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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 6: 170 - 180

DOI: https://doi.org/10.11978/2023183

Marine Biology

Diversity of culturable bacteria in the sedimentary sands of the Meiji Reef

  • JIANG Rouyun , 1, 2, 3 ,
  • JIAN Lili 1, 2, 3 ,
  • SHI Songbiao 1, 2, 3 ,
  • TIAN Xinpeng , 1, 2
Expand
  • 1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Marine Environmental Monitoring Center, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China
  • 2. Guangdong Provincial Observation and Research Station for Coastal Upwelling Ecosystem, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shantou 515041, China
  • 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
TIAN Xinpeng. email:

Editor: LIN Qiang

Received date: 2023-12-05

  Revised date: 2024-02-21

  Online published: 2024-02-26

Supported by

Hainan Provincial Natural Science Foundation of China(321CXTD447)

National Natural Science Foundation of China(32170018)

Science and Technology Planning Project of Guangdong Province of China(2021B1212050023)

Fold

Abstract

The special environment of reefs in the South China Sea has created a rich and colorful microbial world, where a large number of microorganisms are yet to be excavated and utilized. Due to geographical conditions and other factors, there are few studies on them. In this paper, culturable microorganisms were selectively isolated from the sedimentary sands of the Meiji Reef by using oligotrophic media combined with high salt and high temperature conditions. And their diversity and distribution were also studied, a variety of functional media were used to explore the functions of these microorganisms. The 674 isolates belong to 5 phyla, 6 classes, 26 orders, 38 families, 62 genera, 146 species, respectively, and 42 potential new species with less than 98.65% similarity composes around 28.7% all of them. Among the cultured bacteria obtained, the Phyla of Actinobacteriota and Pseudomonadota are the most abundant, accounting for 61.6% of the total isolated strains. Functional analysis revealed that 2 species have the phospho-reducing activity, 36 species have the urease-producing activity and 57 species have the iron-bearing activity. The research results indicate that there are microbial abundance, much new species resources and high diversity of microorganism with special ecology functions in the reef environment. In study, these accumulates rich microbial species resources, laying the foundation for the deeply exploration of microbial resources utilization and the ecological restoration of the coral-sands ecosystem in the Meiji Reef.

Key words： coral sand on islands and reefs; oligotrophic medium; high temperature and salinity; culturable bacterial; functional diversity

Cite this article

JIANG Rouyun , JIAN Lili , SHI Songbiao , TIAN Xinpeng . Diversity of culturable bacteria in the sedimentary sands of the Meiji Reef[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(6) : 170 -180 . DOI: 10.11978/2023183

在远海的岛礁环境, 微生物是消费者也是生产者, 时刻驱动着岛礁生态系统的营养循环和能量流动(Dinsdale et al, 2008), 因此岛礁微生物群落对岛礁生态系统的稳定和健康起着重要作用(Peixoto et al, 2017)。但由于地理位置的限制以及岛礁环境的特殊性和样品稀缺性, 对岛礁陆域环境微生物的研究较少, 严重限制了对其资源储备和生态功能方面更全面、更深入的认知。
宏基因组为微生物多样性研究提供了极大的便利(Hug et al, 2016), 同时发现大量未归类的bins新类群, 极大地扩宽了人们对未培养微生物的认知, 但bins新类群的生理生化特征、营养代谢过程以及宏基因组预测的功能基因等仍需要获得纯培养菌株才能确证(朱红惠 等, 2021)。前期研究中, Angly等(2016)对大堡礁的微生物进行高通量测序, 发现假单胞菌门是该环境的最优势类群。Qin等(2021)对南海外礁坡和潟湖中的珊瑚微生物组进行研究, 发现免培养获得的4个门级类群为拟杆菌门、奇异球菌门、芽孢杆菌门和假单胞菌门, 其中假单胞菌门比例最高。李存 等(2022)运用寡营养培养基添加微量元素分离珊瑚岛礁水下沉积物样品, 获得芽孢杆菌门、假单胞菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌, 其中放线菌门细菌多样性很高。韩敏敏 等(2020)运用6种基础培养基分离岛礁样品, 获得多样性很丰富的微生物物种, 部分微生物还具有延缓衰老等功能。Liu等(2023)结合样品原始环境温度、盐度等条件, 通过连续稀释2216E培养基分离获得了罕见且代谢丰富的α变形菌。何媛秋 等(2020)研究发现, 稀释10倍或20倍的寡营养培养基更有利于稀有细菌类群的分离培养。
为获得更丰富的微生物, 本研究运用寡营养培养基结合高温和高盐条件对沉积砂样品进行纯培养微生物分离, 并进行可培养微生物的多样性分析、不同条件下不同培养基的微生物多样性分析、不同条件下不同样品的微生物多样性分析、潜在新种多样性分析、物种功能分析, 初步探究南沙海域美济礁陆域珊瑚沉积砂微生物多样性及其开发潜力, 并为系统的岛礁陆域珊瑚砂贫瘠环境生态学修复和健康发育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 岛礁样品

本次试验采集5个南海美济礁陆域砂样品, 编号为MJ16—MJ20, 均为填礁后陆域环境样品。样品长期露出水面且不受潮汐影响, 用无菌采样勺挖取岛礁砂质土表层(0~1cm)及其下3cm左右的砂样500g, 装入无菌样品保藏袋, 其中MJ16、MJ17、MJ20为表层样品, MJ17、MJ18为非表层样品。放于-20℃保藏备用。

1.1.2 分离条件

实验采用3组条件: 四种分离培养基(R2A、2216E、SN和R, 见表1)分别采用28℃和50℃两个温度梯度进行培养(28℃为该环境常见温度, 50℃为高温天气地表温度), 同时对四种培养基分别加150‰ NaCl配制高盐培养基, 并于28℃进行分离培养。
表1 培养基类型及其组成成分

Tab. 1 Typic media and their components used in this study

培养基 成分
R2A 胰蛋白胨0.25g, 可溶性淀粉0.5g, 酵母浸粉0.5g, K2HPO4 0.3g, MgSO4 0.1g, 丙酮酸钠0.3g, 蛋白胨0.25g, 葡萄糖0.5g, 酸水解酪蛋白0.5g, 稀释20倍, 琼脂15g, 水1L
2216E 酵母浸粉1.0g, 柠檬酸铁0.1g, NaCl 19.45g, MgCl2 5.98g, Na2SO4 3.24g, CaCl2 1.8g, KCl 0.55g, Na2CO3 0.16g, KBr 0.08g, SrCl2 0.034g, H3BO3 0.022g, Na2O·SiO2 0.004g, NaF 0.002 4g, NH4NO3 0.001 6g, Na2HPO4 0.008g, 蛋白胨5.0g, 稀释20倍, 琼脂15g, 水1L
SN NaNO3 0.75g, K2HPO4 0.015 9g, EDTA二钠0.005 6g, Na2CO3 0.010 4g, VitaminB12 0.001g(过滤除菌), 1×10-6微量盐(乙酸6.25g, 柠檬酸铁铵6.0g, Na2MoO4·2H2O 0.39g, MnCl2·4H2O 1.4g, Co(NO3)2·6H2O 0.025g, ZnSO3·7H2O 0.222g, 单独灭菌), 琼脂15g, 海水500mL, 水500mL
R NaCl 25g, MgSO4·7H2O 9g, CaCl2·2H2O 0.14g, KCl 0.7g, Na2HPO4·12H2O 0.25g, Na2-EDTA 30mg, H3BO3 34mg, FeSO4·7H2O 10mg, FeCl3·6H2O 1.452mg, MnCl2·4H2O 4.32mg, CoCl2·6H2O 0.12mg, Na2MoO·2H2O 0.63mg, RbCl 0.141 5mg, LiCl 0.61mg, NaBr 6.4mg KI 0.006 55mg, SrCl2·6H2O 3.04mg, V2O5 0.001 785mg, ZnCl2 0.312mg, RPMI 500mg, EagleMedium 500mg, L-glutamine 15mg, NaHCO3 100mg, 海盐18g, 琼脂15g, 水1L
无机磷固体 MnSO4·4H2O 0.03g, (NH4)2SO4 0.5g, NaCl 0.3g, MgSO4·7H2O 0.3g, KCl 0.3g, FeSO4·4H2O 0.036g, 葡萄糖10g, 有机磷植酸钙2.0g [或无机磷Ca3(PO4)210g], 水1L, 琼脂15g, pH 7.0
亚历山大硅酸盐 蔗糖5g, Na2HPO4 2g, FeCl3 0.005g, CaSO4 0.1g, MgSO4·7H2O 0.5g琼脂15g, 水1L, pH 7.0~7.5
DF KH2PO4 4g, MgSO4·7H2O 0.2g, 葡萄糖2g, 葡萄糖酸2g, 柠檬酸2g, Na2HPO4 6g, H3BO3 0.01mg, MgSO4 0.011 2mg, ZnSO4
0.124 6 mg, CuSO4 0.078 2mg, MoO3 0.01mg, 水1L, 琼脂15g, pH 7.0
ADF KH2PO4 4g, Na2HPO4 6g, (NH4)2SO4 2g, MgSO4·7H2O 0.2g, 葡萄糖2g, 葡萄糖酸2g, 柠檬酸2g, H3BO3 0.01mg, MgSO4
0.011 2 mg, ZnSO4 0.124 6 mg, MoO3 0.01mg, 1-氨基羰酰-1-环丙烷羧酸(ACC)5mmol/L, FeSO4·7H2O 0.1mg, CuSO4 0.078 2mg, 水1L, 琼脂15g, pH 7.0
CAS CAS 0.605g, Na2HPO4·12H2O 1.213 5g, HDTMA 0.0729g, NaH2PO4·2H2O 0.295 25g, FeCl3·6H2O 0.000 3g, NHCl4 0.125g, KH2PO4 0.037 5g, NaCl 0.625g, 琼脂9g, 水1L, pH 6.7~6.9
产脲酶 蛋白胨1g, NaCl l5g, KH2PO4 2g, 葡萄糖1g, 酚红0.012g, 琼脂15g, 水1L, pH 7.0
三丁酸甘油酯 三丁酸甘油酯40mL,阿拉伯树胶4g, 琼脂15g, 水1L, pH 7.0

1.1.3 分离培养基

多样性实验采用4种寡营养培养基, 即5% 2216E固体培养基、5% R2A固体培养基、SN固体培养基、R固体培养基。
功能性实验采用7种常见的土壤微生物功能验证培养基, 包括无机磷固体培养基(解磷功能)、亚历山大硅酸盐培养基(解钾功能)、DF培养基和ADF培养基(产ACC脱氨酶)、CAS培养基(产铁载体)、产脲酶培养基(产尿酶)、三丁酸甘油酯培养基(降解微塑料)。培养基的类型及其成分如表1所示。

1.1.4 实验试剂与仪器

细菌16S rRNA基因扩增采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增, 测序由广州天一辉远测序公司完成。10%Chelex100试剂(4g Chelex100 Resin(Bio-rad, USA)溶解于40mL灭菌超纯水), TaqDNA聚合酶(北京全式金), PCR仪(Eppendorf, German), 凝胶成像系统(Bio-rad, USA), 小型台式高速离心机和恒温箱(ESCO, Singapore)。

1.2 菌株的分离、纯化与保藏

称取0.5g岛礁砂样品, 加入无菌海水稀释至10mL, 涡旋震荡器震荡5min混匀, 取100μL样品混合浑浊液至平板上, 用涂布棒涂布均匀至表面吸收完全, 每份样品设置三个重复平板。将平板置于28°C恒温箱中倒置培养, 4周后挑取平板中全部的单菌落到MA固体培养基上三线法划线纯化, 纯菌使用30%的甘油冻存管保藏于-80℃备用。

1.3 16S rRNA基因扩增测序分析

用树脂法(Walsh et al, 1991)提取细菌总DNA, 用27F和1492R作为引物扩增16S rRNA基因后进行琼脂糖凝胶电泳检测, 扩增产物送至广州天一辉远测序公司进行双端基因测序。采用SeqMan5.0软件对测序结果进行拼接, 将获得的有效序列在EzBioCloud (Yoon et al, 2017)和NCBI的BLAST数据库上进行比对和数据分析, 物种和潜在新种的判定依据为Yarza等(2014)建议的16S rRNA基因序列相似度98.65%的标准。

1.4 系统发育进化分析

用CLUSTAL_W软件将有效序列及其相似有效种的16S rRNA基因序列进行多序列比对, 再通过MEGA-X(Kumar et al, 2018)软件进行聚类分析, 采用Kimura2-parameter模型估算系统进化矩阵和邻接法建系统发育树(neighbor-joining, N-J)(Saitou et al, 1987), 在bootstrap 值1 000次构建结果中取最优, 最后在iTOL(Letunic et al, 2019)上展现。

1.5 多样性分析

统计5份岛礁样品中获得的微生物丰富度和丰度, 分析在不同条件下不同培养基和不同样品中可培养细菌的多样性, 以及分离获得的潜在新种的多样性情况。

1.6 功能分析

将去重复后的代表物种分别点接于功能培养基上, 30℃培养2~4d, 观察无机磷固体培养基(王效昌 等, 2023)、亚历山大硅酸盐培养基(邱路凡, 2023)、三丁酸甘油酯培养基(Molitor et al, 2020)有无透明圈, 透明圈越大说明解磷、解钾、微塑料降解功能越强; 观察DF和ADF固体培养基上相同物种的生长情况, ADF培养基生长偏好则物种可产ACC脱氨酶(柳鑫鹏 等, 2022); CAS培养基由蓝色变为黄色或橙红色, 或产生黄色圆环, 黄色范围越大说明产铁载体能力越强(Kramer et al, 2020); 产脲酶培养基由黄色变为玫红色为阳性, 玫红色越深, 范围越大, 说明产脲酶能力越强(刘津江 等, 2022)。4d后统计功能培养基阳性结果, 使用iTOL在线网站对物种进行可视化。

2 结果分析

2.1 可培养细菌多样性

本研究利用180个分离平板分离获得的674株细菌, 16S rRNA基因序列分析发现它们与目前已知的146个种亲缘关系相近, 隶属于5门、6纲、26目、38科、62属的146种。假单胞菌门(Pseudomonadota)菌株有267株, 占所有分离菌株的39%, 为优势菌门; 另外, 奇异球菌门(Deinococcus, 0.1%)1株、拟杆菌门(Bacteroidota, 0.2%)2株, 为稀有菌门。从获得的物种数量来看, 假单胞菌门获得的物种最多, 共57个种, 其中α-变形菌纲54个种, 分属于15个科中的19个属, 另外的3个物种属于γ-变形菌纲, 分布于2个目, 2个科, 2个属即溶杆菌属(Lysobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)。放线菌门获得40个物种, 分布于10个目, 12个科的13个属, 其中链霉菌属(Streptomyces)的物种最多, 共有10种, 其他优势属分别为, 类诺卡氏菌属(Nocardioides)6种, 分枝杆菌属(Mycobacterium)3种, Aquipuribacter属3种。图1直观展现出假单胞菌门在纲、目、科水平上的多样性都比较高, 而获得的放线菌大部分为链霉菌, 约占总放线菌的三分之二, 芽孢杆菌门的细菌全部来自于芽孢杆菌科, 拟杆菌门和奇异球菌门获得的细菌最少, 推测其在环境中的丰度较低且属于难培养细菌, 普通的实验室培养环境不适合其生长, 添加微量元素可以提高其分离获得的可能性(李存 等, 2022)。图2展示62个不同属水平下细菌类群比例, 其中对丰度前15的属进行了标注。
图1 纯培养菌株在不同分类等级的分布情况

Bacteria: 细菌域; Actinomycetota: 放线菌门; Pseudomonadata: 变形菌菌门; Bacillota: 芽孢杆菌门; Alphaproteobacteria: α-变形菌纲; Gammaproteobacteria: γ-变形菌纲; Actinomycetia: 放线菌纲; Bacilli: 芽孢杆菌纲; Rhizobiales: 根瘤菌目; Mycobacteriales: 核菌目; Streptomycetales: 链霉菌目; Propionibacteriales: 丙酸菌目; Sphingomonadales: 鞘氨醇单胞菌目; Streptosporangiaceae: 链孢菌科; Nocardiaceae: 诺卡菌科; Devosiaceae: 德沃斯菌科; Erythrobacteraceae: 动孢红杆菌科; Nocardioidaceae: 类诺卡菌科; 链霉菌科Streptomycetaceae; Sphingomonadaceae: 鞘氨醇单胞菌科; Acuticoccaceae: 锐球菌科

Fig. 1 The distribution of pure culture strains in different taxonomic clades

图2 62个不同属水平下丰度前15的属细菌类群比例

Fig. 2 Proportion of the top 15 genera in abundance at 62 different genus clades

2.2 不同条件下5个样品分离到的可培养细菌多样性比较

从获得物种数量来讲, 表层样品MJ16、MJ17和MJ20获得的微生物总量相差不大, 分别为54、57和53种, 而且这三个样品之间的共同微生物有8种, MJ16和MJ17有7种, MJ16和MJ20有6种, MJ17和MJ20有6种。MJ16、MJ17、MJ20的特有种分别有18、23、24种。非表层样品MJ18和MJ19分离获得的微生物种类较为单一, 而且大部分都与表层分离获得的微生物一致。MJ18共获得14个物种, 4个特有种分别是假单胞菌门的Brevundimonas fluminis、Devosia indica和Mesorhizobium carmichaelinearum以及放线菌门的Nocardioides marinus。MJ19分离总获得18个物种, 特有种是假单胞菌门的Lutibaculum pontilimi和芽孢杆菌门的Virgibacillus kapii。通过寡营养培养基从样品MJ16—MJ20分别获得36、40、11、12、41种细菌, 其物种数和菌株数均优于其他培养条件, 且在该条件下样品获得的特有种数量几乎等于该样品在三种条件下的特有物种数量, 表明寡营养条件更适合岛礁沉积砂的分离培养(图3)。高温和高盐条件对获取纯培养微生物具有重要影响, 但各样品在相同条件下差异不显著(表2)。Ouillon等(2010)的研究表明无论是厄尔尼诺现象还是拉尼娜现象都会影响潟湖岛礁内的海水盐度和温度发生显著变化, 但盐度的变化更为剧烈, 岛礁陆域环境由于太阳暴晒而使珊瑚砂环境盐度增加, 因此推测岛礁陆域环境选择了耐盐微生物应对盐度的变化。而高温条件下所有样品的纯培养物种出菌率较低, 只有1种放线菌和7种芽孢杆菌(表3); 高盐条件下特有物种较多的是MJ16、MJ17和MJ20, 并且这三个样品间的共有物种较多(图4)。综上, 显示该小范围内的微生物种类较为相似, 但表层与非表层沉积砂的微生物具有显著性差异。
图3 寡营养条件下5个样品获得的可培养物种多样性

Fig. 3 Diversity of culturable species obtained from 5 samples under the oligotrophic condition

表2 不同条件下5个样品获得的微生物多样性情况

Tab. 2 Microbial diversity obtained from 5 samples under different conditions

条件 样品 门 纲 目 科 属 种 株
总条件 MJ16 3 4 14 20 30 54 178
MJ17 5 6 15 24 35 57 157
MJ18 3 4 6 7 9 14 56
MJ19 3 4 5 7 12 18 50
MJ20 4 5 16 19 29 53 233
寡营养 MJ16 3 4 11 16 26 36 103
MJ17 5 6 14 20 27 40 100
MJ18 3 4 6 7 8 11 33
MJ19 3 3 4 6 10 12 27
MJ20 4 5 14 17 26 41 159
高盐(150‰ NaCl) MJ16 3 3 10 14 20 31 73
MJ17 3 3 8 11 15 26 51
MJ18 3 4 4 4 5 6 8
MJ19 3 3 3 3 4 6 7
MJ20 3 4 12 13 17 24 60
高温(50℃) MJ16 2 2 2 2 2 2 2
MJ17 1 1 1 1 1 2 6
MJ18 1 1 1 1 1 3 15
MJ19 1 1 1 1 1 3 16
MJ20 2 2 2 2 3 3 14

表3 高温条件下5个样品获得的物种情况

Tab. 3 Strains obtained from 5 samples under the high temperature condition
样品 纲 种或亚种
MJ16 芽孢杆菌纲Bacilli Cytobacillus pseudoceanisediminis
放线菌纲Actinomycetes Streptomyces radiopugnans
MJ17 芽孢杆菌纲Bacilli Bacillus altitudinis、Bacillus tequilensis
MJ18 芽孢杆菌纲Bacilli Bacillus altitudinis、Bacillus xiamenensis、Bacillus tequilensis
MJ19 芽孢杆菌纲Bacilli Bacillus altitudinis、Bacillus xiamenensis、Bacillus tequilensis、Bacillus safensis subsp. safensis
MJ20 芽孢杆菌纲Bacilli Fredinandcohnia onubensis、Paenibacillus cisolokensis
放线菌纲Actinomycetes Streptomyces radiopugnans
图4 高盐条件下5个样品获得的物种分布情况

上部分柱形图表示特有或共有物种数量; 下部分实心点代表对应样品的特有物种数量, 实心点连线代表实心点对应样品间的共有物种; 左下部分柱形图表示物种数量

Fig. 4 Distribution of bacterial species obtained from 5 samples under the high salt condition

2.3 不同条件下4种寡营养培养基获得的可培养细菌多样性比较

SN、5% 2216E、R、5% R2A三种条件下获得的总物种数分别是73、63、62和53, 特有物种数分别为20、16、14和13, 共有种17个。R和5% 2216E培养基中假单胞菌门物种的丰富度最高, 最优势纲为α-变形菌纲; SN和5% R2A培养基中放线菌门物种的丰富度最高, 并且放线菌纲为最优势纲。在SN和5% 2216E培养基中都获得了1种Cytophagia纲细菌, 在R培养基中还获得了1种Deinococci纲细菌。寡营养条件下4种培养基获得的物种多样性和分离率都是较高的, 并且能维持一定比例的共同微生物, 又保持培养基特异性, 显示出较好的分离效果(图5); 放线菌纲、α-变形菌纲、芽孢杆菌纲和γ-变形菌纲是该条件四种培养基的共有类群。增加高温和高盐条件后, 4种培养基获得的物种多样性和丰度都显著降低, 并且高温对出菌率的影响更为显著。高盐条件对R2A培养基获得的物种的影响最大, 由于R2A培养基成分中盐含量非常低, 寡营养条件下R2A培养基获得的较丰富物种在增加150‰ NaCl后绝大部分被抑制, 只有放线菌门的Streptomyces radiopugnans、假单胞菌门的Brevundimonas variabilis以及芽孢杆菌门的Bacillus cereus、Bacillus aequororis、Metabacillus schmidteae可以同时在两种条件下获得。高温条件对R2A分离效果影响剧烈, 只有2种细菌存活(表4、5)。R培养基受高盐和高温条件影响较小, 高盐和高盐条件下有5个共有物种(芽孢杆菌门的Bacillus altitudinis、Bacillus aequororis、Bacillus tequilensis、Halobacillus dabanensis和放线菌门的Streptomyces radiopugnans), 有6个与寡营养条件共有物种(放线菌门的Streptomyces radiopugnans、芽孢杆菌门的Bacillus salacetis、Bacillus mesophilus和假单胞菌门的Phenylobacterium terrae、Propylenella binzhouense、Microvirga flocculans), 并获得13个特有物种(图6); 在高温条件下获得最多的物种12个(表4、5)。高盐条件对2216E、SN的影响程度相似, 可能由于这两种培养基都含有复合盐离子, 可以较好地缓冲钠盐浓度的变化。
图5 寡营养条件下4种培养基获得可培养物种的数量和分布

Fig. 5 Distribution of culturable species obtained by four selective media under oligotrophic condition

图6 高盐(150‰ NaCl)条件下4种培养基获得的物种分布情况

Fig. 6 Distribution of species obtained from four selective media under 150‰ NaCl high salt condition

表4 不同分离培养基获得的微生物多样性情况

Tab. 4 Microbial diversity obtained from the isolation media under different conditions

条件 样品 门 纲 目 科 属 种 株
总条件 2216E 3 4 16 26 36 63 180
R2A 3 4 15 21 30 53 139
R 4 5 16 25 35 62 152
SN 4 5 15 27 44 73 203
寡营养 2216E 3 4 13 19 28 43 118
R2A 3 4 15 20 27 45 115
R 4 5 13 20 28 40 91
SN 3 4 12 19 30 43 104
高盐(150‰ NaCl) 2216E 3 4 8 13 18 27 47
R2A 3 3 5 6 10 13 19
R 3 3 8 13 18 24 47
SN 4 5 10 15 20 32 73
高温(50℃) 2216E 3 3 4 5 6 6 15
R2A 2 2 2 2 2 2 5
R 3 4 5 6 11 12 14
SN 3 5 5 5 6 9 26
表5 高温条件下4种培养基获得的物种情况

Tab. 5 Species obtained by four selective media with the high temperature culture condition

培养基 纲 种
5% 2216E Actinomycetia Streptomyces radiopugnans
Alphaproteobacteria Acuticoccus kandeliae、Metabacillus endolithicus
Bacilli Bacillus altitudinis、Bacillus tequilensis、Cytobacillus pseudoceanisediminis
5% R2A Alphaproteobacteria Acuticoccus kandeliae
Actinomycetia Streptomyces radiopugnans
R Actinomycetia Streptomyces chumphonensis、Streptomyces genisteinicus、Streptomyces radiopugnans
Alphaproteobacteria Microvirga flocculans、Pararhizobium herbae
Bacilli Bacillus altitudinis、Bacillus aequororis、Bacillus tequilensis、Halobacillus dabanensis、Metabacillus halosaccharovorans、Virgibacillus kapii、Mesobacillus boroniphilus
SN Actinomycetia Streptomyces chumphonensis、Streptomyces ginkgonis、Streptomyces wuyuanensis
Alphaproteobacteria Celeribacter ethanolicus、Lysobacter korlensis、Glycocaulis abyssi、Phenylobacterium terrae
Bacilli Bacillus mesophilus
Gammaproteobacteria Luteimonas pelagia

2.4 潜在新物种信息

基于不同物种间16S rRNA基因序列相似度小于98.65%(Yarza et al, 2014)统计得到164株潜在新种菌株, 它们与已知物种相似性在94.87%~98.65%, 其中相似性在94.87%~95.0%的有2株, 95.0%~97.0%的有34株, 97.0%~98.65%的有128株, 去重复后为42个潜在新种。图7为潜在新种与最相近物种的系统发育树, 其中30个潜在新分类单元属于变形菌纲, 5个属于放线菌纲, 5个属于芽孢杆菌纲, 1个属于Cytophagia纲, 1个属于Deinococci纲。变形菌纲的新物种, 其中有26个相似性97%~98.65%, 3个在95.0%~97.0%, 一个在94.87%~95.0%; 这些新物种分布于德沃斯氏菌属(Devosia)、玫瑰单孢菌属(Roseomonas)和交替赤杆菌属(Altererythrobacter)等18个属中。放线菌纲5个新物种中有2个相似性97%~98.65%, 3个相似性95.0%~97.0%, 分布于Aquipuribacter属、链霉菌属(Streptomyces)和诺卡氏菌属(Nocardia)。拟杆菌门获得海洋杆菌属(Pontibacter)的1个新种。奇异球菌门获得Truepera属的1个新种, 目前该属只有一个有效物种Truepera radiovictrix。分析潜在新种的分离培养基发现R培养基获得的新种最少(4种), SN培养基9种和5%2216培养基14种, 5% R2A培养基最多, 共 15种。分析潜在新种的分离条件发现在寡营养条件下获得最多潜在新种(22种), 而高温条件和高盐条件分别获得14种和6种。
图7 不同培养基获得的潜在新种的系统发育树

Fig. 7 Phylogenetic tree of potential new species obtained by different media

2.5 微生物功能多样性

功能筛选结果发现, 芽孢杆菌门的Bacillus pinisoli、Bacillus xiamenensis在解磷培养基上透明圈明显, 显示出较好的解磷功能。磷是植物生长的重要营养元素, 这些解磷功能物种通过分泌物将环境中难溶的磷转化为能被植物吸收的有效磷, 有利于岛礁生态恢复。
铁是植物生长和发育不可或缺的微量营养元素之一, 产铁载体具有向环境中提供铁元素的功能, 可以促进植物生长, 特别对贫瘠土壤生态恢复特别重要。在产铁载体功能筛选中发现57个具有较好产铁载体能力的物种。这些物种分布于放线菌门9科11属13种、假单胞菌门13科19属23种和γ-变形菌纲2科2属2种、芽孢杆菌门2科12属17种, 以及拟杆菌门的Pontibacter odishensis和奇异球菌门的Truepera radiovictrix。
通过产脲酶功能筛选发现产脲酶阳性物种36个, 其中30种具有强活性将平板从黄色变成深玫红色, 6 种呈浅玫红色。阳性物种分布于放线菌门7目7科13属12种、假单胞菌门4目7科8属13种、芽孢杆菌门2科3属9种, 以及拟杆菌门的Pontibacter odishensis和奇异球菌门的Truepera radiovictrix。产脲酶的微生物能够分解环境中的脲化合物, 从而提供植物所需的氨基氮, 也可以通过固氮作用产生尿素, 提高土壤的肥力, 因此在荒漠化环境治理中起着非常重要的先锋物种作用。
本次功能筛选共用了132种细菌(有14种没有生长), 图8展示的是每种菌对应的结果, 从内到外分别是微塑料降解、产ACC脱氢酶、解钾、产脲酶、产铁载体、解磷功能结果, 蓝色到绿色表示阳性结果增强。这些物种有51种没有显示出阳性结果, 其余大部分具有产脲酶或产铁载体能力, 其中有25种细菌同时具有产铁载体和产脲酶能力, 值得注意的是这些物种主要从高盐培养基分离获得, 这是否是土壤修复物种资源发掘的一个有效方式, 值得深入探讨。另外, 虽然高温条件下筛选到修复功能物种只有Bacillus xiamenensis, 但是这个物种同时具有产脲酶、产铁载体和解磷三种功能, 显示出较大的应用潜力。上述具有土壤修复功能的物种可以为岛礁环境提供铁、氮、磷等重要生命元素, 在远海岛礁贫瘠的珊瑚砂质土壤生态恢复中发挥关键作用。
图8 不同功能可培养微生物的系统发育树

Fig. 8 Phylogenetic trees of culturable microorganisms with different functions

3 讨论与结论

为探究岛礁环境中微生物的多样性, 依据该环境的寡营养特征以及温度、盐度变化范围广的特点, 设计寡营养培养基并模拟高温和高盐条件选择性分离该环境中自然生长存在微生物类群。本研究共分离获得细菌域5门6纲26目38科62属146种微生物, 在纯培养微生物门级类群上不但获得最普遍获得的芽孢杆菌门和假单胞菌门还获得拟杆菌门, 并且获得了免培养分析没获得的放线菌门和纯培养分析没获得的奇异球菌门(图1、2), 远超国内其他相关研究(韩敏敏 等, 2020; Qin et al, 2021; 李存 等, 2022)。这个结果表明在培养基组分和培养条件上模拟环境可能获得更全面的微生物, 后期可以增加如光照辐射、pH变化等环境因子进行更加全面的纯培养微生物资源研究工作。
从三种主要分离条件上看, 本研究采集的5个样品在寡营养条件下获得较高的微生物多样性, 并且表层比次表层高, 但高盐条件和高温条件对环境中可培养微生物物种丰度和丰富度影响显著, 且高温的影响略大(表2)。高盐胁迫会降低假单胞菌门、芽孢杆菌门和放线菌门等关键类群的相对丰度和功能活性, 这与Yang等(2022)的研究结果相似。高温条件下芽孢杆菌科微生物的生物膜更能适应高温, 获得的微生物几乎都属于芽孢杆菌科, 并且还获得一种耐高温耐高盐的放线菌, 这与Yin等(2019)的结论吻合。
本研究通过4种寡营养培养基中获得的物种数量较为均匀, 培养基之间相同的微生物较多, 但每种培养基保留有30%左右的物种特异性, 显示出较好的分离效果(表4)。4种培养基的配方成分复杂, 但含量均较低, 这与海洋环境中的营养成分多样但营养含量低的特点相似, 或许是分离效果较好的原因。另外实验结果显示出高温和高盐条件对寡营养培养基5% R2A的分菌结果影响较大, 而温度和盐度对R培养基的分菌结果影响不大。多元素寡营养培养基更容易获得海洋环境样品中的微生物, 这与何媛秋 等(2020)的结果相似。
从该环境可培养微生物的种群结构看, 假单胞菌门是最优势类群, 不仅物种多样性丰富, 其潜在的新种也非常多。其次是放线菌门, 其物种水平的多样性也较高, 特别是个别物种如Streptomyces radiopugnans优势明显。拟杆菌门和奇异球菌门获得的物种较少, 但均是难培养的物种且其中绝大部分为潜在新种(图1—7)。本研究获得的潜在新种广泛分布在5个门, 其中假单胞菌门的潜在新种最多。本研究显示, 利用与环境条件相似的培养基更能得到常规培养基和常规培养条件不曾获得的稀有微生物资源。
从功能筛选结果看, 在所有物种中具有产铁载体和产脲酶功能的物种最多, 其中有25种同时具有两种功能, 有14种只从高盐或高温环境获得, 显示出高盐条件有利于纯培养方式筛选土壤修复功能微生物(图8)。本实验没有发现解钾、产IAA、产ACC脱氢酶、降解微塑料功能的阳性物种, 究竟是获得的物种样本较少, 还是环境中本身这类功能物种的资源稀缺, 是一个非常值得探讨的问题, 在后期开展岛礁珊瑚砂土壤生态恢复治理时应引起重视。
高盐、高温和寡营养条件是南海岛礁陆域环境的典型特征, 深刻影响岛礁微生物的群落分布、多样性、丰富度和功能多样性。因此, 研究寡营养结合高温、高盐条件下岛礁微生物群落结构及多样性, 不仅能够更全面地认知该典型环境微生物的群落结构和生态功能, 还能积累宝贵的修复功能物种资源, 为后期深入开展岛礁珊瑚砂生态环境修复提供支持。

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