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Journal of Tropical Oceanography >

2024 , Vol. 43 >Issue 2: 34 - 47

DOI: https://doi.org/10.11978/2023085

Taxonomic study of four species of Gracilaria (Gracilariaceae, Rhodophyta) in Zhanjiang based on morphological and molecular data

  • LI Nenghui , 1, 2, 3 ,
  • HUANG Qing 1 ,
  • LI Hang 1 ,
  • ZENG Jun 1 ,
  • WU Kefeng 2, 3 ,
  • TAN Huaqiang , 1
Expand
  • 1. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhanjiang), Zhanjiang 524002, China
  • 2. Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China
  • 3. Marine Biomedical Research Institution, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China
TAN Huaqiang. email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2023-06-26

  Revised date: 2023-09-03

  Online published: 2024-03-26

Supported by

Project of Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhanjiang)(ZJW-2022-06)

Special Science and Technology Innovation Project of Guangdong Province, China(2022A01207)

Ph.D. Start-up Fund of Guangdong Medical University, China(GDMUB2022025)

Discipline Construction Project of Guangdong Medical University, China(4SG23009G)

Fold

Abstract

According to the molecular and morphological analysis, the species of Gracilariaceae was studied using the samples collected from Zhanjiang, Guangdong province, China. Four Gracilariaceae species were identified, namely: Gracilaria tenuistipitata, G. firma, G. edulis and Gracilariopsis bailinae. Their taxonomic characters and phylogenetic relationships were discussed in detail. This is combined with data from the literature to clarify that G. tenuistipitata, G. tenuistipitata var. liui and G. longirostris are the same species, and G. firma and G. changii are the same species. This study revised the taxonomic information of Gracilariaceae species in the coastal waters of southern China, and also provided a taxonomic basis for the conservation and development of macroalgae resources in Zhanjiang sea area.

Key words： Zhanjiang sea area; morphology; Gracilaria; phylogenetic analysis

Cite this article

LI Nenghui , HUANG Qing , LI Hang , ZENG Jun , WU Kefeng , TAN Huaqiang . Taxonomic study of four species of Gracilaria (Gracilariaceae, Rhodophyta) in Zhanjiang based on morphological and molecular data[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2024 , 43(2) : 34 -47 . DOI: 10.11978/2023085

江蓠科隶属于红藻门、真红藻纲、杉藻目, 为暖水性藻类, 广泛地分布在全世界的热带、亚热带和温带海域(Nägeli, 1847; 夏邦美, 1999)。大部分江蓠科海藻用途广泛, 涉及养殖业、医药业、食品业以及生态修复等多个领域(李来好 等, 2003; 杨宇峰 等, 2003; 潘江球 等, 2010; 李方洲 等, 2022), 是我国重要大型经济海藻。做好江蓠科物种的野外资源调查及准确鉴定, 有助于该类资源的保护与开发。
目前, 我国江蓠科海藻形态分类学研究工作资料比较丰富, 共报道了8属86种(夏邦美, 1999; 丁兰平 等, 2011, 2015, 2020)。然而, 大部分江蓠科物种易受生长环境的影响, 形态变异较大, 加之部分物种繁殖器官的缺乏, 给传统形态分类学研究造成了诸多困难(张峻甫 等, 1962)。另外, 在江蓠科的属级划分上, 江蓠属与拟江蓠(龙须菜)属Gracilariopsis (Dawson, 1949)、多穴藻属Hydropuntia (Montagne, 1842)之间的关系仍然存在争议。近几十年来, DNA条形码技术作为辅助海藻鉴定的有力工具(Wheeler, 2005; Mcdevit et al, 2009), 被广泛运用到江蓠科物种的鉴定和系统发育分析中。分子技术的运用, 使得过去存在争议的诸多江蓠科物种被准确鉴定出来, 其系统发育关系也得到了有效的修订(Gurgel et al, 2003, 2018; Lyra et al, 2021)。然而, 分子鉴定现今仍存在一些有待克服的障碍。准确的分子鉴定依赖于形态学鉴定, 但在面对一些形态相似的物种时, 如越南的硬江蓠G. firma、菲律宾的张氏江蓠G. changii和中国的芋根江蓠G. blodgettii, 其cox1基因序列在GenBank数据库中相互混淆(Ng et al, 2017), 避免此类问题的出现还需进一步与模式标本基因序列进行比对(Wang et al, 2023)。
湛江海域位于热带与温带的交接处, 海岸线漫长, 海藻资源丰富(谢恩义 等, 2009; 张才学 等, 2020)。本课题组曾多次对湛江沿海海岸的大型海藻资源进行调查, 并采集了大量的海藻样本。在此基础上, 利用形态学鉴定和分子系统发育分析, 对其中的江蓠科物种进行了分类学研究, 共鉴定了4个物种, 并讨论和修订了硬江蓠和细基江蓠的分类学信息, 该研究有利于江蓠类分类学科的发展, 也为今后湛江江蓠的开发与利用提供了分类学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究样品采自湛江海域, 共有7个采集地点(图1), 分别为湛江市特呈岛码头(21°09′43″N, 110°25′59″E)、硇洲岛港头村(20°55′46″N, 110°34′50″E); 雷州市海尾村(20°25′46″N, 109°56′38″E)、英良村(20°26′06″N, 109°59′02″E)、那毛村(20°29′58″N, 109°50′03″E); 徐闻县田洋村(20°21′16″N, 109°54′32″E)、四塘村(20°14′20″N, 110°09′19″E)。样品用3种方法处理, 即腊叶标本(用于直观观察并保存)、液浸标本(用体积浓度为6%的海水-福尔马林溶液浸泡, 主要用于形态学研究)和干燥样品(用于分子生物学的研究)。
图1 采集地点

该图基于自然资源部标准地图服务网站下载的审图号为粤S(2022)414号标准地图制作, 底图无修改。图中黑点为样品采集地点

Fig. 1 The sampling sites marked by black dots

1.2 试验方法

1.2.1 形态学研究

利用体式显微镜(广州道一Di S65)观察藻体的外观、颜色、质地、分枝情况以及囊果的形状等; 再对样品的特征部位进行徒手切片, 醋酸洋红溶液染色, 并将制成的玻片标本置于显微镜下观察其藻体的内、外皮层细胞大小和层数、髓部细胞大小和排列情况, 利用正置荧光显微镜(LEICA DM6 B, 德国)观察囊果被细胞的层数、吸收丝、精子囊以及四分孢子囊等; 最后对以上的各部分特征进行观察、数据测量及拍照。

1.2.2 系统发育学研究

1.2.2.1 DNA制备与PCR扩增

利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组快速提取试剂盒, 提取样品总DNA, 并置-18℃冰箱内保存备用。以提取的DNA为模板, 使用GWSFn/ CoxIR1 (Saunders, 2008)组合引物来扩增cox1基因序列, rbcL基因序列扩增引物为F57/R1381 (Freshwater et al, 1994)。设定PCR程序: 94℃预变性3min, 94℃变形30s, 49.5℃退火40s, 72℃延伸50s (对于cox1)或90s (对于rbcL), 循环35次, 72℃终延伸5min。PCR产物检测采用1%的琼脂糖凝胶电泳, 后将产物送至广州华大基因科技有限公司进行克隆、测序。

1.2.2.2 数据分析

在NCBI中运用blast工具将试验中获得的rbcL和cox1基因序列与GenBank已发表的有关序列进行在线比对后筛选出所需的基因序列。利用软件BioEdit v7.2.6.1对所选序列进行比对、校正(Hall, 1999), 在软件MEGA v11.0中对下载的序列及目的序列进行序列特征分析(Tamura et al, 2004), 并利用Modeltest v3.7 (Posada et al, 2004)软件筛选出分子序列集最优进化模型。使用软件MEGA v11.0 (Tamura et al, 2021)构建最大似然树, 2个基因均选用GTR+G+I进化模型, Bootstrap重复1000次。软件MrBayes v3.1.2 (Ronquist et al, 2003)用于构建贝叶斯进化树, 设定运行代数为1000000代, 抽样频率1000代, 丢弃前25%的树, 计算剩余树中50%的多数一致树。序列间遗传距离在软件MEGA v11.0中使用Kimura two-parameter模型计算。

2 结果

2.1 形态学分析

2.1.1 细基江蓠

Gracilaria tenuistipitata 张峻甫 等, 1976: 161; 夏邦美, 1999: 71; Terada et al, 2000: 351; Le et al, 2006: 217; 丁兰平 等, 2014: 33-39。
形态描述: 藻体线性, 圆柱状, 高20~100cm, 基部较细, 有圆盘状的固着器。主轴极顶或否, 枝径0.5~ 3.6mm。分枝简单, 有时繁多, 分枝1~3次, 互生或偏生。分枝基部略宽, 不缢缩或略缩, 并向顶端逐渐尖细, 分枝较长, 最长可达50cm (图2a~2c)。新鲜藻体肉红色、浅褐色或海藻绿色, 质脆。制成的腊叶标本尚能附着于纸上。
图2 细基江蓠

a~c. 藻体外观; d~f. 藻体横切面观; g. 囊果切面观; h~k. 囊果外观; l. 囊果被切面观; m. 吸收丝; n. 四分孢子囊表面观; o. 精子囊窠表面观; p. 四分孢子囊切面观; q. 精子囊窠切面观

Fig. 2 Gracilaria tenuistipitata.

a ~ c. The habit sketch of the frond; d ~ f. The transection of the frond; g. the longitudinal section of the cystocarp; h ~ k. The surface of the cystocarp; l. The longitudinal section of the pericarp; m. the traversing filaments; n. The surface of the tetrasporangia; o. The surface of the spermatangia; p. The transection of the tetrasporangia; q. The transection of the spermatangia

中央髓部细胞3~4层, 近圆形, 胞径185~501μm, 壁厚11~21μm, 部分成熟藻体髓部常中空(图2d)。皮层细胞3~5层, 最外层细胞圆或长椭圆形, 1~2层, 5.8~19.6μm × 4.2~13.0μm, 内部细胞圆形, 直径20.0~ 84.6μm (图2e, 2f)。髓部与皮层之间界限明显。
表面观四分孢子囊呈十字形分裂, 近圆形, 直径19~33μm (图2n); 切面观圆形或卵圆形, 26.8~51.2μm × 16.7~43.2μm (图2p)。囊果半球形、球形或石榴状, 基部缢缩, 高580~1830μm, 宽670~2030μm (图2h)。部分囊果具有较长的喙状突起, 单条或分叉, 长0.7~1.1mm (图2i~2k)。切面观, 囊果中央产孢丝细胞较小, 果孢子囊球形, 直径23~47μm (图2g)。吸收丝不明显, 常见于囊果基部位置(图2m)。囊果被细胞6~13层, 厚度为72~200μm, 最外层细胞长椭圆形, 1~2层, 最里层细胞较大、横椭圆形, 低倍镜下排列不整齐, 细胞壁明显, 内壁常破碎(图2l)。精子囊窠散布在枝条表面, 浅坑状“T”形(图2o)。切面观, 精子囊窠深26.0~52.0μm, 宽19.5~42.4μm, 精子囊较小, 反光强, 位于精子囊窠内壁上(图2q)。
模式标本产地: 中国广东省电白县博贺。
国外分布: 美国、日本、印度尼西亚、马来西亚、新加坡、泰国、越南、菲律宾。
标本编号: XW20220521017, 由谭华强、李航于2022年5月21日采于徐闻县四塘村; ZJ20220521021, 由谭华强、李航于2022年5月21日采于湛江市硇洲岛港头村; ZJ20221228001、ZJ20230208002、ZJ20230222007, 由谭华强、曾俊、李能辉于2022年12月28日、2023年2月8日和2023年2月22日采于湛江市特呈岛码头。标本保存在南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)大型海藻资源开发与利用课题组。

2.1.2 硬江蓠

Gracilaria firma 张峻甫 等, 1976: 143; Nguyen, 1992: 209; 夏邦美, 1999: 49; Terada et al, 2000: 352; Ng et al, 2017: 1-21。
形态描述: 藻体圆柱状, 线性, 高10~28cm, 主轴不明显, 宽1.5~4.2mm, 基部具有圆盘状固着器。分枝繁多, 不规则的互生, 偶有偏生。分枝较短, 基部通常强烈缢缩, 形成一个极细的柄, 枝顶部尖细。藻体中上部分枝可见短而尖的棍棒状小枝。藻体暗褐色或海藻绿, 体硬, 软骨质(图3a)。制成的腊叶标本很难附着于纸上。
图3 硬江蓠

a. 藻体外形图; b~d. 藻体横切面观; e. 囊果外观; f. 囊果切面观; g. 囊果被切面观; h. 吸收丝; i. 精子囊窠表面观; j. 四分孢子囊表面观; k. 四分孢子囊切面观; l. 精子囊窠切面观

Fig. 3 Gracilaria firma.

a. The habit sketch of the frond; b ~ d. The transection of the frond; e. The surface of the cystocarp; f. The longitudinal section of the cystocarp; g. The longitudinal section of the pericarp; h. The traversing filaments; i. The surface of the spermatangia; j. The surface of the tetrasporangia; k. The transection of the tetrasporangia; l. The transection of the spermatangia

藻体内部结构由髓部和皮层组成, 中央髓部细胞大而不规则、近圆形, 壁厚, 胞径300~800μm (图3b)。内皮层细胞2~3层, 近圆形, 13~45μm, 外皮层细胞长圆形, 1~2层, 6.6~13.2μm × 5.2~8.3μm, 皮层与髓部的分界线明显(图3c, 3d)。
四分孢子囊散生在藻体的皮层细胞中, 十字形分裂, 表面观圆或卵圆形, 20~34μm (图3j); 切面观卵圆形, 23~47μm × 13~29μm (图3k), 中央有明显的星状色素体, 周围的皮层细胞常变态。囊果突出体表, 锥形或半球形, 基部略缩, 无喙, 573~1161μm × 778~1600μm (图3e)。切面观, 无数产孢丝由较小的薄壁细胞产生, 其顶端果孢子囊球形, 直径24~33μm。囊果被厚108~180μm, 由9~13层细胞组成。囊果被共分为3层, 外层细胞1~2层, 方形, 内层细胞为角圆的横长方形, 最里面的1~2层细胞圆或椭圆形, 低倍镜下, 细胞排列整齐(图3f, 3g)。吸收丝不明显, 主要见于囊果基部(图3h)。精子囊窠表面观不规则圆形, 27~88μm, 散生在藻体的皮层细胞中(图3i)。切面观, 多为不规则椭圆形单腔室精子囊窠(属“V”型), 深56~102μm, 宽40~90μm (图3l)。精子囊窠顶端有一开口。
模式标本产地: 中国广东省徐闻县新地。
国外分布: 马来西亚、日本、泰国、越南、菲律宾。
标本编号: LZ20230317001、LZ20230411005, 由曾俊、李航、李能辉于2023年3月17日和2023年4月11日采于雷州市海尾村; LZ20230414002, 由曾俊、李能辉于2023年4月14日采于雷州市英良村。标本保存在南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)大型海藻资源开发与利用课题组。

2.1.3 帚状江蓠

Gracilaria edulis (S. G. Gmelin) Silva, 1952: 293; Nguyen, 1992: 209; 夏邦美, 1999: 45。
Hydropuntia edulis (S. G. Gmelin) Gurgel et al, 2004: 138-159; Yang et al, 2012: 182。
形态描述: 藻体茶褐色, 软骨质, 圆柱状, 丛生, 基部有明显的匍匐茎, 上部分直立, 高9~22cm, 有圆盘状固着器。主轴不明显, 主要见于体下部, 枝径1.8~2.6mm, 分枝5~6次, 不规则的互生、偏生或二叉式分枝。分枝基部紫红色、有时略缩。分枝主要集中于藻体中上部, 其上被有许多叉分状小枝, 整个藻体呈现出扫帚状轮廓(图4a)。制成腊叶标本不完全附着纸上。
图4 帚状江蓠

a. 藻体外形图; b~d. 藻体横切面观; e. 囊果外观; f. 囊果切面观; g~h. 吸收丝; i. 囊果被切面观; j. 四分孢子囊表面观; k. 精子囊窠表面观; l. 四分孢子囊切面观; m. 精子囊窠切面观

Fig. 4 Gracilaria edulis.

a. The habit sketch of the frond; b ~ d. The transection of the frond; e. The surface of the cystocarp; f. The longitudinal section of the cystocarp; g ~ h. The traversing filaments; i. The longitudinal section of the pericarp; j. The surface of the tetrasporangia; k. The surface of the spermatangia; l. The transection of the tetrasporangia; m. The transection of the spermatangia

藻体切面, 中央髓部细胞大而不规则, 胞径300~ 620μm (图4b)。外皮层细胞1~2层, 方形或椭圆形, 5.8~11.0μm × 3.9~8.5μm, 内皮层细胞1~2层, 不规则圆形, 胞径14~40μm。皮层与髓部之间界限明显(图4c, 4d)。
四分孢子囊锦葵红色, 十字形分裂, 表面观圆形或卵圆, 20~37μm × 16~30μm (图4j); 切面观卵圆形, 20~38μm × 13~19μm (图4l)。囊果球形, 突出体表, 高806~1338μm, 宽1250~1852μm, 略具喙, 基部缢缩, 主要分布在藻体中上部(图4e)。产孢丝细胞较大, 果孢子囊球形, 胞径20~31μm (图4f)。囊果被由9~13层细胞组成, 厚200~302μm, 分内外两层, 外层由4~5层卵圆形细胞组成, 内层细胞呈椭圆形5~7层(图4i)。吸收丝仅分布在囊果基部, 分枝较多且粗壮(图4g, 4h)。精子囊窠散生在藻体表面, 为不规则椭圆形(图4k)。精子囊窠球形, 成群地集中在皮层细胞中, 形成“P”型精子囊窠群, 囊窠群一般由5~10个囊窠组成, 深99~149μm, 宽92~210μm。成熟的精子囊窠, 囊窠壁逐渐溶解, 最终合并成数个长袋状的囊窠(图4m)。
模式标本产地: 印度尼西亚。
国外分布: 马达加斯加、日本、印度、印度尼西亚、马来西亚、新加坡、泰国、越南。
标本编号: XW20230330002, 由曾俊、李航、李能辉于2023年3月30日采于徐闻县田洋村; LZ20230410003、LZ20230416004、LZ20230526001,由曾俊、李航、李能辉于2023年4月10日、4月16日和5月26日采于雷州市那毛村。标本保存在南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)大型海藻资源开发与利用课题组。

2.1.4 异枝拟江蓠

Gracilariopsis bailinae (Zhang et al, 1991: 290; Terada et al, 2000: 352; Yang et al, 2012: 180)。
Gracilaria bailinae (Zhang et Xia) (夏邦美 等1999: 31; 丁兰平 等, 2014: 35)。
Gracilaria heteroclada (Zhang et al, 1988: 132; Nguyen, 1992: 207)。
Gracilariopsis heteroclada (Zhang et al, 1991: 290; Gurgel et al, 2004: 138-159)。
形态描述: 藻体单生或丛生, 线性, 圆柱状, 高18~70cm, 最长可达1.6m, 藻体亮红色、棕灰色、暗褐色或海带绿色, 肥厚多汁, 有圆盘状的固着器。主轴一般极顶, 宽1.5~4.6mm, 1~3次分歧, 偏生或互生, 次级分枝很长, 三级分枝较短, 有时呈刺状, 宽0.5~1mm。部分藻体分枝常裸露不被小枝(图5a)。分枝基部不缩或略缩, 枝顶端逐渐尖细。制成的腊叶标本能附着于纸上。
图5 异枝拟江蓠

a. 藻体外形图; b~c. 藻体横切面观; d. 囊果外观; e. 囊果切面观; f. 囊果被切面观; g. 四分孢子囊表面观; h. 精子囊表面观; i. 四分孢子囊切面观; j~k. 精子囊切面观

Fig. 5 Gracilariopsis bailinae.

a. The habit sketch of the frond; b ~ c. The transection of the frond; d. The surface of the cystocarp; e. The longitudinal section of the cystocarp; f. The longitudinal section of the pericarp; g. The surface of the tetrasporangia; h. The surface of the spermatangia; i. The transection of the tetrasporangia; j ~ k. The transection of the spermatangia

中央髓部细胞大而近圆形, 胞径412~1226μm (图5b)。表皮细胞1~2层, 圆形或卵圆形, 8.2~15.8μm × 3.9~12.0μm。内皮层细胞近圆形, 2~3层, 胞径14~55μm (图5c)。皮层与髓部界限明显。
囊果亚圆锥形, 高633~1260μm, 宽957~2261μm, 基部不缢缩, 突出于体表(图5d)。产孢丝由许多较小的薄壁细胞组成, 其顶端产生圆形或卵圆形果孢子囊, 囊径21~37μm (图5e)。囊果被厚84~130μm, 由7~10层细胞组成, 表皮细胞1~2层, 圆形或卵圆形, 内部细胞横椭圆形, 低倍镜下, 不完全纵向排列(图5f)。四分孢子囊表面观圆形或卵圆形, 散生在藻体表面, 直径14~32μm (图5g); 切面观多为卵圆形, 周围被有变态的皮层细胞, 24~52μm × 14~46μm (图5i)。精子囊色淡反光强, 呈连续分布, 属“C”型(图5h, 5j, 5k)。未发现吸收丝。
模式标本产地: 中国海南省乐东县莺歌海。
国外分布: 菲律宾、越南、马来西亚、土耳其。
标本编号: ZJ20220507017, 由谭华强、李航于2022年5月7日采于湛江市硇洲岛港头村; ZJ20230208010、ZJ20230324004, 由谭华强、曾俊、李能辉于2023年2月8日和2023年3月24日采于湛江市特呈岛码头; LZ20230318002, 由谭华强、李航于2023年3月18日采于雷州市那毛村; LZ20220521018、LZ20230317003, 由谭华强、李航于2022年5月21日和2023年3月17日采于雷州市海尾村; XW20220529018、XW20230330001, 由谭华强、曾俊于2022年5月29日和2023年3月30日分别采于徐闻县四塘村、田洋村。标本保存在南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)大型海藻资源开发与利用课题组。

2.2 分子系统发育分析

2.2.1 rbcL基因序列分析

以红皮藻属Rhodymenia pseudopalmata为外群, 用以构建rbcL基因系统发育树的序列共有49条, 其中37条来自GenBank, 12条为本研究新扩增序列, 序列最终长度为1201bp, 保守位点为750bp, 变异位点为451bp, 简约信息位点为377bp。基于最大似然法(maximum likelihood, ML)和贝叶斯法(Bayesian inference, BI)分别构建了rbcL序列的系统发育树, 两种方法所得的拓扑结构大致相同, 故本文选择了ML法构建的系统发育树显示(图6)。其中节点上的数值表示为自展支持值, 从左到右或从上到下依次为BI、ML。
图6 基于rbcL基因构建的最大似然树

图中粗体为本研究新扩增序列, 仅显示贝叶斯分析后验概率≥0.60/最大似然分析Bootstrap值≥60的节点数值

Fig. 6 Maximum likelihood tree based on rbcL gene

结果显示, 在rbcL基因系统发育树中, 本研究的12个样品序列共构成了4个类群, 其中, 本研究序列LZ20230317001、LZ20230411005、LZ20230414002与来自越南的硬江蓠(KY315293)和马来西亚的张氏江蓠(AY769251)组成第一类群, 3个样品之间的rbcL基因序列无碱基差异, 它们与越南的硬江蓠的碱基序列差异为0, 遗传距离为0, 与马来西亚的张氏江蓠遗传距离为0.50%, 与马来西亚的未知种Gracilaria sp.互为姐妹种, 遗传距离为4.50%, 结果表明硬江蓠和张氏江蓠为同一个种。来自马来西亚的帚状江蓠(AY049391)则与本研究序列XW20230330002、LZ20230416004和LZ20230526001组成第二类群(3个样品之间的rbcL基因序列无碱基差异), 其遗传距离为0.083%。而样品序列ZJ20221228001、ZJ20230208002和ZJ20230222007则与产于中国的细基江蓠繁枝变种(OP669635)和越南的细基江蓠(MH760425)组成第三类群(长喙江蓠的rbcL基因序列缺失), 3个样品之间的rbcL基因序列无碱基差异, 它们与来自中国的细基江蓠繁枝变种和越南的细基江蓠的遗传距离分别为0、0.083%, 而与2个姐妹种智利江蓠(AY049396)和真江蓠(EF434912)的遗传距离依次为9.28%、13.05%, 结果表明细基江蓠及其繁枝变种为同一个种。最后, 样品序列XW20230330001、LZ20230318002和ZJ20230324004则与产于中国的异枝拟江蓠(OP669721)组成第四类群, 3个样品之间的rbcL基因序列无碱基差异, 它们与中国的异枝拟江蓠的遗传距离为0.17%。

2.2.2 cox1基因序列分析

以红皮藻属Rhodymenia pseudopalmata为外群, 用于构建cox1基因系统发育树的序列共有49条, 其中37条来自GenBank, 12条为新生成的序列, 序列最终长度为623bp, 保守位点为379bp, 变异位点为244bp, 简约信息位点为203bp。基于ML和BI分别构建了cox1序列的系统发育树, 所得的拓扑结构大致相同, 故本文选择了ML法构建的系统发育树显示(图7)。其中节点上的数值表示为自展支持值, 从左到右或从上到下依次为BI、ML。
图7 基于cox1基因构建的最大似然树

图中粗体为本研究新扩增序列, 仅显示贝叶斯分析后验概率≥0.60/最大似然分析Bootstrap值≥60的节点数值

Fig. 7 Maximum Likelihood tree based on cox1 gene

结果显示, 在cox1基因系统发育树中, 本研究12个样品序列同样聚为了4个类群, 其中, 本研究序列LZ20230317001、LZ20230411005、LZ20230414002与来自越南的硬江蓠(KY315253)和中国的张氏江蓠(OP669391)聚在同个一分支, 3个样品之间的cox1基因序列无碱基差异, 它们与越南的硬江蓠碱基差异为0, 与中国的张氏江蓠遗传距离为0.48%, 结果同样表明硬江蓠和张氏江蓠为同一个种。本研究序列ZJ20221228001、ZJ20230208002、ZJ20230222007则与来自泰国的细基江蓠(JQ026072)和中国的长喙江蓠(OP160515)、细基江蓠繁枝变种(OP669471)聚在一支, 3个样品之间的cox1基因序列无碱基差异, 它们与细基江蓠、细基江蓠繁枝变种和长喙江蓠的遗传距离分别为0.52%、0.16%和0, 此外, 来自泰国的细基江蓠与中国的细基江蓠繁枝变种的遗传距离为0.69%, 结果表明长喙江蓠、细基江蓠及其繁枝变种为同一个种。样品序列XW20230330002、LZ20230416004和LZ20230526001与来自菲律宾的帚状江蓠(KY995630)聚为一个分支, 3个样品之间的cox1基因序列无碱基差异, 它们与菲律宾的帚状江蓠遗传距离为0.48%。最后, 样品序列XW20230330001、LZ20230318002和ZJ20230324004则与来自马来西亚的异枝拟江蓠(JQ026097)聚为一支, 3个样品之间的cox1基因序列碱基差异为1~3bp, 它们与马来西亚的异枝拟江蓠的遗传距离仅为0.16%。

3 讨论

江蓠科物种一般具有广温、广盐性, 故分布较广, 但因发生时间和地域不同, 其藻体的形态、颜色、质地和内部构造上也都有相应的差异, 加之部分物种繁殖器官的缺乏, 给传统形态分类学带来了诸多困难(张峻甫 等, 1962; 丁兰平 等, 2014)。为了准确鉴定物种, 当前江蓠科物种的鉴定是采用形态学和分子系统发育分析相结合的方法。鉴于此, 本研究对采自湛江的江蓠科样品进行解剖, 获得了详细且全面的形态特征, 包括囊果、四分孢子囊和精子囊等繁殖器官形态特征, 并结合分子标记rbcL和cox1基因的系统发育分析结果进行物种鉴定。经鉴定, 共发现4个物种, 依次为细基江蓠、硬江蓠、帚状江蓠和异枝拟江蓠。
细基江蓠最早报道于我国广东省电白县博贺(张峻甫 等, 1976), 该藻体纤细、分枝简单, 有固着器和繁殖器官。而细基江蓠繁枝变种其藻体纤细、分枝繁杂, 通常无基部固着器, 且很难找到成熟的植株(刘思俭, 2001)。由于细基江蓠及其繁枝变种在形态上存在着一定的差异, 曾一度被看作两个独立的物种。近年来, 越来越多的证据表明两者为同一个种。其中, 根据对生殖器官结构的观察结果, 张峻甫等认为细基江蓠繁枝变种为细基江蓠的生态变型(张峻甫 等, 1976)。李文红等则通过分子系统发育分析支持细基江蓠及其繁枝变种为同一物种的观点(李文红 等, 2004)。最近, 丁兰平等基于大量形态学和分子系统发育分析结果认为, 细基江蓠与细基江蓠繁枝变种为同一物种(丁兰平 等, 2020)。本研究采集的细基江蓠样品藻体纤细, 分枝简单, 囊果被6~13层, 精子囊窠切面观浅坑状“T”型, 四分孢子囊切面观圆形或卵圆形, 这些主要特征皆与过去报道细基江蓠相符(见表1)。而采集的疑似细基江蓠繁枝变种样品除了分枝情况与细基江蓠不一致以外, 藻体的内部结构, 囊果、精子囊和四分孢子囊等繁殖器官的形态差异并不明显(表1)。另外, 基于rbcL和cox1基因的系统发育分析结果表明, 细基江蓠与细基江蓠繁枝变种为同一个种, 其遗传距离范围为0.083%~0.69%。因此, 基于形态学和分子鉴定结果, 我们支持细基江蓠与细基江蓠繁枝变种为同一个种的观点。
表1 样品与细基江蓠及其繁枝变种的形态特征比较

Tab. 1 Comparison of morphological characteristics of the samples with G. tenuistipitata and G. tenuistipitata var. liui

结构 样品(分枝简单) 样品(分枝繁多) 细基江蓠 细基江蓠繁枝变种
高 20~100cm 20~85cm 20~40cm 20~30cm
宽 0.5~3.6mm 0.5~3mm 0.5~1mm 0.3~0.5mm
表层细胞 1~2层; 5.8~19.6μm × 4.2~11μm 1~2层; 5.8~17.5μm × 5~13μm 1~2层; 15~18μm × 10.5~19.5μm 1~2层; 12~18μm × 10~11μm
内皮层细胞 2~3层; 23.1~84.6μm 2~3层; 23.3~80.4μm 2~3层; 33~83μm 2~4层; 25~80μm
髓部细胞 185~501μm 190~485μm 225~390μm 200~250μm
囊果 595~1780μm 580~1830μm 830~950μm 0.8~1mm
囊果被 6~13层; 厚72~185μm 6~11层; 厚74~200μm 8~11层; 厚72~102μm 7~10层; 厚72~102μm
吸收丝 存在 存在 存在 存在
精子囊 “T”型, 24~50μm × 20~42μm “T”型, 26~52μm × 18~40μm “T”型, 19~23μm × 10~23μm “T”型, 19~23μm × 10~23μm
四分孢子囊 26.8~50.5μm × 18.4~43.2μm 28.5~51.2μm × 16.7~42.5μm 30~46μm × 18~30μm 30~46μm × 18~30μm
参考文献 本文 本文 张峻甫等(1976); 夏邦美(1999) 夏邦美(1999); 丁兰平等(2014)
长喙江蓠最早报道产于汕头南澳岛深澳湾(Zhang et al, 1995)。本研究采集的疑似长喙江蓠样品与细基江蓠样品均来自湛江市特呈岛码头, 两者的最大区别在于前者的囊果具有明显的长喙, 长1.1mm左右。除此之外, 藻体外形、囊果被细胞层数及细胞形状及果胞大小两者差异并不明显, 该发现与丁兰平等(2014)报道的长喙江蓠相符合(表2)。因此, 长喙江蓠的“长喙”是否是种级鉴定特征, 以及长喙江蓠是否是细基江蓠的变种或同物异名尚有争议(丁兰平 等, 2014)。此外, 基于cox1序列的分子系统发育分析结果表明(长喙江蓠的rbcL基因序列缺失), 本研究的疑似长喙江蓠样品(ZJ20221228001)和细基江蓠(ZJ20230208002)样品与来自中国的长喙江蓠(该样品来自广东省汕头市南澳岛)均为同一个种, 其碱基差异为0, 遗传距离为0, 且与泰国的细基江蓠亦为同一个种, 遗传距离仅为0.52%。由于在形态上长喙江蓠与细基江蓠除囊果的外形特征(主要为长喙)不同之外, 差异并不明显, 且分子鉴定结果表明两者为同一个种, 因此, 本研究认为细基江蓠在囊果外形特征上是多变的, “长喙”并不能作为一个有效的种级鉴定特征, 长喙江蓠与细基江蓠亦为同一个物种。
表2 样品与细基江蓠及长喙江蓠的形态特征比较

Tab. 2 Comparison of morphological characteristics of the samples with G. tenuistipitata and G. longirostris

结构 样品(分枝简单) 样品(囊果长喙) 细基江蓠 长喙江蓠
高 20~100cm 20~74cm 20~40cm 约20cm
宽 0.5~3.6mm 0.5~2.8mm 0.5~1mm 约 1mm
表层细胞 1~2层; 5.8~19.6μm × 4.2~11μm 1~2层; 6~18.5μm × 4.5~12.5μm 1~2层; 15~18μm × 10.5~19.5μm 1~2层; 8~13μm × 7~9μm
内皮层细胞 2~3层; 23.1~84.6μm 2~3层; 20~78.5μm 2~3层; 33~83μm 1~2层; 15~40μm
髓部细胞 185~501μm 185~470μm 225~390μm 70~200μm
囊果 595~1780μm 喙长1.1mm左右 830~950μm 喙长2~3mm
囊果被 6~13层; 厚72~185μm 6~10层; 厚78~180μm 8~11层; 厚72~102μm 4~7层; 厚106~145μm
吸收丝 存在 存在 存在 存在
精子囊 “T”型, 24~50μm × 20~42μm 未发现 “T”型, 19~23μm × 10~23μm 未发现
四分孢子囊 26.8~50.5μm × 18.4~43.2μm 未发现 30~46μm × 18~30μm 20~50μm × 10~36μm
参考文献 本文 本文 张峻甫等(1976); 夏邦美(1999) 夏邦美(1999); 丁兰平等(2014)
综上所述, 细基江蓠、细基江蓠繁枝变种及长喙江蓠应为同一物种, 该观点与过去丁兰平的观点一致(丁兰平 等, 2020)。因此, 我们认为细基江蓠这个物种在形态上是多变的, 建议对该种鉴定需把握主要特征和区分变异特征, 并紧密结合分子标记技术。
张氏江蓠最初由夏邦美等(Xia et al, 1987)报道于马来西亚。硬江蓠最早报道于中国广东省徐闻县新地(张峻甫 等, 1976)。两者在外观形态上较为相似, 但由于藻体内部结构上的差异, 张氏江蓠和硬江蓠一度被认为是两个独立的物种。随着分子标记技术的应用, 张氏江蓠与硬江蓠的分类学地位逐渐出现了争议。其中, Ng等(2017)基于形态学和分子系统发育分析认为, 张氏江蓠与硬江蓠为同一个种, 并按照优先命名原则将其视为硬江蓠。但是, 由于缺少硬江蓠模式标本基因序列信息, 该观点尚有争议(Gurgel et al, 2020; Wang et al, 2023)。本研究采集的疑似硬江蓠样品藻体基部通常缢缩成一个极细的柄, 体硬, 囊果被细胞大致分为3层, 多为角圆的方形, 在低倍镜下排列整齐, 精子囊窠切面观多为不规则椭圆形单腔状“V”型, 四分孢子囊中央有明显的星状色素体, 这些主要特征皆与过去中国报道的硬江蓠相符(表3)。有意思的是, 本研究样品髓部与皮层之间界限明显, 且在囊果切面的基部位置还发现了少量吸收丝, 该类特征在Ng等报道的硬江蓠中均有描述(Ng et al, 2017), 然而, 他们的硬江蓠样品并非来自于模式产地(广东省徐闻县新地)。而本研究的硬江蓠样品均来自广东省雷州市海尾村和英良村, 在地理位置上更加接近于硬江蓠的模式产地。另外, 分子系统发育分析结果皆表明, 本研究的硬江蓠样品与GenBank数据库中的硬江蓠为同一个种, 遗传距离为0, 且与张氏江蓠亦为同一个种, 其遗传距离最大仅为0.50%。因此, 基于形态学和分子鉴定结果, 我们支持硬江蓠与张氏江蓠为同一个种的观点, 该研究也为硬江蓠的分类学修订提供了新的依据。
表3 样品与张氏江蓠及硬江蓠的形态特征比较

Tab. 3 Comparison of morphological characteristics of the samples with G. changii and G. firma

结构 样品 张氏江蓠 硬江蓠
高 10~28cm 7~14cm 10~20cm
宽 1.5~4.2mm 0.5~2mm 1~3mm
表层细胞 1~2层; 6.6~13.2μm × 5.2~8.3μm 1~2层; 6.6~9.9μm × 4~6.6μm 2~3层; 6.6~13.2μm × 3.3~6.6μm
内皮层细胞 2~4层; 13~45μm 2~3层; 33~83μm 3~5层; 26~83μm
髓部细胞 300~800μm 300~499μm 230~450μm
囊果 573~1161μm × 778~1600μm 589~664μm × 930~996μm 580~630μm
囊果被 9~13层; 厚108~180μm 10~12层; 厚79~132μm 8~10层; 厚83~95μm
吸收丝 存在 存在 不存在
精子囊 “V”型, 56~102μm × 40~90μm “V”型, 50μm × 33~36μm;
“P”型, 69~76μm × 43~50μm		 “V”型, 66~116μm × 33~66μm
四分孢子囊 23~47μm × 13~29μm 10~66μm × 20~40μm 50~66μm × 26~43μm
参考文献 本文 Zhang等(1991) 张峻甫等(1976)
帚状江蓠作为一种重要的经济性海藻, 在热带和亚热带地区海域均有分布(Bhushan et al, 2023), 中国最早报道于海南莺歌海(张峻甫 等, 1963)。本文研究的帚状江蓠样品藻体茶褐色, 基部有明显的匍匐茎, 主轴不明显, 主要见于体下部, 整个藻体呈现出扫帚状轮廓, 囊果被分内外两层, 吸收丝主要见于囊果基部, 分枝较多且粗壮, 精子囊属典型的多腔体“P”型, 常见长袋状的精子囊窠。以上这些特征均与此前报道的帚状江蓠相符(张峻甫 等, 1963; Yang et al, 2012)。不同的是, 本研究样品藻株在幼苗时, 其分枝基部通常呈现出紫红色, 并且随着藻体的生长而逐渐消失。最后, 基于rbcL和cox1序列的分子系统发育分析表明, 本研究的帚状江蓠样品与GenBank数据库中的帚状江蓠为同一物种, 其遗传距离范围为0.083%~0.48%。作为一种耐高温的海藻, 帚状江蓠在印度得到了较好的开发与利用(Ganesan et al, 2011; Bhushan et al, 2023), 产生了可观的经济效益。本研究为帚状江蓠在湛江海域的首次报道, 也为该资源的开发与保护提供了基础资料。
Yamamoto (1978)认为, 外部形态特征在物种鉴定中并不是非常有效的, 其易受环境的影响变异较大。本研究在对湛江海域大型海藻资源调查过程中, 发现来自不同海域的异枝拟江蓠样品在外观形态上存在着一定的差异。其中, 采自湛江市硇洲岛港头村, 雷州市那毛村、海尾村和徐闻县四塘村、田洋村的样品在外观形态上差异较小, 该类样品藻体呈亮红色、棕灰色或海带绿色, 主轴一般极顶, 次级分枝很长, 三级分枝较短, 有时呈刺状; 而采自湛江市特呈岛码头的样品在外观形态上变异较为明显, 该样品藻体分枝常裸露不被小枝, 且分枝基部常略缩, 藻体最长可达1.6m左右。但在藻体的内部结构, 囊果、精子囊和四分孢子囊等繁殖器官的形态上, 上述样品之间的差异并不明显, 且与文献记载中的异枝拟江蓠相符(夏邦美, 1999; Yang et al, 2012; 丁兰平 等, 2014)。另外, 分子系统发育分析皆表明, 本研究的异枝拟江蓠样品与来自中国、马来西亚的异枝拟江蓠为同一个种, 其遗传距离小于0.17%。综上所述, 我们认为异枝拟江蓠在外观形态上是多变的, 出现此类情况的原因可能和其生境有关, 这提示我们对该种鉴定时需把握主要的形态学特征, 并紧密结合分子标记技术。

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