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Journal of Tropical Oceanography >

2025 , Vol. 44 >Issue 2: 64 - 72

DOI: https://doi.org/10.11978/2024073

Marine Biology

2-Hydroxyphenyl thiazoline derivatives and their biosynthetic gene clusters from the mangroves-derived Strepomyces ardesiacus

  • LIU Sini , 1, 2 ,
  • BAI Meng 1, 2 ,
  • ZHU Yiguang 3 ,
  • LUO Xiaowei 1, 2 ,
  • GAO Chenghai 1, 2 ,
  • LIU Yonghong 1, 2 ,
  • XU Xinya , 1, 2 ,
  • JIANG Xiaodong , 1, 2
Expand
  • 1. Institute of Marine Drugs, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China
  • 2. Guangxi Key Laboratory of Marine Drugs, Nanning 530200, China
  • 3. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica (South China Sea Institute of Oceanology, CAS), Guangzhou 510301, China
JIANG Xiaodong, email: ;
XU Xinya, email:

Copy editor: YIN Bo

Received date: 2024-04-02

  Revised date: 2024-05-21

  Online published: 2024-05-23

Supported by

Guangxi Science and Technology Base and Talent Special Project(Guike AD22035167)

Natural Science Foundation of Guangxi Province(2023GXNSFBA026139)

Natural Science Foundation of Guangxi Province(2023GXNSFAA026313)

Open Project of Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica(LMM2022-4)

Initial Scientific Research Foundation of Introduced Doctors in 2021 of Guangxi University of Chinese Medicine(2021BS022)

Guangxi University of Chinese Medicine “Guipai Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation Team” Project(2022A007)

Special Fund for Bagui Scholars of Guangxi(05019055)

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine the third batch of “Qhuang Project” high-level talent team cultivation project(202407)

Fold

Abstract

In order to identify secondary metabolites and analyze the corresponding biosynthetic gene clusters, the strain GXIMD 03502, isolated from the mangroves in Hainan, was studied. The strain was identified by comparing the 16S rDNA sequence. The secondary metabolites were separated by various chromatographic separation techniques, and their structures were determined by spectral data analysis and literature comparison. Five 2-hydroxyphenylthiazoline derivatives were isolated from this strain and identified as (+)-(S)-pulicatin G (1), pulicatin A (2), aerugine (3), pulicatin F (4), and (+)-(S)-dihydraeruginoic acid (5). At the same time, the genomic DNA of the strain was obtained by Illumina novaseq 6000 sequencing technology. The bioinformatic approach was employed to annotate the biosynthetic gene cluster and deduce the biosynthetic pathways of the compounds. The analysis results of the whole genome DNA sequence indicated that it contained 31 secondary metabolic biosynthetic gene clusters, and revealed that cluster 11 may be responsible for the biosynthesis of 2-hydroxyphenylthiazoline derivatives. This study provided a mangroves-derived S. ardesiacus GXIMD 03502 to produce 2-hydroxyphenylthiazoline derivatives, and the whole genome sequence of this strain laid a foundation for the exploration of its secondary metabolites.

Key words： mangroves-derived actinomycetes; Strepomyces ardesiacus; 2-hydroxyphenylthiazolineine; biosynthetic gene cluster

Cite this article

LIU Sini , BAI Meng , ZHU Yiguang , LUO Xiaowei , GAO Chenghai , LIU Yonghong , XU Xinya , JIANG Xiaodong . 2-Hydroxyphenyl thiazoline derivatives and their biosynthetic gene clusters from the mangroves-derived Strepomyces ardesiacus[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025 , 44(2) : 64 -72 . DOI: 10.11978/2024073

红树林是热带、亚热带海岸带海陆交错区生产力最高的海洋生态系统, 蕴藏着丰富的微生物资源, 主要包括细菌、真菌、古细菌及黏细菌等。微生物为适应高温、高盐、强光照、低氧与潮汐渐变等复杂环境和抵御外敌, 进化出能够产生特殊活性物质的独特生理代谢途径(Sangkanu et al, 2017)。研究发现红树林来源放线菌能够产生多种结构新颖的显效活性天然产物, 具有抗病毒、抗菌、抗癌和抗炎等生物学活性, 包括非核糖体肽类、聚酮类及生物碱类等, 被誉为活性天然产物的重要源泉(Zhang et al, 2015; Han et al, 2016)。Ding等(2010)从红树木槿内生菌Streptomyces sp. GT2002/1503中鉴定了具有抗人类免疫缺陷病毒活性的吲哚倍半萜类化合物xiamycin及其甲酯化衍生物; Fu等(2012)从三亚红树林土壤来源放线菌Streptomyces sp. FM发现了具有抗肿瘤细胞毒活性的吲哚咔唑生物碱streptocarbazoles A和B; 洪葵教授课题组(Xu et al, 2020)从红树林来源链霉菌S. qinglanensis 172205中挖掘到对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有较强抑制活性的聚酮天然产物dehydroxantholipin, 且对人乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela具有中等程度的抗增殖活性。研究表明红树林来源放线菌能够合成结构新颖的活性天然产物, 深入研究其来源放线菌次级代谢产物对发现新结构活性天然产物具有重要意义。因此本文以链霉菌GXIMD 03502为研究对象, 运用多种色谱技术和波谱技术分离鉴定该菌株的次级代谢产物, 利用基因组测序和生物信息学技术分析该菌株基因组, 定位并注释相应化合物生物合成基因簇, 初步推导其生物合成途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker DRX核磁共振波谱仪(Bruker, 美国); Prominence LC-2030C 3D Plus高效液相色谱仪(岛津, 日本); 5C18-MS-II 分析色谱柱(4.6ID × 250mm, COSMOSIL, 日本); 5C18-MS-II半制备色谱柱(10ID × 250mm, COSMOSIL, 日本); MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅(普和希株式会社, 日本); SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司, 中国); BUCHI R100旋转蒸发仪(BUCHI, 瑞士); ZWYR-2102立式恒温培养振荡器(上海智诚公司, 中国); C1000 TOUCH PCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc, 美国); DYY-6D型核酸电泳仪(北京六一生物科技有限公司, 中国); 5910R台式高速大容量离心机(Eppendorf, 德国)。
DNA高保真聚合酶、DNA marker、核酸染料(北京全式基因生物技术有限公司, 中国); 基因组提取试剂盒、16S rDNA扩增引物(生工生物工程(上海)股份有限公司, 中国); 色谱纯乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司, 中国); 甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等分析纯有机试剂(广州化学试剂厂, 中国); 核磁氘代试剂(Cambridge Isotope Laboratories, 美国); 100~200目正相硅胶(烟台江友硅胶开发有限公司, 中国); Sephadex LH-20凝胶(Amersham Pharmacia Biotech, 瑞典); 大孔树脂XAD-16 (Rohm and Haas, 美国)。

1.2 菌株来源

菌株GXIMD 03502由广西中医药大学高程海研究员团队从海南红树林沉积物样品中分离获得并提供; 保藏于广西中医药大学海洋药物研究院北部湾海洋微生物资源库。

1.3 菌株16S rRNA基因序列扩增与鉴定

采用酶解法(Kieser et al, 2000)提取菌株基因组DNA, 通过DNA聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)从菌株GXIMD 03502中 扩增其16S rDNA基因片段。以27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)为特异性引物, 菌株GXIMD 03502的基因组DNA为模板, PCR反应体系: 5 × Buffer 10μL, dNTPs 1.2μL, 引物27F和1492R各0.5μL, TranStart FastPfu DNA polymerase 5U·μL-1, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 1.2μL, 菌株基因组DNA模板0.5μL, ddH2O 11.6μL; PCR反应条件: 95℃ 10min; 95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min30s, 32个循环; 72℃延伸10min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序, 将获得的DNA序列在NCBI blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行比对分析。

1.4 菌株GXIMD 03502放大规模发酵与萃取

刮取少量菌株GXIMD 03502的孢子接入含有50mL TSB培养基(胰蛋白胨大豆肉汤培养基 30g·L-1, 海盐 10g·L-1, 自来水定容至1L, pH 7.0~7.4)中, 28℃、200r·min-1摇床培养3d后, 以10%的接种量转接至200mL AM6培养基(可溶性淀粉 10g·L-1, 葡萄糖 4g·L-1, 蛋白胨 5g·L-1, 酵母提取粉 5g·L-1, CaCO3 5g·L-1, 海盐 30g·L-1, 自来水定容至1L, pH 7.0~7.4), 28℃、200r·min-1摇床振荡培养7d, 于4000r·min-1、15min条件下离心收集发酵液和菌体, 发酵液用大孔树脂吸附8h, 再用适量水冲洗树脂除去糖分, 用甲醇洗脱并收集洗脱液。菌体用甲醇浸泡超声提取3次, 离心收集提取液, 减压浓缩回收洗脱液和提取液中的甲醇; 剩余水相用乙酸乙酯萃取3次, 减压浓缩回收乙酸乙酯, 获得菌株发酵粗提物浸膏。

1.5 化合物的分离和纯化

粗浸膏与硅胶(100~200目)拌样, 经正相硅胶柱层析, 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(100/0 ~ 0/100, v/v), 得到5个组分(Fr.1~Fr.5)。将Fr.2过常压反相色谱柱层析, 合并后得到6个馏分(Fr.2.1~Fr.2.6)。将Fr.2.4用Sephadex LH-20凝胶柱层析(1.50cm × 150cm, 氯仿/甲醇 = 1/1, v/v), 收集合并得到7个馏分(Fr.2.4.1~Fr.2.4.7)。Fr.2.4.5经半制备高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography, HPLC)(乙腈/水 = 35/65, v/v)纯化得到化合物1 (tR = 23.2min, 15.3mg), Fr.2.4.4经半制备HPLC (乙腈/水 = 43/57, v/v) 纯化得到化合物2 (tR = 23.5min, 10mg) 和化合物3 (tR = 25.5min, 10mg), Fr.2.4.3经半制备HPLC (乙腈/水 = 25/75, v/v) 纯化得到化合物4 (tR = 22.5min, 6.8mg) 和化合物5 (tR = 18.9min, 4.3mg)。

1.6 化合物的ECD计算方法

化合物的电子圆二色谱(electronic circular dichroism, ECD)测试与计算参照文献方法(Lu et al, 2024)。

1.7 抑菌活性测试

采用滤纸片琼脂扩散法对化合物进行抑菌活性测试。将冻存于-80℃冰箱甘油管中的指示菌用LB培养基(胰蛋白胨 10g·L-1, 酵母粉 5g·L-1, NaCl 10g·L-1, 琼脂粉 18g·L-1, 自来水定容至1L, pH 7.0~7.4)活化, 37℃恒温培养2d后将指示菌转接至10mL LB液体培养基中, 37℃、200r·min-1条件下摇床培养8~10h。取50μL菌液至50mL离心管, 再加入即将凝固的LB固体培养基20mL, 缓慢摇晃均匀后倒入平板, 再将无菌滤纸片贴在LB固体培养基上, 取化合物用DMSO溶解至浓度为50μg·mL-1母液, 以终浓度为50μg·mL-1阿普拉霉素(Apramycin)为阳性对照, DMSO为阴性对照, 取3μL待测样品于直径为6mm的无菌滤纸片上, 37℃培养过夜, 观察滤纸片周围有无出现明显的抑菌圈。

1.8 基因组DNA的测序及生物合成基因簇分析

1.8.1 菌株GXIMD 03502基因组的测序

刮取适量菌株GXIMD 03502孢子接种至TSB培养基中培养2~4d后, 用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS) 50mmol·L-1 (pH 7.0) 洗涤2次得到菌体, 将菌体送至上海凌恩生物科技有限公司, 采用Illumina novaseq 6000测序技术平台进行全基因组扫描测序。

1.8.2 菌株GXIMD 03502基因组中生物合成基因簇的生物信息学分析

将菌株GXIMD 03502的基因组DNA序列信息上传至antiSMASH bacterial version 7.0.0 (https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/start)网站进行基因簇预测分析。利用2nd Find (http://biosyn.nih.go.jp/2ndfind/)在线软件对涵盖目标基因簇的序列进行开放阅读框(open reading frame, orf)和目标基因簇边界的预测分析。采用NCBI Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析软件对目标基因簇中各基因的功能进行注释。

2 结果与分析

2.1 菌株GXIMD 03502的生物学鉴定

菌株GXIMD 03502在38#固体培养基(酵母提取物 4g·L-1, 葡萄糖 4g·L-1, 麦芽提取物 10g·L-1, 复合维生素 500μL·L-1, 琼脂粉 18g·L-1, 海盐 15g·L-1, 自来水定容至1L, pH 7.0~7.4)中培养7d后, 形成灰白色气生菌丝及浅黄色基内菌丝, 菌落形态见图1。根据16S rDNA基因序列进行NCBI Blast比对分析, 发现菌株GXIMD 03502与菌株Strepomyces ardesiacus相似度为100%, 因此鉴定为S. ardesiacus, 其核苷酸序列的GenBank登录号为PP249927。
图1 Strepomyces ardesiacus GXIMD 03502的菌落形态

Fig. 1 Colony morphology of Strepomyces ardesiacus GXIMD 03502

2.2 化合物结构鉴定

从海南红树林来源链霉菌GXIMD 03502中分离得到5个2-羟基苯基噻唑啉衍生物, 其结构如图2所示。
图2 化合物1—5的化学结构式

Fig. 2 The chemical structures of compounds 1—5

化合物1: 淡黄色固体粉末, 分子式为C10H10N2O2S, HR-ESI-MS m/z 223.0545 [M+H]+, [ α ] D 25+65.7° (c 0.1, MeOH)。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 12.15 (1H, s, OH on C-2), 6.99 (1H, d, J=7.7Hz, H-3), 7.44 (1H, dd, J=8.5, 7.0Hz, H-4), 6.95 (1H, dd, J=7.5, 7.5Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J=10.0Hz, H-6), 3.63 (1H, s, H-4′a), 3.61 (1H, s, H-4′b), 5.28 (1H, t, J=8.7Hz, H-5′), 7.76 (2H, s, NH2 on C-7′)。13C NMR (126MHz, DMSO-d6) δC: 115.8 (C, C-l), 158.2 (C, C-2), 116.9 (CH, C-3), 130.6 (CH, C-4), 119.3 (CH, C-5), 133.5 (CH, C-6), 170.8 (C, C-2′), 33.0 (CH2, C-4′), 77.8 (CH, C-5′), 172.0 (C, C-7′)。以上数据与文献报道(Lin et al, 2010)基本一致, 化合物1鉴定为pulicatin G。通过ECD计算(Gaussian 16, Gaussian Inc., 美国)(图3), 化合物的绝对构型首次确定为 (5S)-1。
图3 化合物1的实测圆二色谱(CD)谱图和(5S)-1 计算CD谱图的比较图

电子圆二色谱(CD)计算采用的泛函/基组为: M062X/def2TZVP, σ = 0.3eV, UV shift = 0nm

Fig. 3 Comparison of calculated CD spectra of (5S)-1 (grey) in MeOH and experimental CD (black), σ = 0.3 eV, UV shift = 0 nm

化合物2: 棕黄色固体粉末, 分子式为C11H13NO2S, HR-ESI-MS m/z 224.0750 [M+H]+, [ α ] D 25-20.9° (c 0.1, MeOH)。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 12.67 (1H, s, OH on C-2), 6.96 (1H, d, J=8.5Hz, H-3), 7.40 (1H, dd, J=8.2, 7.8Hz, H-4), 6.93 (1H, dd, J=8.0, 7.7Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J=8.2Hz, H-6), 3.78 (1H, dd, J=10.9, 7.4Hz, H-4′), 3.95 (1H, dd, J=10.9, 6.4Hz, H-5′), 1.22 (3H, d, J=6.9Hz, H-6′), 4.42 (2H, q, J=7.0Hz, H-7′a), 4.10 (2H, dd, J=10.9, 6.4Hz, H-7′b), 5.15 (1H, s, OH on C-7′)。13C NMR (126MHz, DMSO-d6) δC: 116.1 (C, C-l), 158.5 (C, C-2), 116.8 (CH, C-3), 130.4 (CH, C-4), 119.1 (CH, C-5), 133.3 (CH, C-6), 171.0 (C, C-2′), 45.8 (CH2, C-4′), 79.1 (CH, C-5′), 16.5 (C, C-6′), 59.7 (C, C-7′)。以上数据与文献报道(Lin et al, 2010)基本一致, 化合物2鉴定为pulicatin A。
化合物3: 棕黄色固体粉末, 分子式为C10H11NO2S, HR-ESI-MS m/z 210.0591 [M+H]+, [ α ] D 25+25.7° (c 0.1, MeOH)。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 12.68 (1H, s, OH on C-2), 6.97 (1H, d, J=8.5Hz, H-3), 7.40 (1H, dd, J=7.5, 7.0Hz, H-4), 6.93 (1H, dd, J=7.5, 7.5Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J=7.5Hz, H-6), 3.31 (2H, dd, J=10.9, 8.8Hz, H-4′a), 3.29 (2H, dd, J=10.9, 7.4Hz, H-4′b), 3.65 (2H, dd, J=10.2, 3.9Hz, H-5′), 3.63 (2H, dd, J= 8.0, 3.8Hz, H-7′a), 3.49 (2H, dd, J=10.9, 8.8Hz, H-7′b), 5.15 (1H, s, OH on C-7′)。13C NMR (126MHz, DMSO-d6) δC: 115.9 (C, C-l), 158.5 (C, C-2), 119.2 (CH, C-3), 133.3 (CH, C-4), 116.8 (CH, C-5), 130.4 (CH, C-6), 171.2 (C, C-2′), 32.6 (CH, C-4′), 77.9 (CH2, C-5′), 62.4 (CH2, C-7′)。以上数据与文献报道(Zunnundzhanov et al, 1987)基本一致, 化合物3鉴定为aerugine。
化合物4: 淡黄色固体粉末, 分子式为C10H8N2O2S, HR-ESI-MS m/z 221.0389 [M+H]+。1H NMR (700MHz, DMSO-d6) δH: 11.20 (1H, s, OH on C-2), 6.95 (1H, d, J= 7.5Hz, H-3), 7.32 (1H, dd, J=9.1, 8.4Hz, H-4), 7.04 (1H, dd, J=8.4, 7.7Hz, H-5), 7.59 (1H, dd, J=8.0, 1.9Hz, H-6), 8.22 (1H, s, H-4′), 7.96 (2H, s, NH2 on C-7′)。13C NMR (176MHz, DMSO-d6) δC: 116.5 (C, C-1), 155.2 (C, C-2), 119.3 (CH, C-3), 131.3 (CH, C-4), 119.3 (CH, C-5), 128.0 (CH, C-6), 162.8 (C, C-2′), 124.1 (C, C-4′), 149.1 (CH2, C-5′), 162.8 (C, C-7′)。以上数据与文献报道(Lin et al, 2017)基本一致, 化合物4鉴定为pulicatin F。
化合物5: 淡黄色固体粉末, 分子式为C10H9NO3S, HR-ESI-MS m/z 224.0386 [M+H]+, [ α ] D 20+40.8° (c 0.1, MeOH)。1H NMR (700MHz, DMSO-d6) δH: 7.65 (1H, s, OH on C-2), 7.00 (1H, dd, J=8.4, 1.1Hz, H-3), 7.50 (1H, dd, J=7.7, 7.7Hz, H-4), 6.97 (1H, dd, J=8.2, 7.5Hz, H-5), 7.47 (1H, dd, J=7.8, 1.7Hz, H-6), 3.31 (1H, d, J= 2.8Hz, H-4′a), 3.30 (1H, s, H-4′b), 3.89 (1H, d, J= 11.9Hz, H-5′), 12.38 (1H, s, OH on C-7′)。13C NMR (176MHz, DMSO-d6) δC: 115.8 (C, C-1), 158.8 (C, C-2), 117.2 (CH, C-3), 134.3 (CH, C-4), 119.7 (CH, C-5), 130.6 (CH, C-6), 173.5 (C, C-2′), 40.3 (C, C-4′), 105.8 (CH2, C-5′), 172.5 (C, C-7′)。以上数据与文献报道(Carmi et al, 1994)基本一致, 化合物5鉴定为 (+)-(S)-dihydroaeruginoic acid。

2.3 菌株GXIMD 03502中化合物的抑菌活性结果

所有化合物在150μg·片-1的给药量下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach ATCC 29213、藤黄微球菌Micrococcus luteus ATCC 49732、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 6051、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis ATCC 12228、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii ATCC 19606、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa pae15690、大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella Pneumoniae ATCC 13883的生长均无抑制作用。

2.4 菌株GXIMD 03502的生物信息学分析

2.4.1 菌株GXIMD 03502的基因组信息分析

菌株GXIMD 03502基因组DNA序列生物信息学分析发现其为线性染色体, 染色体长度为7780580bp, GC含量为72.9%, 含有6986个编码序列(coding sequence, CDS)。利用antiSMASH 7.0.0对菌株GXIMD 03502的基因组DNA序列进行生物信息学分析, 发现其基因组中有31个生物合成基因簇, 包括1个核糖体肽类基因簇, 3个Ⅲ型聚酮合酶基因簇, 2个Ⅱ型聚酮合酶基因簇, 6个萜类合酶基因簇, 3个NRPS基因簇, 2个杂合基因簇, 4个NRPS类型铁载体合酶基因簇, 1个羊毛硫肽类化合物基因簇, 详细信息见表1。
表1 菌株GXIMD 03502基因组中次级代谢产物基因簇的antiSMASH分析结果

Tab. 1 Secondary metabolite gene clusters of GXIMD 03502 identified by antiSMASH

编号 类型 大小/kb 相似基因簇 相似度/%
1 RiPP-like 10.2 informatipeptin 42
2 T3PKS 41.2 alkylresorcinol 100
3 betalactone 27.9 / /
4 Terpene 21.0 albaflavenone 100
5 Phosphonate-ladderane-Ⅰ PKS 67.2 amycomicin 87
6 Terpene 22.7 isorenieratene 62
7 indole 21.1 5-dimethylallylindole-3-acetonitrile 100
8 terpene 23.9 / /
9 NRP-metallophore 63.0 coelibactin 100
10 NRP-metallophore 58.3 scabichelin 100
11 Ⅰ PKS - Ⅲ PKS-NRPS 95.3 thiazostatin/watasemycin 100
12 T3PKS 41.1 flaviolin 100
13 melanin 10.5 istamycin 5
14 NI-siderophore 11.8 desferrioxamin B and E 83
15 T1PKS-other 60.6 macrotermycins 65
16 terpene 22.2 geosmin 100
17 NRPS 35.4 ibomycin 12
18 Ⅲ PKS 41.2 germicidin 100
19 oligosaccharide 24.9 vancomycin glucose 42
20 Ⅱ PKS 72.5 WS-5995 69
21 NI-siderophore 11.9 / /
22 terpene 26.7 hopene 100
23 lanthipeptide-class-iii 22.8 SapB 100
24 ectoine 10.4 ectoine 100
25 NRPS 25.9 paulomycin 13
26 terpene 20.9 azinomycin B 6
27 T2PKS 70.1 spore pigment 66
28 NRPS 53.2 detoxin S1 33
29 T1PKS 38.5 butyrolactol A 80
30 T1PKS-terpene 43.3 azalomycin F3a 32
31 T1PKS 14.3 ECO-0501 14

注: “/”表示未发现相似的基因簇

2.4.2 菌株GXIMD 03502中噻唑啉环类化合物生物合成基因簇的定位与分析

据文献报道(Carmi et al, 1994), 含有噻唑啉环的天然产物主要由非核糖体肽合酶组装线负责装配合成。分析菌株GXIMD 03502基因组中所包含的天然产物生物合成基因簇, 发现位于基因组中编号为11的基因簇与thiazostatin和watasemycin的生物合成基因簇高度相似(Walsh et al, 2001; Inahashi et al, 2017), 进一步利用2ndFind和BLAST软件对该区域进行深入分析, 发现该基因簇中的15个基因可能参与了pulicatins的生物合成并对其进行了基因功能注释(表2), 包括1个水杨酸合酶编码基因orf4; 2个AMP-连接酶编码基因orf1和orf8; 2个NRPS编基因orf10和orf15; 2个还原酶编码基因orf6和orf14; 1个硫酯酶编码基因orf9; 1个后修饰基因orf13, 编码自由基SAM甲基转移酶; 3个转运蛋白编码基因, 其中orf2编码Na+/H+逆转运蛋白, orf11和orf12分别编码2个ABC transporter permease/ATPase蛋白系统; 3个调控蛋白编码基因, 其中orf3编码1个AfsR家族调控因子, orf5和orf7分别编码2个TetR家族调控因子。
表2 菌株GXIMD 03502中pulicatins生物合成基因簇内各基因的功能注释

Tab. 2 Deduced function of open reading frames in the pulicatin biosynthetic gene cluster from GXIMD 03502

基因 氨基酸长度 同源蛋白 同一性/相似性/% 推测的基因功能
orf1 440 S. venezuelae ATCC10712 sven0503 (CCA53790) 77/81 AMP-ligase
orf2 421 S. venezuelae ATCC10712 sven0504 (CCA53791) 83/87 Na+/H+ antiporter
orf3 647 S. venezuelae ATCC10712 sven0505 (CCA53792) 85/88 AfsR-family regulator
orf4 455 S. venezuelae ATCC10712 sven0506 (CCA53793) 79/85 Salicylate synthase
orf5 282 S. venezuelae ATCC10712 sven0507 (CCA53794) 85/91 TetR-family regulator
orf6 390 S. venezuelae ATCC10712 sven0508 (CCA53795) 75/81 Reductase
orf7 228 S. venezuelae ATCC10712 sven0509 (CCA53796) 90/94 TetR-family regulator
orf8 532 S. venezuelae ATCC10712 sven0510 (CCA53797) 85/90 Salicyl-AMP-ligase
orf9 265 S. venezuelae ATCC10712 sven0511 (CCA53798) 74/80 Thioesterase
orf10 1517 S. venezuelae ATCC10712 sven0512 (CCA53799) 76/82 NRPS
orf11 569 S. venezuelae ATCC10712 sven0513 (CCA53800) 91/95 ABC transporter permease/ATPase
orf12 613 S. venezuelae ATCC10712 sven0514 (CCA53801) 89/93 ABC transporter permease/ATPase
orf13 534 S. venezuelae ATCC10712 sven0515 (CCA53802) 89/94 Radical SAM methyltransferase
orf14 383 S. venezuelae ATCC10712 sven0516 (CCA53803) 78/80 Reductase
orf15 1829 S. venezuelae ATCC10712 sven0517 (CCA53804) 84/89 NRPS

2.4.3 菌株GXIMD 03502来源2-羟基苯基噻唑啉类似物生物合成途径的推导

根据非核糖体肽生物合成装配的原理、菌株GXIMD 03502中2-羟基苯基噻唑啉生物合成基因簇各功能基因的分析注释结果及文献报道中watasemycins和pyochelins的生物合成过程(Carmi et al, 1994; Inahashi et al, 2017), 对菌株GXIMD 03502来源的2-羟基苯基噻唑啉类似物的生物合成过程进行了推导(图4)。
图4 菌株GXIMD 03502中2-羟基苯基噻唑啉类似物的生物合成基因簇(a)和生物合成途径(b)

a. 2-羟基苯基噻唑啉类似物的生物合成基因簇示意图; b. 2-羟基苯基噻唑啉类似物生物合成途径的推导。图中ORF4表示水杨酸合成酶(salicylate synthase); ORF8表示水杨酸腺苷连接酶(salicyl-AMP-ligase); ORF10表示非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS); OX.表示oxidation; SAM为 S-adenosylmethionine; PCP表示肽基载体蛋白结构域(peptide carrier protein domain); A表示腺苷化结构域(adenylation domain); C表示缩合结构域(condensation domain)

Fig. 4 The biosynthetic gene cluster (a) and the biosynthetic pathway (b) of pulicatins from GXIMD 03502

Pulicatins生物合成途径主要包括水杨酸前体的合成和非核糖体肽的装配及后修饰。起始前体的合成主要由基因orf4编码水杨酸合酶催化分支酸中4位羟基异构化产生异分支酸, 再脱去一分子的2-羟基丙酸产生水杨酸; 水杨酸在ATP的参与下, 经orf8编码的独立腺苷化结构域催化作用下活化产生腺苷化水杨酸, 腺苷化水杨酸与orf10编码的非核糖体肽合成酶N端的肽基载体蛋白结构域(peptide carrier protein domain, PCP)的磷酸泛酰巯基乙胺硫醇反应形成酶复合物,腺苷化结构域(adenylation domain, A)对L-半胱氨酸进行活化并转移至C端PCP上; 缩合结构域(condensation domain, C)催化水杨基硫酯与半胱氨酸硫酯缩合形成2-羟基苯基噻唑啉基硫酯, 经水解反应产生(+)-(S)-dihydroaeruginoic acid (5)(Ye et al, 2014; Mevers et al, 2019); 经过氨基转移酶或体内非酶催化作用, 化合物5与铵根离子反应生成(+)-(S)-pulicatin G (1); 化合物1的噻唑啉环发生氧化脱氢生成pulicatin F (4)(Carmi et al, 1994; Ye et al, 2014; Mevers et al, 2019; Kaplan et al, 2021), 同时化合物5经过两步还原反应产生aerugine (3); 推测化合物3在甲基转移酶orf13的催化作用下, 以SAM作为甲基供体, 其C-4′位发生碳甲基化反应生成pulicatin A (2)。

3 讨论与结论

2-羟基苯基噻唑啉是一类具有多种生物学活性的非核糖体肽类的细菌天然产物, 主要由二羟基苯甲酸前体合成酶和非核糖体肽合成酶共同体负责催化合成, 主要不同之处在于C-4′和C-5′位的侧链取代基团(Inahashi et al, 2017)。早期研究人员主要从鱼类致病弧菌Vibrio anguillarum 775、人类机会致病假单胞菌Pseudomonas aeruginosa以及Yersinia enteropathogenic等病原菌中分离鉴定得到3种结构类型的2-羟基苯基噻唑啉, 分别为anguibactin (Jalal et al, 1989)、pyochelin (Cox, 1982) 和yersinabactin 1 (Drechsel et al, 1995), 其在上述病原体中作为铁载体, 起到螯合金属离子的作用, 是病原体的毒力因子。近年来研究人员从放线菌中也发现了pulicatin A~G、aerugine和watasemycins A~B, 背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)原代培养试验发现aerugine和pulicatin G在DRG细胞中发挥钙离子载体的功能, 可促进钙离子内流; 深入研究发现pulicatin A、pulicatin F~G、watasemycins A~B能够与5-HT2B受体结合, 其中pulicatin A的结合能力最强, 具有开发成为预防或治疗癫痫和镇痛药物的潜力(Lin et al, 2010, 2017)。Thissera等(2020)发现的pulicatin H对真菌Penicillium citrinum 和Aspergillus niger具有显著的抑制活性, 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)值分别为25μmol·L-1和8.4μmol·L-1。Carmi等(1994)从P. fluorescens strain PFM2分离得到(+)-(S)-dihydroaeruginoic acid (5), 生物学活性分析发现其对B. subtilis、Erwinia berbicola、Stapbylococcus albus等细菌和Pythium ultimum、Fusarium oxysporum、Rbizoctonia solani等真菌分别具有中等程度的抑制活性。Kaplan等(2021)发现化合物5还可以作为铁离子螯合剂, 其在缺乏铁离子的环境下可以螯合并转运铁离子, 促进假单胞菌的生长。但在本研究中发现化合物1—5对病原指示菌均无抑制活性。
对菌株GXIMD 03502进行全基因组测序、生物信息学分析和文献比对分析, 发现其基因组中参与生产化合物1—5的生物合成基因簇与watasemycins的生物合成基因簇高度相似, 但其次级代谢产物中并未发现终产物watasemycins, 可能是基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因orf15的沉默, 导致非核糖体肽装配过程在orf10编码的非核糖体肽合成酶催化形成一个噻唑啉环后而终止, 最终不能合成终产物watasemycins (Inahashi et al, 2017)。

References

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[1]
CARMI R, CARMELI S, LEVY E, et al, 1994. (+)-(S)-dihydroaeruginoic acid, an inhibitor of Septoria tritici and other phytopathogenic fungi and bacteria, produced by Pseudomonas fluorescens[J]. Journal of Natural Products, 57(9): 1200-1205.

[2]
COX C D, 1982. Effect of pyochelin on the virulence of Pseudomonas aeruginosa[J]. Infection and Immunity, 36(1): 17-23.

[3]
DING LING, MÜNCH J, GOERLS H, et al, 2010. Xiamycin, a pentacyclic indolosesquiterpene with selective anti-HIV activity from a bacterial mangrove endophyte[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20(22): 6685-6687.

[4]
DRECHSEL H, STEPHAN H, LOTZ R, et al, 1995. Structure elucidation of Yersiniabactin, a siderophore from highly virulent Yersinia strains[J]. Liebigs Annalen, 1995(10): 1727-1733.

[5]
FU PENG, YANG CHUNLI, WANG YI, et al, 2012. Streptocarbazoles A and B, two novel indolocarbazoles from the marine-derived actinomycete strain Streptomyces sp. FMA[J]. Organic Letters, 14(9): 2422-2425.

[6]
HAN YING, TIAN ERLI, XU DONGBO, et al, 2016. Halichoblelide D, a new elaiophylin derivative with potent cytotoxic activity from mangrove-derived Streptomyces sp. 219807[J]. Molecules, 21(8): 970.

[7]
INAHASHI Y, ZHOU SHANSHAN, BIBB M J, et al, 2017. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue[J]. Chemical Science, 8(4): 2823-2831.

[8]
JALAL M A F, HOSSAIN M B, VAN DER HELM D, et al, 1989. Structure of anguibactin, a unique plasmid-related bacterial siderophore from the fish pathogen Vibrio anguillarum[J]. Journal of the American Chemical Society, 111(1): 292-296.

[9]
KAPLAN A R, MUSAEV D G, WUEST W M, 2021. Pyochelin biosynthetic metabolites bind iron and promote growth in Pseudomonads demonstrating siderophore-like activity[J]. ACS Infectious Diseases, 7(3): 544-551.

[10]
KIESER T, BIBB M J, BUTTNER M J, et al, 2000. Practical Streptomyces genetics: a laboratory manual[M]. Norwich: John Innes Foundation: 125-127.

[11]
LIN ZHENJIAN, ANTEMANO R R, HUGHEN R W, et al, 2010. Pulicatins A-E, neuroactive thiazoline metabolites from cone snail-associated bacteria[J]. Journal of Natural Products, 73(11): 1922-1926.

DOI PMID

[12]
LIN ZHENJIAN, SMITH M D, CONCEPCION G P, et al, 2017. Modulating the serotonin receptor spectrum of Pulicatin natural products[J]. Journal of Natural Products, 80(8): 2360-2370.

DOI PMID

[13]
LU CHUNJU, LIANG LIFEN, ZHANG GENGSI, et al, 2024. Carneusones A-F, benzophenone derivatives from sponge-derived fungus Aspergillus carneus GXIMD00543[J]. Marine Drugs, 22(2): 63.

[14]
MEVERS E, SAURÍ J, HELFRICH E J N, et al, 2019. Pyonitrins A-D: chimeric natural products produced by Pseudomonas protegens[J]. Journal of the American Chemical Society, 141(43): 17098-17101.

[15]
SANGKANU S, RUKACHAISIRIKUL V, SURIYACHADKUN C, et al, 2017. Evaluation of antibacterial potential of mangrove sediment-derived actinomycetes[J]. Microbial Pathogenesis, 112: 303-312.

DOI PMID

[16]
THISSERA B, ALHADRAMI H A, HASSAN M H A, et al, 2020. Induction of cryptic antifungal Pulicatin derivatives from Pantoea agglomerans by microbial co-culture[J]. Biomolecules, 10(2): 268.

[17]
WALSH C T, CHEN HUAWEI, KEATING T A, et al, 2001. Tailoring enzymes that modify nonribosomal peptides during and after chain elongation on NRPS assembly lines[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 5(5): 525-534.

PMID

[18]
XU DONGBO, TIAN ERLI, KONG FANDOG, et al, 2020. Bioactive molecules from mangrove Streptomyces qinglanensis 172205[J]. Marine Drugs, 18(5): 255.

[19]
YE LUMENG, CORNELIS P, GUILLEMYN K, et al, 2014. Structure revision of N-mercapto-4-formylcarbostyril produced by Pseudomonas fluorescens G308 to 2-(2-hydroxyphenyl)thiazole-4-carbaldehyde [aeruginaldehyde][J]. Natural Product Communications, 9(6): 789-794.

[20]
ZHANG LI, LI LEI, DENG ZIXIN, et al, 2015. Micromonospora zhanjiangensis sp. nov, isolated from mangrove forest soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 65(12): 4880-4885.

[21]
ZUNNUNDZHANOV A, BESSONOVA I A, ABDULLAEV N D, et al, 1987. Structure of aerugine from Pseudomonas aeruginosa[J]. Chemistry of Natural Compounds, 23(4): 461-465.

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