疣状杯型珊瑚和柱形珊瑚HSP70。Class Ⅰ(主要为海葵)与Class Ⅵ(柱形珊瑚)、Ⅶ(桶状海绵)和Ⅷ(鹿角杯型珊瑚、疣状杯型珊瑚)的遗传距离最远。Class Ⅰ亚家族包括1个暗色海葵、2个海葵, 2个疣状杯型珊瑚及1个鹿角杯型珊瑚的HSP70。Class Ⅱ亚家族包含8个短指软珊瑚HSP70。9个短指软珊瑚、2个海葵和3个暗色海葵HSP70同属于Class Ⅲ亚家族, 亲缘关系较近, 这些物种均为软体物种。Class Ⅳ亚家族包括6个短指软珊瑚HSP70蛋白。Class V亚家族包括4个短指软珊瑚HSP70蛋白。注释可知软珊瑚Capnella imbricata中, CiHSP70-1有协助ATP结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣的分子功能, 推测同属于Class Ⅵ亚家族 SaHSP70-14也具有协助ATP结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣的分子功能。
表3 暗色海葵等7个参考物种的信息来源

Tab. 3 Information on seven species of Actinia tenebrosa etc

物种中文名 物种拉丁文名 基因登录号 编号
暗色海葵 Actinia tenebrosa XP_031562268.1 AtHSP70-1
Actinia tenebrosa XP_031555558.1 AtHSP70-2
Actinia tenebrosa XP_031552530.1 AtHSP70-3
Actinia tenebrosa XP_031552529.1 AtHSP70-4
海葵 Exaiptasia diaphana KXJ22228.1 EdHSP70-1
Exaiptasia diaphana KXJ18030.1 EdHSP70-2
Exaiptasia diaphana KXJ15022.1 EdHSP70-3
Exaiptasia diaphana KXJ09058.1 EdHSP70-4
鹿角杯形珊瑚 Pocillopora damicornis AFW20530.1 PdHSP70-1
Pocillopora damicornis AFW20529.1 PdHSP70-2
Pocillopora damicornis AFW20516.1 PdHSP70-3
Pocillopora damicornis AFW20572.1 PdHSP70-4
疣状杯形珊瑚 Pocillopora verrucosa AFW20524.1 PvHSP70-1
Pocillopora verrucosa AFW20525.1 PvHSP70-2
Pocillopora verrucosa AFW20582.1 PvHSP70-3
Pocillopora verrucosa AFW20581.1 PvHSP70-4
柱形珊瑚 Stylophora mamillata CZF87364.1 SmHSP70-1
Stylophora mamillata CZF87363.1 SmHSP70-2
Stylophora mamillata CZF87365.1 SmHSP70-3
Stylophora mamillata CZF87360.1 SmHSP70-4
桶状海绵 Xestospongia muta ABY54994.1 XmHSP70-1
Xestospongia muta ABY54993.1 XmHSP70-2
软珊瑚 Capnella imbricata AJA72720.1 CiHSP70-1
图3 HSP70家族系统进化树和蛋白相似程度

At: 暗色海葵; Ed: 海葵; Pd: 鹿角杯型珊瑚; Pv: 疣状杯型珊瑚; Sm: 柱形珊瑚; Xm: 桶状海绵; Ci: 软珊瑚

Fig. 3 Phylogenetic tree and similarity of HSP70 family

HSP70蛋白相似程度结果表明, 疣状杯形珊瑚、鹿角杯型珊瑚和柱形珊瑚这3种造礁珊瑚种类之间的HSP70蛋白相似程度较高, 与短指软珊瑚的HSP70蛋白相似程度低。暗夜海葵、海葵之间的HSP70蛋白相似程度高, 与造礁珊瑚、软珊瑚、短指软珊瑚之间的相似程度低。桶状海绵与造礁珊瑚种类之间HSP70的蛋白相似程度较高, 与短指软珊瑚的HSP70蛋白相似程度低。软珊瑚与短指软珊瑚的HSP70蛋白相似程度最多达51.3%。短指软珊瑚种内的SaHSP70蛋白序列相似程度较高。不同物种的种内相似程度高。说明不同物种的HSP70基因家族在种内形成了较为稳定的进化方向, 有一定的功能特征。

3.3 HSP70蛋白家族结构和保守基序分析

HSP70蛋白家族进化分析基础上, 为进一步了解HSP70蛋白结构和进化过程中的结构变化, 有利于与其他家族成员进化特点进行比较和发现进化过程中产生了新突变。28条HSP70蛋白序列的motif预测结果显示, 共预测到了10个保守的motif, 分别为motif1—motif10, 长度在29~50个氨基酸之间。Motif注释表明motif4和motif6为保守DnaK结构域。Motif4、motif8和motif9保守性最强, 28条HSP70蛋白家族成员都含有这三个保守基序。含有motif1、motif6和motif10的HSP70蛋白成员各有27个, 其中26个HSP70蛋白家族成员含有motif7, 25个含有motif2。含有motif3和motif5的家族成员最少, 只有20个。
基于motif系统发育28条短指软珊瑚的HSP70蛋白家族被分为Class A—Class E 5个亚家族(图4)。Class A、Class B和Class C亚家族包含20条HSP70, 其中有19条包含所有10个保守的motif。Class D亚家族HSP70缺少motif3、motif5。Class E亚家族HSP70分别含有4和7种motif。Unigene40238_All这条序列中含有两个motif4, 可能是进化过程中发生了基因重复。
图4 SaHSP70家族进化树(a)、保守基序预测(b)、结构域分布(c)

Fig. 4 (a) Phylogenetic tree; (b) prediction of conserved Motifs; (c) distribution of domains of SaHSP70 family

28条HSP70蛋白序列的保守结构域分析共鉴定出11种结构域(图5), 9条HSP70蛋白序列包含PTZ00009 superfamily结构域的, 6条包含DnaK结构域, dnaK superfamily结构域发挥分子伴侣作用。5条包含Recombinant Heat Shock 70kDa Protein 4(HSPA4)_like_NDB结构域, 3条包含PTZ00121 superfamily结构域。Unigene25760_All蛋白序列包含NBD_sugar-kinase_HSP70_actin superfamily结构域和3a0801s09结构域。NBD_sugar-kinase_HSP70_actin superfamily结构域上有核酸结合位点和底物结合域接口(substrate-binding domain, SBD), 而3a0801s09结构域上有tetratricopeptide repeat(TPR)重复和预测蛋白质结合表面。
图5 部分蛋白质三维结构预测图

Fig. 5 3D structure prediction map of some proteins

Class A类中的六条序列和Class B中的Unigene797_All、Unigene31979_All、Unigene40279_All三条注释为类似于内质网伴侣(binding protein, BiP), 在内质网腔的蛋白质折叠和质量控制中起关键作用。Class B类中的CL3356.Contig1_All和CL3356. Contig2_All两条序列编码蛋白被划分为一种胞质伴侣, 可促进蛋白质折叠、降解、复杂组装和易位。Class C类中的Unigene5923_All和Unigene35732_All两条序列编码的蛋白参与DNA复制、蛋白质折叠和应激反应。Class C类中六条蛋白未被注释, 推测这6条蛋白序列的功能和同家族被注释的两条相似。Class D类中的Unigene35289_All、Unigene39656_All两条参与DNA复制、蛋白质折叠和应激反应的分子伴侣。Class E类中的Unigene26028_All、Unigene40238_All两条注释缺氧上调蛋白1样蛋白(Hypoxia up-regulated protein 1, HYOU1), 类似于脊椎动物缺氧上调蛋白1和酵母热休克蛋白70同系物LHS1。

3.4 HSP70蛋白二级结构和三维结构预测

HSP70蛋白在细胞中分布广、保守性强, 在细胞耐受过程中发挥重要的作用。它利用ATP水解引发的构象变化来帮助蛋白质折叠、分解和降解, 在细胞蛋白稳定中有着举足轻重的作用。SOPMA在线分析表明HSP70家族蛋白二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲组成(表4)。其α-螺旋含量在35.36%~64.99%范围, 无规则卷曲含量在24.27%~ 39.11%范围; 延伸链含量在9.07%~22.68%范围; β-折叠含量在1.67%~8.66%范围。HSP70蛋白质主要是由α-螺旋和无规则卷曲构成, 结构比较稳定。不同的HSP70蛋白α-螺旋和无规则卷曲的比例不同, 造成了蛋白质三维结构的差异。
表4 软珊瑚HSP70蛋白的二级结构预测

Tab. 4 Secondary structure prediction of HSP70

基因ID 基因命名 α-螺旋/% β-折叠/% 延伸链/% 无规则卷曲/%
SaHSP70-1 CL1233.Contig3_All 45.72 4.06 13.71 36.51
SaHSP70-2 CL1233.Contig2_All 45.28 4.00 13.54 37.18
SaHSP70-3 Unigene26028_All 49.61 3.70 12.43 34.27
SaHSP70-4 Unigene39656_All 44.47 3.08 13.34 39.11
SaHSP70-5 CL1233.Contig1_All 48.86 3.30 12.87 34.97
SaHSP70-6 Unigene40238_All 48.92 3.48 14.03 33.57
SaHSP70-7 Unigene35289_All 51.74 3.21 14.44 30.61
SaHSP70-8 Unigene25760_All 64.99 1.67 9.07 24.27
SaHSP70-9 CL1357.Contig5_All 42.62 6.90 19.72 30.76
SaHSP70-10 CL1357.Contig6_All 42.62 6.90 19.72 30.76
SaHSP70-11 CL1357.Contig10_All 42.41 6.45 19.91 31.23
SaHSP70-12 CL1357.Contig9_All 42.41 6.45 19.91 31.23
SaHSP70-13 CL1357.Contig4_All 42.53 6.79 20.17 30.33
SaHSP70-14 Unigene31979_All 41.68 7.33 17.86 33.13
SaHSP70-15 CL3978.Contig10_All 43.67 7.41 18.98 29.94
SaHSP70-16 Unigene1394_All 40.94 7.46 21.46 30.14
SaHSP70-17 CL3978.Contig3_All 42.30 7.78 20.06 29.86
SaHSP70-18 CL3978.Contig1_All 44.01 6.84 19.44 29.70
SaHSP70-19 CL3356.Contig1_All 42.04 8.50 17.93 31.53
SaHSP70-20 CL3356.Contig2_All 42.04 8.66 18.08 31.22
SaHSP70-21 CL3978.Contig2_All 42.83 7.48 20.09 29.60
SaHSP70-22 Unigene797_All 43.13 7.03 18.85 30.99
SaHSP70-23 CL3978.Contig6_All 42.02 6.79 19.27 31.91
SaHSP70-24 CL3978.Contig8_All 42.50 7.74 19.59 30.17
SaHSP70-25 Unigene40279_All 43.44 6.32 19.12 31.12
SaHSP70-26 Unigene35732_All 44.23 6.89 20.35 28.53
SaHSP70-27 Unigene45234_All 42.70 7.62 19.05 30.63
SaHSP70-28 Unigene5923_All 35.36 8.04 22.68 33.93
HSP70家族蛋白3D结构预测可分为Class A至Class E家族, 与模板蛋白序列一致度超过了30%, 平均一致度为51.98%, 表明蛋白3D结构预测可靠。Class A家族中包含6个HSP70, 三维结构高度相似, 大部分为α-螺旋。Class B类家族中包含6个HSP70。Class C(包含8个HSP70)和Class D(包含5个HSP70)家族蛋白质三维结构相似。Class D家族中的Unigene35289_All与其他成员有明显不同, 螺旋化程度高。Class E家族中的成员三维结构差异较大(图5)。

3.5 HSP70磷酸化和糖基化位点预测

蛋白质磷酸化可以可逆地调节蛋白质功能, 是研究最多的翻译后蛋白质修饰。HSP70蛋白潜在磷酸化位点预测, 预测阈值大于0.5结果见(表5)。结果显示HSP70蛋白的磷酸化位点总个数在4~96范围内, 其中丝氨酸磷酸化位点个数范围在21~56, 苏氨酸磷酸化位点个数范围在14~33, 酪氨酸磷酸化位点个数范围在0~9。27个HSP70蛋白成员均含有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点, 仅有Unigene45234_All不含有酪氨酸磷酸化位点。HSP70蛋白磷酸化位点所对应的蛋白激酶预测可能存在protein kinase C(PKC)、protein kinase A(PKA)、Ribosomal S6 Kinase(RSK)、protein kinase g(PKG)、Glycogen Synthase Kinase 3(GSK3)、Cyclin—dependent Kinase 5(cdk5)、DNA-dependent protein kinase(DNAPK)、Casein Kinase Ⅱ(CKII)、Casein Kinase I(CKI)、cell division cycle gene 2(cdc2)这10种蛋白激酶的结合位点。N-糖基化位点预测表明Unigene40238_All含有9个N-糖基化位点, Unigene5923_All、Unigene25760_All和Unigene45234_All这三个序列不含有N-糖基化位点, 其余序列含0~9个N-糖基化位点。O-糖基化位点预测表明Unigene39656_All序列所含O-糖基化位点最多23个, CL3978.Contig10_All和CL3978.Contig1_All这两条序列只有1个O-糖基化位点, 其余序列O-糖基化位点个数范围在1~23个。
表5 HSP70磷酸化位点预测

Tab. 5 Phosphorylation, N-Glycosylation and O-Glycosylation sites prediction of HSP70 protein

序号 基因号 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 N-糖基化位点 O-糖基化位点
SaHSP70-1 CL1233.Contig3_All 38 31 5 3 12
SaHSP70-2 CL1233.Contig2_All 37 29 5 2 10
SaHSP70-3 Unigene26028_All 56 33 7 8 21
SaHSP70-4 Unigene39656_All 42 27 8 3 23
SaHSP70-5 CL1233.Contig1_All 37 29 5 2 7
SaHSP70-6 Unigene40238_All 42 23 9 9 7
SaHSP70-7 Unigene35289_All 39 23 5 2 6
SaHSP70-8 Unigene25760_All 37 17 6 0 3
SaHSP70-9 CL1357.Contig5_All 32 27 3 4 20
SaHSP70-10 CL1357.Contig6_All 31 27 3 4 20
SaHSP70-11 CL1357.Contig10_All 30 26 3 4 13
SaHSP70-12 CL1357.Contig9_All 28 26 2 4 13
SaHSP70-13 CL1357.Contig4_All 30 23 3 4 14
SaHSP70-14 Unigene31979_All 25 28 6 6 7
SaHSP70-15 CL3978.Contig10_All 24 20 9 1 1
SaHSP70-16 Unigene1394_All 33 24 3 4 11
SaHSP70-17 CL3978.Contig3_All 23 21 7 1 3
SaHSP70-18 CL3978.Contig1_All 23 21 9 1 1
SaHSP70-19 CL3356.Contig1_All 24 27 7 5 2
SaHSP70-20 CL3356.Contig2_All 21 26 6 4 3
SaHSP70-21 CL3978.Contig2_All 23 22 7 1 2
SaHSP70-22 Unigene797_All 24 17 6 4 3
SaHSP70-23 CL3978.Contig6_All 24 20 5 1 6
SaHSP70-24 CL3978.Contig8_All 25 19 5 1 4
SaHSP70-25 Unigene40279_All 25 24 8 5 3
SaHSP70-26 Unigene35732_All 29 17 6 4 3
SaHSP70-27 Unigene45234_All 27 14 0 0 2
SaHSP70-28 Unigene5923_All 23 16 8 0 3

4 讨论

Hsp70在应对环境压力下缓冲石珊瑚白化有显著作用, 已有考虑纳入分子生物标志物系统以评估石珊瑚对环境变化耐受性的关键参数, 这可能是更好地了解珊瑚白化分子机制所必需的。尽管目前许多hsp70基因已经在石珊瑚中被鉴定和报道, 然而其家族特征和结构特征及潜在的活性特征仍远未得到充分了解, 鲜有相关国内外报道。
本研究短指软珊瑚HSP70家族成员全部以酸性形式存在, 均为亲水性蛋白, 大部分是稳定蛋白质, 分子量在61929.42~101494.21Da之间。Zhang等人(2018)报道从鹿角杯形珊瑚转录物组装鉴定到30个HSP70蛋白基因, 分子量大小从300~6000个碱基之间。在此基础上克隆鉴定了一个完整HSP70蛋白cDNA序列, 编码650个氨基酸, 分子量在为71930Da。
已报道的HSP70蛋白家族鉴定表明不同物种HSP70蛋白家族成员数目不同且差别大, 植物柳枝稷HSP70蛋白家族有41个成员(宋刚 等, 2022)、玉米大斑病菌HSP70蛋白家族成员鉴定出9个(张淑红 等, 2022)、小麦HSP70家族成员有21个(楚宗丽 等, 2022)。虽然HSP70蛋白家族成员数量不同, 但其HSP70蛋白的氨基酸数量、等电点、分子量等理化性质和亚细胞定位相较为相似(王荣青 等, 2014; 郝昕 等, 2022)。亚细胞定位结果显示软珊瑚HSP70蛋白主要分布在细胞核、细胞质中, 并且在线粒体、内质网上也有少量分布。据报道HSP70蛋白主要诱导型成员通常在应激期间和应激后立即在细胞核中发现, 并在恢复时转移到细胞质(Craig, 1989)。经信号肽预测表明28个HSP70蛋白成员中26个没有信号肽, 表明这些蛋白不属于分泌蛋白, 与其物种报道一致(罗洪林 等, 2015; 郝昕 等, 2022)。鹿角杯型珊瑚PdHSP70蛋白中信号肽的缺乏表明它可以在环境胁迫下通过溶酶体途径(非典型分泌途径)释放(Zhang et al, 2018)。PdHSP70蛋白不仅可以防止部分变性的蛋白质聚集, 并允许它们重新折叠, 从而保护珊瑚细胞免受热应激, 还可能在热白化过程中抑制珊瑚细胞凋亡(Zhang et al, 2018)。PvHSP70蛋白保护细胞不受热应激伤害(Poli et al, 2017), 而XmHSP70蛋白可修复受热应激轻微损伤的蛋白(López-Legentil et al, 2008)。
本研究基于蛋白序列的系统发育进化树及motif系统发育分析均可将软珊瑚HSP70蛋白家族分为5大类。在不同类中各成员分布是不均匀的, 表明不同成员之间存在着广泛的多样性。王荣青等(2014)报道系统发育关系揭示番茄和拟南芥HSP70蛋白家族成员可以分为4组。根据软珊瑚HSP70蛋白家族系统发育进化树HSP70与CiHSP70、AtHSP70、SmHSP70和EdHSP70高度同源, CiHSP70、AtHSP70、SmHSP70和EdHSP70有ATP结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣的作用, 推测软珊瑚HSP70蛋白家族有ATP结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣的作用。从HSP70中预测到了10条motif, 11个结构域, 可分为5个亚家族。同一亚家族成员motif组成和结构域高度相似, 具有高度保守性, 预测似乎在功能上也最相似(Craig, 1989)。HSP70蛋白含有HYOU1-like_NBD和HSPA4_ like_NDB结构域, 可能与heat shock protein 110 (HSP110)亚家族有关(张淑红 等, 2022)。
本研究HSP70蛋白质主要是由α-螺旋(35.36%~ 64.99%)和无规则卷曲构成(24.27%~39.11%), β-折叠含量较少(1.67%~8.66%), 结构比较稳定, 其二级结构和三级结构与其他生物HSP70相似。不同的HSP70蛋白α-螺旋和无规则卷曲的比例不同, 造成了蛋白质三维结构的差异。α-螺旋结构和β-折叠结构是蛋白质二级结构的重要组成部分, 氢键的断裂或新的氢键形成均会改变蛋白质二级结构相对含量。无规卷曲通过主链间的氢键或主链与侧链间的氢键稳定其构象, 是蛋白质结构中的基本构件。卷曲的柔性构象可使肽链改变走向, 利于连接结构相对刚性的α螺旋和β折叠, 在蛋白质肽链的卷曲、折叠过程中起重要作用。分子伴侣引导细胞蛋白质沿着生产性折叠、聚集和协助蛋白质易位, 在细胞应激时, 热激蛋白表达通常会增加, 作为一种防御机制来抵抗外界刺激对生物体造成的影响。HSP70蛋白由两个基本的结构域组成, 分别是45kDa的N-末端核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain, NBD)和C-末端底物结合域(substrate-binding domain, SBD) (Fernández-Fernández et al, 2018)。NBD结构可以结合和水解ATP, SBD折叠成β-sandwich三明治结构, 可与靶肽分子或者蛋白质结合。α-螺旋组成的盖子(lid)结构域, 作用是封住目标蛋白并阻止其释放(Tubiana et al, 2019)。有研究表明, 肽结合结构域的α-螺旋盖的打开和关闭与ATP结合和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)结合有关(Ahsen et al, 1997)。
在蛋白翻译后修饰(post-translational modifications, PTM)过程中, 分子伴侣磷酸化调节重要的细胞过程, 相关研究表明, 特定的磷酸化模式可以微调HSP70蛋白的活性(Nitika et al, 2017)。磷酸化可能是影响系统的折叠酶和解聚酶活性的一种方式, 残基磷酸化引起蛋白构象变化, 这对蛋白的功能至关重要(Velasco et al, 2019)。本研究预测到了短指软珊瑚的HSP70蛋白序列存在41~96个潜在磷酸化位点, 推测磷酸化在减少蛋白错误折叠和蛋白质降解中起到重要作用。蛋白质糖基化是最复杂的翻译后修饰(PTM)之一, 在蛋白质功能中起重要作用, 是一种共翻译修饰, 在内质网中转录后立即发生(Sørensen et al, 1995)。25个短指软珊瑚HSP70预测到N-糖基化位点, 位点个数范围在1~9。所有短指软珊瑚HSP70蛋白中均预测O-糖基化位点, 个数范围在1~23。

5 结论

本研究对经高温胁迫短指软珊瑚蛋白序列数据库分析鉴定出了28个HSP70蛋白家族成员, 均为酸性亲水蛋白, 大部分蛋白质结构较为稳定。亚细胞定位表明HSP70蛋白主要分布在珊瑚细胞核、细胞质中, 在线粒体、内质网上也有少量分布。信号肽预测表明, 28个HSP70蛋白成员中26个没有信号肽, 大部分不属于分泌蛋白, 不存在跨膜结构。根据HSP70蛋白家族系统发育进化树推测其起到与三磷酸腺苷(association of tennis professionals, ATP)结合和ATP依赖性蛋白折叠伴侣作用。系统进化树结果表明短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员聚成5大类。短指软珊瑚HSP70蛋白家族结构和保守基序分析中预测到了10条motif分为5个亚族。短指软珊瑚HSP70蛋白家族二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主, α-螺旋的含量占比大。28个HSP70家族蛋白中有25个预测到了N-糖基化位点, 且位点个数在1~9范围内。28个HSP70家族蛋白均预测到磷酸化位点和O-糖基化位点, 总个数分别在41~96和1~23范围内。本研究HSP70蛋白家族结果为今后珊瑚在应对全球升温胁迫中的适应机制等方面研究奠定了基础。

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